龔 強， 丁 利， 肖家勇， 吳新華， 成 婧，朱紹華， 焦艷娜， 付善良， 王利兵*

（1.湖南出入境檢驗檢疫局 檢驗檢疫技術中心，食品安全科學技術湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學食品科學與工程學院，湖南 長沙410004）

雙酚-二環(huán)氧甘油醚類物質作為合成環(huán)氧樹脂原料且具有清除氯酸作用，常用作為嬰兒奶瓶、食品罐頭等多種食品接觸材料的內涂層[1-2]。這類容器在使用過程中，雙酚類物質殘留會向食品中遷移，與食品接觸后形成水合物、氯代物等衍生物而造成污染[3-5]。環(huán)境毒理學將這類物質稱為環(huán)境激素，又稱“外因性內分泌干擾物”。有研究報道，微量甚至痕量的雙酚A及其環(huán)氧化合物，即可能對動物生理狀況、生殖系統(tǒng)以及胎兒發(fā)育造成不良影響[6-8]。鑒于其對健康的危害，檢測接觸食品中其遷移含量，為預防其危害有著重要意義。目前，對于食品接觸材料中有毒有害物質的遷移量測定一般采用食品模擬物，但對于實際樣品來說，樣品基質復雜，前處理更復雜，有毒有害物質的痕量遷移量的測定具有一定挑戰(zhàn)性。

石墨烯作為一種新型的碳納米材料，因為其獨特而又嚴密的二維結構，近來被廣泛關注。石墨烯具有比碳納米管更大的比表面積，而且石墨烯的制備更為簡單，且不受金屬離子的污染。近年來，石墨烯作為比碳納米管更優(yōu)異的吸附劑而廣泛用于SPE等分離領域，Liu等人以石墨烯負載硅膠固相萃取環(huán)境樣品中氯酚，同時進一步利用石墨烯包覆磁性材料富集生物大分子以及環(huán)境樣品中多溴聯(lián)苯醚[9-12]；Dong等人采用石墨烯基質分散萃取了生物樣品中的小分子[13]。

作者在課題組前期工作的基礎上，采用石墨烯填充固相萃取柱，高效液相色譜-串聯(lián)質譜測定，以實際樣品為基質，測定不同生產日期的同類基質以及不同基質中的雙酚-二環(huán)氧甘油醚的遷移量，方法簡單、靈敏、快速。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

API 4000 Q TRAP質譜儀，美國應用生物系統(tǒng)公司制造；多功能微量化樣品處理儀，長沙中訊電子工程研究所制造；固相萃取儀，美國Supelco公司制造；高速離心機，德國Sigma公司制造；KQ-250E超聲波振蕩器，美國進口。

甲醇、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙腈，均為色譜純，德國Merck公司產品；乙酸、乙酸銨，為分析純，北京化工廠產品；水為超純水，以美國Millipore超純水儀制備。

石墨烯（直徑 0.5～2 μm，厚度～0.8 nm），南京先鋒納米公司產品；雙酚-二環(huán)氧甘油醚標準品：雙酚A 二縮水甘油醚（BADGE），雙酚 A（2，3-二羥基丙基）縮水甘油醚（BADGE·H2O），雙酚 A（3-氯-2-羥丙基）縮水甘油醚（BADGE·HCl），雙酚 A-雙（2，3-二羥丙基）醚（BADGE·2H2O），雙酚 A 二（3-氯-2-羥丙基）醚（BADGE·2HCl），雙酚 A（3-氯-2-羥丙基）（2，3-二羥基丙基）醚（BADGE·H2O·HCl），雙酚F 二縮水甘油醚（BFDGE），雙酚 F-雙（2，3-二羥丙基）醚（BFDGE·2H2O），雙酚 F 雙（3-氯-2-羥丙基）醚（BFDGE·2HCl），純度均≥95%，Sigma-Aldrich 公司產品；八寶粥、魚肉、橘片罐頭和牛肉等罐頭食品，購于長沙超市。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取9種雙酚-環(huán)氧甘油醚標準品各10.0 mg，用甲醇溶解，配成1.0 mg/mL的標準儲備溶液。分別取標準儲備液，用甲醇定容配成100 μg/mL的中間標準溶液。上述溶液均4℃冷藏避光儲存。取適量儲備液，用甲醇稀釋配成溶度為1.0 μg/mL的標準工作液。

1.3 石墨烯固相萃取小柱的制備

采用商品化空的3 mL的固相萃取小柱，用墊圈封住小柱底部，稱取20 mg石墨烯置于固相萃取柱中，用墊圈封住小柱頂部并壓緊，使其高度約為0.3 cm。使用前依次用6 mL甲醇、6 mL水活化。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 稱取5.0 g樣品于50 mL的離心管中，加入15 mL叔丁基甲醚，振蕩混勻2 min，超聲提取15 min后，以7 000 r/min離心5 min，分離上清液。下層殘渣再用15 mL叔丁基甲醚采用上述步驟重復提取一次，合并兩次提取液。將提取液氮氣吹至近干，用 6 mL 甲醇-水（體積比 50∶50）溶解，肉制品樣品采用正己烷去脂：加3 mL正己烷，振蕩混勻后棄正己烷層，凈化。

1.4.2 凈化 將提取液加到已活化石墨烯固相萃取小柱上，控制體積流量為1 mL/min，讓溶液流盡，5 mL水淋洗，棄淋洗液。用9 mL乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液，氮氣吹至近干，用體積比1∶1甲醇-水定容至1 mL，過0.45 μm濾膜，上機分析。

1.5 色譜條件和質譜條件

1.5.1 色譜條件 流動相為甲醇 （A）和5 mmol/L醋酸銨溶液（內含質量分數0.1%乙酸）（B），體積流量為0.25 mL/min；梯度（體積分數）洗脫程序為：初始時 40%B；0～10 min，45%～5%B；10～10.01 min，5%～40%B；10.01～15 min，40%B。 色譜柱為 COSMOSIL柱（150mm×2.0mm；2.5μm），柱溫30℃，進樣量10μL。

1.5.2 質譜條件 離子源：質譜離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；霧化氣（Gas1）：60.00 psi；輔助氣（Gas2）：65.00 psi；離子噴霧電壓（IS）：5 500.00 V；氣簾氣（Cur）：20.00 psi；離子化溫度（TEM）：500℃；檢測方式：多反應監(jiān)測掃描模式（MRM）。多反應監(jiān)測條件下9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量和去簇電壓見表1。

表1 多反應檢測掃描模式檢測9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的部分質譜參數Table 1 Some parameters of multiple reaction monitoring detection for 9 bisphenol diglycidyl ethers

2 結果與討論

2.1 質譜條件的優(yōu)化

采用注射泵連續(xù)進樣，將9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚標準溶液（質量濃度100 ng/mL）分別注入離子源中，正離子模式下進行母離子全掃描，選擇適當的分子離子峰。結果表明，電噴霧正離子電離模式下，9種物質全掃描的分子離子[M+NH4]+最理想。分別對9種甘油醚的母離子進行二次碎裂，得到碎片離子峰的信息，確定每個目標化合物的特征離子對后，在多反應監(jiān)測 （MRM）模式下優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）。 聯(lián)機液相色譜儀，參照本課題組吳新華[13]液相條件，流動注射分析優(yōu)化碰撞氣（CAD）、霧化氣（Gas1）、輔助氣（Gas2）、噴霧電壓（IS）、氣簾氣（CUR）、離子化溫度（TEM）等質譜參數。優(yōu)化好9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的MRM色譜圖，見圖1。

圖1 9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的多反應監(jiān)測（MRM）色譜圖（100 ng/mL）Fig.1 Chromatograms of 9 bisphenol diglycidyl ethers in MRM mode（100 ng/mL）

2.2 石墨烯用量的選擇

石墨烯表面積非常大 （理論值為2630 m2/g）[9]，有著很強的吸附能力，因此適當選擇固相萃取中石墨烯的用量對實驗極為關鍵。Liu等采用20 mg石墨烯作為固相萃取填料，對氯酚類物質進行分析，獲得了較好的回收率[12]。本文作者選擇了5、10、20、40、60、80 mg石墨烯，對空白樣品進行加標回收分析，9種甘油醚的加標量均為10.0 μg/kg。石墨烯用量低于20 mg時，9種環(huán)氧甘油醚的回收率隨著石墨烯的增加而增大；用量在20～40 mg之間時，回收率變化不大；當用量大于40 mg時，回收率隨著石墨烯增加反而有所降低（見圖2）。因此，本實驗選擇20 mg石墨烯作為固相萃取填料用量。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

參照本課題組吳新華文獻[14]，本實驗分別比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯和叔丁基甲醚作為提取溶劑對9種環(huán)氧甘油醚提取效率的影響 （見圖3）。9種甘油醚的加標量均為10 μg/kg，實驗結果表明：不同的提取溶劑對9種甘油醚的回收率差異較大。其中甲醇、乙腈提取回收率較低，9種甘油醚的回收率在34.6%～70.7%之間。叔丁基甲醚對9種甘油醚的回收率在63.7%～101.9%，綜合分析較其他3種試劑提取回收率好。因此，本實驗選擇叔丁基甲醚作為提取溶劑。

圖2 石墨烯用量對9種環(huán)氧甘油醚回收率的影響Fig.2 Effect of graphene on the recoveries of 9 bisphenol diglycidyl ethers

2.4 洗脫溶劑的選擇

經石墨烯吸附后，洗脫效率是回收率的保證。實驗過程中分別比較了乙腈、堿性甲醇（含體積分數5%氨水）、叔丁基甲醚和乙酸乙酯作為洗脫溶劑對9種環(huán)氧甘油醚洗脫效率的影響（見圖4）。9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的加標量均為10.0 μg/kg，實驗結果表明：不同的洗脫溶劑對9種甘油醚的回收率差異較大。其中乙腈的洗脫回收率較低，9種甘油醚的回收率在40.1%～71.9%之間。堿性甲醇對BADGE的回收率為58.2%；對BFDGE的回收率為50.4%；對其他幾種甘油醚的回收率在77.3%～86.5%之間。叔丁基甲醚對BADGE、BFDGE及BFDGE·2HCl的回收率較低，分別為52.6%、52.7%和65.4%。乙酸乙酯對9種甘油醚的回收率在65.7%～107.9%之間，洗脫回收率高于其他3種溶劑。因此，本實驗選擇乙酸乙酯作為洗脫溶劑。

2.5 方法的線性范圍與檢測限

圖3 不同溶劑提取罐頭食品中雙酚-二環(huán)氧甘油醚的回收率Fig.3 Recoveries of bisphenol diglycidyl ethers in the canned foodstuffs by different extraction solvent

圖4 不同溶劑洗脫罐頭食品中雙酚-二環(huán)氧甘油醚的回收率Fig.4 Recoveries of bisphenol diglycidyl ethers in the canned foodstuffs by different elution solvent

在上述優(yōu)化的實驗條件下，用空白基質溶液配制一系列雙酚-二環(huán)氧甘油醚質量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL 的混合標準工作溶液，進行添加實驗分析。結果表明9種環(huán)氧甘油醚的質量濃度x（ng/mL）和峰面積y之間均有良好的線性關系，相關系數在0.992 2～0.999 6之間（見表 2）；其中 BADGE·2H2O、BFDGE·2HCl的線性范圍為 0.5～50.0 ng/mL；BADGE·2HCl和BFDGE·2H2O的線性范圍為5.0～100.0 ng/mL；其他5種的線性范圍為2.0～100.0 ng/mL。 分析物最低檢測限（LOQ）根據其響應值大于或等于基線響應值的3倍（S/N≥3）且準確度和精密度RSD＜20%來確定。采用實際樣品添加法進行分析，確定方法的最低定量檢測限，見表2。

2.6 方法的回收率與精密度

采用5 g不同罐頭基質，分別按低（線性低限）、中、高3個濃度進行9種環(huán)氧甘油醚標準混合溶液的添加回收分析。每個加標濃度水平平行測定6份樣品，計算平均回收率及相對標準偏差，見表3。9種環(huán)氧甘油醚在橘片罐頭樣品中的平均添加回收率為65.4%～111.3%，肉類罐頭中的平均添加回收率為60.0%～97.6%。相對標準偏差均小于20%，方法重復性較好。

2.7 實際樣品的測定

用本法對不同種類及不同生產日期的同類罐頭作實樣測定，對陽性樣品多重測定，結果表明靈敏度高、重復性好。圖5為實樣MRM色譜圖。

表2 9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的回歸方程、線性范圍、相關系數和檢測限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients and LODs of 9 bisphenol diglycidyl ethers

表3 不同罐頭樣品中9種環(huán)氧甘油醚添加平均回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard detiation（RSDs） of 9 bisphenol diglycidyl ethers in can food（n=6）

圖5 實際樣品MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of real samples

魚罐頭樣品檢出 220.0 μg/kg的 BADGE·HCl和 139.0 μg/kg 的 BADGE·H2O·HCl； 牛肉罐頭樣品檢 出 222.0 μg/kg 的 BADGE·HCl，47.2 μg/kg 的BADGE·H2O和49.2μg/kg 的 BADGE·H2O·HCl。

3 結語

通過優(yōu)化改進樣品前處理條件，以實際樣品為檢測對象，建立了罐頭食品接觸材料中9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚遷移量的石墨烯固相萃取凈化HPLC-MS/MS檢測方法。該方法操作簡單，靈敏度高，使用石墨烯作為固相萃取柱回收率高、重復性好，為食品接觸材料中內分泌干擾物的遷移動力學研究提供了檢測技術基礎，對食品安全有著重要的意義。

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