郭會林， 秦玉梅， 蔡雯雯， 查麗玲， 袁飛飛， 鄧少平

（浙江工商大學 食品與生物工程學院，浙江 杭州 310012）

近年來，伴隨著科技發(fā)展和生活水平的提高，人類飲食結構也發(fā)生了巨大變化，高糖高脂食物在人類食物結構中所占的比例越來越大。這種飲食結構的改變致使嚴重威脅人類健康的糖尿病、肥胖等代謝紊亂問題變得日益普遍和嚴重。據(jù)報道，目前全世界超過1.5億人患有糖尿病，預計到2015年全球糖尿病患者將增加30%，到2025年將增加一倍達到3億人[1]。因此肥胖、糖尿病等代謝相關疾病的解決日益引起各領域科學家的關注。而咖啡因是從茶葉、咖啡果等天然植物中提取出來的一種甲基黃嘌呤類生物堿，是咖啡、茶葉、軟飲料、食物及一些藥物的重要組成或添加成分[2-4]。飲料中的咖啡因能夠在攝入后快速并完全被胃腸道所吸收且在30～60 min內在血清中達到峰值[5]。動物學研究表明，在高糖和高脂膳食的情況下咖啡因具有降低血糖和抑制內臟脂肪組織增加的作用[6]，因此常被用來控制糖尿病和控制體質量增加等代謝相關疾病。眾所周知，能量代謝相關疾病的產(chǎn)生是能量儲存平衡被打破的結果，因此糖尿病、肥胖等疾病的發(fā)病原因除了能量消耗之外還與能量的攝入和消化吸收息息相關。然而，研究者對咖啡因在控制糖尿病和調節(jié)體質量作用機理的研究主要集中在其促進脂肪分解、增加機體產(chǎn)熱這一能量消耗方面[7-8]，而對咖啡因在能量攝入和能量消化吸收方面的影響作用研究較少。味覺系統(tǒng)作為動物食物攝取與拒絕的決定性因素，在動物食物選擇和攝入方面發(fā)揮著極其重要的作用。作者所在實驗室前期研究結果表明，咖啡因長期攝入可以通過影響口腔中味覺感受系統(tǒng)來調節(jié)機體對食物的攝入[9]。近年來，隨著對味覺感受系統(tǒng)研究的深入，越來越多的研究表明各種甜味受體[10-12]和甜味傳導信號分子[13-14]不僅局限于口腔中而且存在于胃腸道[15-16]，且胃腸道中的甜味感受與葡萄糖的代謝平衡相關。因此，作者在實驗室前期研究結果的基礎上提出新的假設：咖啡因長期暴露除了影響口腔中的味覺感受系統(tǒng)，從而影響食物的攝入之外，還可能會通過影響腸道中的甜味感受系統(tǒng)來影響葡萄糖的代謝平衡。本研究中以ICR小鼠為動物模型，采用實體顯微鏡觀察、Westernblotting、Elisa、試紙條血糖測定等方法，探究了咖啡因長期暴露對成年小鼠腸道甜味感受通路所介導的血糖代謝平衡的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周大ICR雄性小鼠 （購自浙江省動物醫(yī)學科學院）飼養(yǎng)于動物房小鼠籠中。動物房溫度控制在（23±2）℃，濕度控制在50%，室內照明按照白天 12 h（8：00—20：00）夜晚 12 h（20：00—8：00）日夜循環(huán)交替輪回。整個實驗過程，小鼠自由飲水和攝取標準小鼠育成飼料（購自浙江省動物醫(yī)學科學院），符合國家實驗動物飼養(yǎng)和使用規(guī)定。

1.1.2 試劑 將300 mg的咖啡因 （購自于生工生物工程（上海）有限公司）溶解于去離子水中，配制成最終質量濃度為300 mg/L的咖啡因溶液。小鼠暴露溶液保持在室溫，且每2 d更換一次新鮮配制的溶液。

1.2 試驗方法

1.2.1 慢性咖啡因暴露 6周大雄性ICR小鼠根據(jù)體質量隨機分為對照組和咖啡因暴露組。咖啡因暴露組小鼠以300 mg/L的咖啡因溶液作為唯一溶液來源，而空白組小鼠以水作為唯一溶液來源，分別進行21 d慢性長期刺激。

1.2.2 小腸絨毛形態(tài)觀察

21 d刺激完成之后，小鼠12 h禁食，氮氣致死。根據(jù)標準解剖學方法，將小鼠小腸取出。取十二指腸、空腸、回腸各1.5 cm左右浸入質量分數(shù)4%的多聚甲醛溶液中，立即將小腸縱向剖開展平，室溫下在多聚甲醛溶液中固定2 h。固定完成之后用PBS緩沖液（pH 7.2±0.1）清洗各段小腸組織，每次清洗5 min。最后，將清洗好的小腸組織浸入到質量分數(shù)30%蔗糖溶液中4℃過夜并保存。

將小腸組織從質量分數(shù)30%的蔗糖溶液中取出，切取5 cm左右的小腸組織置于加有冰凍切片包埋劑的樣品盤中進行包埋處理。之后將包埋有小腸組織的樣品盤安裝到樣品臺上進行冰凍切片，切片厚度為15 μm，連續(xù)收集60張左右的切片置于涂有粘片劑的載玻片上。將切好的組織切片進行HE染色，之后用中性樹膠封片。用實體顯微鏡軟件測定小腸絨毛長度和隱窩深度，記錄實驗結果。

1.2.3 小腸組織甜味受體蛋白質和信號分子表達量測定 小鼠禁食12 h后氮氣致死，按照標準解剖方法解剖出小鼠完整小腸。取出小鼠十二指腸、空腸和回腸各1～2 cm，稱質量，然后按照每20 mg組織加入200 μL蛋白裂解液（購自碧云天公司）的比例勻漿提取各段小腸組織的全蛋白質。充分裂解后，勻漿在4℃條件下13 000g離心5 min，取上清液。對所提取蛋白質進行SDS-PAGE分離目的蛋白質，將目的蛋白質在60 V轉膜2 h的條件下轉移到聚偏二氟乙烯膜（購自BIO-RAD公司）。分別對各目的蛋白質孵育其對應的一抗和用辣根過氧化物酶標記的相應二抗，然后參考說明用化學發(fā)光試劑（購自BIO-RAD公司）對各目的蛋白質進行顯色獲取目的蛋白質條帶。用Image J軟件測定目的蛋白質的表達量并利用β-actin的表達水平對各目的蛋白質進行歸一化處理。

1.2.4 GLP-1及Insulin濃度測定 小鼠禁食12 h后，對小鼠進行葡萄糖溶液灌胃，每千克體質量葡萄糖灌胃量為5 g/kg。在灌胃前0 min，灌胃后10、20、40、120 min對小鼠進行眼眶后靜脈叢取血，血液收集后4℃下2 000～3 000g離心15 min，取上清液保存于-70℃?zhèn)溆?。最后，用ELISA試劑盒（購自Millipore公司）對上清液中的GLP-1和Insulin進行檢測，具體方法參考試劑盒說明書。

1.2.5 血糖耐受性測定 小鼠禁食12 h后，對小鼠進行葡萄糖灌胃，每千克體質量葡萄糖灌胃量為2g/kg，之后進行血糖測定。測定時間點設為灌胃前0 min，灌胃后 15、30、45、60、90、120 min。 取血方式采用尾靜脈取血，測定方式采用血糖測定儀對血糖進行測定。

1.2.6 小鼠體質量測定 在暴露的開始（即暴露第0天）及暴露過程中每隔4 d記錄小鼠體質量。暴露完成之后計算空白組及咖啡因組小鼠體質量的增加量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

使用Oringin 8.5對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，統(tǒng)計結果采用平均值±標準偏差（Mean±SEM）的方式表示?？瞻捉M和咖啡因暴露組之間的差異采用ANVOA分析，顯著性差異定義為P＜0.05。

2 結果與分析

2.1 咖啡因暴露對小腸絨毛形態(tài)的影響

如圖1所示，無論空白組還是實驗組小鼠，在不同小腸區(qū)段小腸絨毛的高度不同，從十二指腸、空腸到回腸小腸絨毛高度依次降低。

與空白組相比，小鼠經(jīng)過咖啡因長期暴露之后，十二指腸、空腸和回腸的小腸絨毛高度都有所增加，且不同區(qū)段高度增加的程度不同。其中十二指腸和空腸小腸絨毛高度的增加都達到了顯著的水平，而回腸小腸絨毛高度有所增加但并未達到顯著水平。

與小腸絨毛高度區(qū)段變化不同，無論空白組還是實驗組小鼠，小腸的隱窩深度都是在十二指腸的部位最深，回腸次之，空腸最淺。與空白組小鼠相比，小鼠經(jīng)過咖啡因暴露之后隱窩深度都有所降低，且這種變化在十二指腸和回腸中都達到了顯著水平，但是在空腸中并未達到顯著水平。

由于咖啡因暴露對小鼠小腸絨毛高度和隱窩深度的綜合作用的結果，導致小腸各區(qū)段的絨腺比都有所增加，且在十二指腸、空腸和回腸區(qū)段都達到極其顯著的水平。

2.2 咖啡因暴露對小腸內甜味感受蛋白質表達的影響

咖啡因暴露之后，小鼠腸道內各種甜味感受相關蛋白質的表達情況各不相同。

由圖2可知，咖啡因長期暴露之后，小鼠十二指腸內甜味受體蛋白質T1R2、T1R3的表達量都有所增加，且T1R2表達量的增加達到了顯著水平。甜味信號轉導因子α-gutsducin、SNAP25的表達量都有所降低，其中α-gutsducin表達豐度的降低達到顯著水平。

與十二指腸中各甜味感受蛋白質的變化情況相似，小鼠經(jīng)過咖啡因長期暴露之后，甜味受體蛋白質T1R2、T1R3在空腸中的表達量都有所增加，且兩者都達到顯著水平。而甜味信號轉導因子αgutsducin、SNAP25的表達量都有所降低，但降低程度并不顯著。

在回腸中，咖啡因暴露組小鼠的甜味受體蛋白質T1R2、T1R3和味覺信號分子SNAP25的表達量都有所增加，且T1R3表達量的增加達到顯著水平，而α-gutsducin的表達量有所降低但并不顯著。

圖1 咖啡因長期暴露對小鼠小腸不同部位絨毛形態(tài)的影響Fig.1 Effects of long-term caffeine exposure on intestinal villus morphology in different intestinal segments of mice

圖2 咖啡因暴露對小鼠腸道中甜味感受相關蛋白質表達的影響Fig.2 Modification ofsweettaste related protein expression in the intestines of mice after chronic caffeine exposure

2.3 咖啡因長期暴露對腸道激素GLP-1、胰島素分泌的影響

對小鼠進行葡萄糖灌胃之后，咖啡因暴露組小鼠能對葡萄糖的攝入做出更加迅速和強烈的反應。由圖3可知，葡萄糖灌胃之后，咖啡因組小鼠血漿中的促胰島素分泌激素GLP-1迅速升高，在10 min后達到峰值，然后緩慢下降并趨于穩(wěn)定。而對照組小鼠在灌胃之后血漿中的GLP-1濃度上升比較緩慢，在20 min后才達到峰值，且峰值水平低于咖啡因暴露組小鼠，之后緩慢下降趨于穩(wěn)定。對整個過程而言，咖啡因暴露組小鼠血漿中的GLP-1濃度普遍高于空白組小鼠，在灌胃操作10 min后達到顯著水平，且在2 h之后咖啡因暴露組小鼠血漿GLP-1濃度仍然顯著高于空白組。

圖3 咖啡因長期暴露對小鼠胰島素、GLP-1釋放的影響Fig.3 Effects of caffeine long-term exposure on insulin and GLP-1 secretion of the mice

與GLP-1的響應相同，灌胃之后，咖啡因暴露組小鼠表現(xiàn)出更敏感的胰島素分泌反應。葡萄糖灌胃之后，空白組和咖啡因暴露組小鼠血漿中的胰島素質量濃度迅速升高，都在10 min后達到峰值，之后緩慢下降并趨于穩(wěn)定。但是，咖啡因暴露組小鼠灌胃10 min后血漿胰島素峰值質量濃度高于空白組，且之后下降比較迅速，在20 min之后下降到低于空白組，并在灌胃后20 min到2 h的時間段內始終低于空白組。

2.4 咖啡因長期暴露對血糖代謝的影響

葡萄糖灌胃后，血漿葡萄糖耐受性檢測結果如圖4所示，咖啡因長期暴露可以增強小鼠對葡萄糖的耐受性。灌胃之后，咖啡因組和空白組小鼠血漿葡萄糖變化趨勢相似，均在30 min內濃度上升并達到峰值，之后緩慢下降并在2 h后趨于平衡狀態(tài)。然而，在整個變化過程中，咖啡因組小鼠血漿葡萄糖濃度始終低于空白組小鼠，并且在峰值處飽和隨后下降的過程中顯著低于空白組。

圖4 咖啡因暴露對小鼠血糖耐受性的影響Fig.4 Effects of chronic caffeine exposure on blood glucose with OGTT

2.5 咖啡因長期暴露對小鼠體質量的影響

咖啡因對小鼠體質量的影響如圖5所示。從圖5（a）中可以看出，暴露過程中咖啡因組小鼠體質量始終低于空白組小鼠，且在暴露的第4、8、12天達到了顯著水平。圖5（b）表明，21 d暴露之后，咖啡因組小鼠的體質量增加量低于空白組小鼠，盡管并未達到顯著水平。

圖5 咖啡因暴露對小鼠體質量的影響Fig.5 Effects caffeine exposure on bodyweight of mice

3 討論

肥胖及肥胖相關疾病，如高血壓、高膽固醇、糖尿病等，與人類健康息息相關。近年來伴隨肥胖疾病的日益增多，從天然產(chǎn)物中尋找具有減肥作用的活性物質成為人們關注的焦點?？Х纫蚴悄壳捌毡檎J為具有明顯減肥作用的并已廣泛應用于飲料中的活性物質。研究結果證明，咖啡因在控制體質量和糖尿病方面的作用是由于其對腺苷受體的抑制作用，因為成熟脂肪組織中含有腺苷受體A1，這種受體可以抑制脂肪分解，咖啡因則通過抑制腺苷受體A1的活性來達到促進脂肪分解的作用[7-8]。但研究者對其減肥機理的研究尚不充分，僅僅是局限于其對能量的消耗方面。然而除了增加能量消耗的作用之外，作者所在實驗室前期研究結果證實，長期攝入咖啡因能夠通過影響口腔中的味覺感受系統(tǒng)來影響機體對味覺物質的敏感程度和偏好程度，進而會影響機體對能量的攝入[9]。近年來隨研究的深入越來越多地發(fā)現(xiàn)，同口腔味覺感受相似，在腸道中同樣存在能夠感受味覺的內分泌細胞，被稱為味覺樣細胞，在腸道中同樣發(fā)揮著味覺感知和調節(jié)能量代謝平衡的功能[10-11，15-18]。

腸道是動物主要的消化吸收器官，而腸道中小腸絨毛是吸收營養(yǎng)物質的關鍵部位。小腸絨毛內有大量毛細血管，小腸絨毛壁和毛細血管壁很薄，都只是由一層上皮細胞構成，這種結構特點使得營養(yǎng)物質很容易被吸收進入血液。如上所述，在腸道同樣存在味覺感受，腸道味覺樣細胞的表面表達有甜味受體及甜味信號轉導分子，腸道就是通過這種甜味感受來感知營養(yǎng)物質的進入并使機體做出相應的代謝吸收反應。Sutherland等人的研究結果表明，甜味感受相關蛋白質主要表達于小腸絨毛的中間和頂端部位[19]，因此小腸絨毛形態(tài)的改變必然會影響到甜味感受相關蛋白質的表達。本研究結果顯示，長期的咖啡因暴露增加了小腸絨毛的長度，降低了隱窩的深度，綜合結果就是增加了小鼠小腸絨毛的絨腺比，即增加了小腸絨毛中間和頂端部位所占的比例。因此，可以說明用咖啡因對小鼠進行長期慢性暴露之后可以通過改變小腸絨毛的形態(tài)來影響腸道中甜味受體的表達，進而影響到腸道的甜味感受。

甜味受體蛋白質T1R2和T1R3屬于C型G蛋白質偶聯(lián)受體（GPCRs）第3亞種T1Rs家族的兩個成員。T1R2和T1R3共表達形成的異質二聚體是人工甜味劑的功能性受體和糖類甜味劑的高親和力受體[20-21]，而T1R3單獨表達形成的同源二聚體是糖類甜味劑的低親和力受體[21-22]。甜味感受的產(chǎn)生則起始于甜味物質與甜味受體蛋白質的結合。Damak及Zhao等人利用基因敲出的手段證實Tas1r2和Tas1r3基因缺失小鼠對各種甜味劑的行為學和神經(jīng)學反應表現(xiàn)出了顯著的降低，而Tas1r2/Tas1r3雙基因敲除小鼠對甜味劑的味覺完全消失了，從而證實了甜味受體T1R2/T1R3在甜味感受中的重要作用[22-23]。甜味感受信號的產(chǎn)生依賴于甜味物質與甜味受體的結合，而產(chǎn)生的甜味信號傳遞到大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)的過程則需要下游味覺轉導信號分子的參與。α-gustducin是味覺受體G蛋白質的α亞基，是一種重要的味覺信號分子，參與甜味、苦味和鮮味的味覺傳導。α-gustducin敲除鼠對苦味化合物的厭惡感明顯減弱，對甜味物質、鮮味物質和苦味物質的反應性均顯著降低[24-25]。SNAP25是一種分子量為25 kDa的與突觸前膜相關的特定神經(jīng)元蛋白質，存在于軸突和軸突末端[26-27]，參與神經(jīng)遞質釋放過程中的膜融合和胞吐作用[28]，對甜味感受信號傳遞過程中神經(jīng)遞質的釋放具有調節(jié)作用。在本研究中，咖啡因長期暴露增加了甜味受體蛋白質T1R2和T1R3在腸道中的表達，這一作用可能會增強腸道甜味感受能力進而促進機體對攝入的甜味物質做出更加強烈的反應。然而，咖啡因暴露之后卻降低了甜味信號轉導因子a-gustducin在腸道中的表達，a-gustducin作為甜味感受的下游信號轉導分子，這一作用理論上會降低小鼠甜味感受能力，與上述咖啡因對甜味受體表達量上調的作用相反。然而，a-gustducin作為味覺感受信號分子除了在甜味感受中發(fā)揮作用之外，在苦味和鮮味感受同樣發(fā)揮傳遞味覺感受的作用，因此咖啡因對味覺信號分子a-gustducin表達水平的改變也有可能并不影響到甜味感受而是影響到苦味和鮮味感受。因此，除了通過影響甜味受體蛋白質T1R2/T1R3，咖啡因是否也可以通過影響味覺信號分子a-gustducin來影響腸道甜味感受？這有待深入探索研究。此外，與空白組相比，咖啡因組小鼠中SNAP25的表達量并無顯著變化，說明咖啡因長期暴露可能并不影響小鼠腸道中甜味感受神經(jīng)信號的傳遞。

GLP-1是腸道激素中的主要激素，它由分散于整個腸道內的分泌細胞L型細胞所分泌。動物體內存在調節(jié)GLP-1分泌的甜味受體通路，甜味物質與甜味受體結合后可以促進腸內分泌細胞分泌GLP-1。Jang 等與 Margolskee 等人[15，29]利用甜味阻斷和基因敲除的手段分別從細胞和動物兩個層面證明甜味物質通過甜味受體通路誘導L細胞分泌GLP-1，進而通過調節(jié)胰島素的分泌來調節(jié)能量攝入。腸道所分泌的GLP-1既可以通過神經(jīng)信號傳遞到大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)產(chǎn)生飽腹感，也可以通過血液循環(huán)作用于遠端靶位點胰島直接作用于胰島β細胞來影響胰島素的分泌，因此它對攝食后葡萄糖代謝平衡和食欲控制具有重要作用。本研究結果顯示，長期咖啡因刺激可以增強小鼠GLP-1和胰島素的分泌水平及分泌敏感性。另外，葡萄糖受性實驗中，咖啡因暴露組小鼠相對于空白組小鼠葡萄糖耐受性顯著有所增強，因此OGTT實驗結果也證實了上述結論?？Х纫驅w內葡萄糖動態(tài)平衡的調節(jié)最表觀的標志體現(xiàn)在體質量上，本研究結果表明，咖啡因暴露可以抑制小鼠體質量的增加，這一結果有力證實了咖啡因對小鼠體內葡萄糖動態(tài)平衡的作用。

4 結語

綜上，本實驗研究結果表明，在腸道中由甜味受體、甜味感受信號分子、飽腹感激素、胰島素和體內葡萄糖代謝共同構成一個完整的甜味感受通路，咖啡因長期暴露后小鼠腸道中的甜味受體和甜味感受信號分子的表達量、飽腹感激素和胰島素的釋放水平，以及葡萄糖耐受性均發(fā)生變化。這一結論為咖啡因在控制糖尿病和體質量方面的作用機理研究提供了新的理論依據(jù)和研究思路。然而，咖啡因本身也是一種中樞神經(jīng)刺激物，并具有苦味。因此，咖啡因對腸道中甜味感受的影響是通過其對神經(jīng)系統(tǒng)的刺激作用所產(chǎn)生？還是通過其自身苦味影響到小鼠的甜味感受而產(chǎn)生？這一問題有待進一步探索。

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