陳荊曉， 曹璐娟， 孟照敏， 劉伯政， 陳敬華

（江南大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 無錫 214122）

納米藥物傳遞系統(tǒng)因其特有的增強滲透滯留效應(yīng)（EPR effect），可提高藥物在腫瘤區(qū)域的蓄積，因而受到生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域科研人員的廣泛研究[1-2]。為提高納米藥物載體在體內(nèi)的可降解性，降低肝、腎代謝的遠期毒性，同時能夠進一步增強材料的生物活性，蛋白質(zhì)、多肽、多糖等生物大分子被用于替代傳統(tǒng)的合成型高分子材料[3-4]。利用這些天然大分子的生物學(xué)特性，可顯著改善納米粒子在體內(nèi)的分布，提高藥物傳遞的靶向性。在這之中，透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）因可特異性識別腫瘤細胞表面過度表達的CD44受體，因而被廣泛用于構(gòu)建納米靶向藥物傳遞系統(tǒng)[5]。

盡管透明質(zhì)酸可提高藥物傳遞的靶向作用，但由于人體內(nèi)存在透明質(zhì)酸酶，導(dǎo)致材料在體內(nèi)易受酶作用而降解[6]。這既會降低材料在血液中的循環(huán)時間，也有可能造成藥物的泄露而降低藥物傳遞的效率。有研究發(fā)現(xiàn)，通過連接聚乙二醇可有效抑制蛋白質(zhì)吸附，防止酶對透明質(zhì)酸的降解作用，提高其在體內(nèi)的穩(wěn)定性[7]。這主要是由于聚乙二醇可以有效抑制血漿蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)在材料表面的粘附。另外，聚乙二醇還具有一定的溫敏性能，這也為藥物載體的開發(fā)提供了新的策略[8]。

本研究中擬通過“Click”反應(yīng)連接透明質(zhì)酸和普朗尼克F127，構(gòu)建兩親性材料HA-F127，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1所示。

圖1 HA-F127的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Chemical structure of HA-F127

利用透明質(zhì)酸的親水性穩(wěn)定納米粒子，同時利用其與CD44受體的識別作用，提高對腫瘤細胞的靶向作用。另外，利用F127與聚乙二醇類似的生物惰性，提高透明質(zhì)酸納米粒子的穩(wěn)定性。由于F127為兩親性物質(zhì)，由其提供的疏水作用力可以用于包載疏水性抗腫瘤藥物，其溫敏特性還能賦予材料智能“開/關(guān)”的藥物釋放行為。期望這一納米粒子可有效實現(xiàn)抗腫瘤藥物的靶向傳遞，降低藥物的毒副作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

透明質(zhì)酸，普朗尼克F127，炔丙胺，抗壞血酸鈉，購于生工生物工程（上海）股份有限公司；疊氮化鈉，購于上海晶純生化科技股份有限公司；鹽酸阿霉素，購于浙江海正藥業(yè)公司；對甲苯磺酰氯，乙基[3-（二甲胺基）丙基]碳二亞胺鹽酸鹽（EDC），N-羥基琥珀酰亞胺（NHS），購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DMEM細胞培養(yǎng)基，噻唑藍（MTT），胎牛血清（FBS），雙抗（penicillin-streptomycin），磷酸鹽緩沖液干粉（PBS），分別從Gibco和Invitrogen公司購得；分子探針DAPI，購于Sigma-Aldrich公司；其他溶劑及試劑購于國藥集團化學(xué)試劑公司，使用前純化。人類宮頸癌細胞（HeLa）和非洲綠猴腎成纖維細胞（COS7），購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細胞資源中心。

1.2 主要儀器

FreeZone 2.5型冷凍干燥機，美國Labconco公司制造；JEM-2100型透射電子顯微鏡，日本JEOL公司制造；Avance III型核磁共振波譜儀，德國Bruker公司制造；Nano ZS型粒徑測試儀，英國Malvern公司制造；RF-5301PC型熒光分光光度計，UV-2550型紫外可見分光光度計，日本島津公司制造；DMIL LED型倒置熒光顯微鏡，德國徠卡公司制造。

1.3 實驗方法

1.3.1 單疊氮化普朗尼克 （F127-N3）的制備 將12.5 g的 F127（1 mmol）溶于 50 mL 二氯甲烷中，加入25 mL吡啶，之后在冰浴下緩慢加入285 mg（1.5 mmol）對甲苯磺酰氯，避光并在N2保護，25℃條件下反應(yīng)24 h。反應(yīng)結(jié)束后用濃鹽酸萃洗，有機層用質(zhì)量分數(shù)5%NaHCO3洗滌，然后用無水硫酸鈉干燥，無水乙醚中沉淀得F127-對甲苯磺酸酯。之后將其用新蒸的DMF溶解，加入650 mg（10 mmol）疊氮化鈉于60℃攪拌反應(yīng)，48 h后于截留分子量10 kDa的透析袋去離子水中透析2 d，冷凍干燥得產(chǎn)物F127-N3，產(chǎn)品經(jīng)凝膠滲透色譜進行檢測并提純。

1.3.2 炔基化透明質(zhì)酸 （HA-alkynyl）的制備 將190 mg（0.5 mmol雙糖單元）透明質(zhì)酸溶于100 mL去離子水中，加入 192 mg（1 mmol）EDC 及 115 mg（1 mmol）NHS。 活化 30 min 后，加入 68 μL（1 mmol）炔丙胺后繼續(xù)于室溫下反應(yīng)24 h。結(jié)束后于截留分子量10 kDa透析袋去離子水中透析2 d，冷凍干燥得產(chǎn)物HA-alkynyl。

1.3.3 F127功能化透明質(zhì)酸 （HA-F127）的制備將 600 mg（0.05 mmol）F127-N3及 90 mg（0.2 mmol）HA-alkynyl溶于去離子水中，攪拌溶解后加入7.6 mg（0.03 mmol）CuSO4·5H2O 及 50 mg（0.25 mmol）抗壞血酸鈉，于40℃，N2保護下反應(yīng)48 h。反應(yīng)結(jié)束后于截留分子量25 kDa的透析袋去離子水中透析2 d，冷凍干燥得產(chǎn)物HA-F127，產(chǎn)物經(jīng)1H NMR確認結(jié)構(gòu)。

1.3.4 HA-F127納米粒子的制備及形貌表征 根據(jù)文獻報道方法[9]，通過熒光探針法測定室溫15℃下HA-F127的臨界聚集質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL。HA-F127納米粒子的制備為直接將其溶解于水溶液中，質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL。通過粒徑儀測定納米粒子的大小，并通過透射電子顯微鏡觀測納米粒子的形貌。

1.3.5 載藥納米粒子的制備 載藥納米粒子通過透析法制備[10]。將2 mg鹽酸阿霉素溶于2 mL DMF中，加入3當量于鹽酸阿霉素的三乙胺于避光條件下攪拌過夜，之后加入3 mL溶有10 mg HA-F127的甲酰胺溶液，攪拌均勻后加入到3 500 Da透析袋中，于室溫下對去離子水透析12 h，得到載藥納米粒子，將溶液凍干，用紫外可見分光光度計于480 nm處測定阿霉素的載藥量及包封率。

1.3.6 體外藥物釋放實驗 取上述透析得到的載藥納米粒子溶液2 mL，裝入3 500 Da透析袋中，然后浸入裝有10 mL PBS（pH 7.4）的離心管中，分別于15℃及37℃條件下進行體外藥物釋放實驗，每隔一段時間取出PBS溶液，并補充10 mL新鮮的PBS至離心管。用紫外可見分光光度計于497 nm測定阿霉素的釋放情況，每組3個平行樣。

1.3.7 體外細胞毒性測試 HA-F127及載藥納米粒子的細胞毒性分別采用HeLa和COS7兩種細胞通過MTT法進行測定。將生長至對數(shù)期的兩種細胞以5×103個/孔的密度接種于96孔板，之后將HAF127和載藥納米粒子分別溶于含有體積分數(shù)10%胎牛血清的培養(yǎng)基中，配制成設(shè)定濃度梯度的溶液，然后加入到細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后吸除溶液，加入DMEM培養(yǎng)基，然后加入20 μL MTT的磷酸鹽緩沖溶液（5 mg/mL），用酶標儀測定其在570 nm處的光密度值。阿霉素作為陽性對照對比載藥納米粒子的細胞毒性，溶液中加入體積分數(shù)5%DMSO助溶。

1.3.8 納米粒子的細胞內(nèi)攝化實驗 載藥納米粒子的細胞攝入情況采用HeLa及COS7兩種細胞進行測定。首先將對數(shù)生長期的HeLa及COS7兩種細胞以2×104個/孔的密度接種在24孔板中，培養(yǎng)至貼壁后，棄去孔板中培養(yǎng)基，分別加入滅菌處理后的阿霉素及載藥HA-F127納米粒子，使DOX的終質(zhì)量濃度為2 μg/mL，之后在37℃濕潤環(huán)境下培養(yǎng)，1 h后棄去孔內(nèi)含藥培養(yǎng)基，用PBS溶液小心洗滌3次。之后，用質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛溶液固定細胞 15 min，再用藍色熒光探針 DAPI（0.2 μg/mL）對細胞核進行染色，15 min后小心移除溶液，并用PBS溶液輕輕潤洗數(shù)次以除去過量的染料。用倒置熒光顯微鏡觀測并拍照。之后，為驗證透明質(zhì)酸靶向腫瘤細胞的作用，先將HeLa細胞與0.5 mg/mL的透明質(zhì)酸溶液共培養(yǎng)2 h，之后再加入載藥納米粒子共培養(yǎng)1 h，然后用上述同樣方法觀測納米粒子的細胞內(nèi)攝行為。

2 結(jié)果與分析

2.1 HA-F127的合成及結(jié)構(gòu)表征

首先制備單疊氮化F127，之后在透明質(zhì)酸分子上引入炔基，通過經(jīng)典的“Click”化學(xué)反應(yīng)連接F127和透明質(zhì)酸分子，制備得到具有兩親性的材料HAF127，其化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。通過1H NMR對產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)及F127的接枝率進行表征，結(jié)果如圖2所示。

圖2 HA-F127在D2O中的1H NMR譜圖Fig.2 1H NMR spectrum of HA-F127 in D2O

從核磁譜圖中可以看出，除透明質(zhì)酸糖環(huán)上氫在2～5 ppm的峰以外，在1.15 ppm處出現(xiàn)了F127上烷基上氫的峰，同時在8.17 ppm處出現(xiàn)了五元氮雜環(huán)上氫的峰，這說明F127已通過“Click”反應(yīng)與HA分子連接起來。通過將8.17 ppm處峰面積積分與2.01 ppm處透明質(zhì)酸N-乙酰氨基葡萄糖上甲基氫峰面積積分相比較，可以計算出F127的接枝率為0.13，即每百個透明質(zhì)酸雙糖單元上連接有13個F127分子。

2.2 HA-F127納米粒子的形貌

由于HA-F127分子具有兩親性，因而其在水溶液中具有一定的自組裝能力。以芘為熒光探針，測定材料HA-F127的臨界聚集質(zhì)量濃度為0.07 mg/mL，之后在制備HA-F127納米粒子時，溶液質(zhì)量濃度均高于此值，采用0.1 mg/mL。HA-F127納米粒子的形貌通過透射電子顯微鏡進行觀測，結(jié)果如圖3所示。從圖3可以看出，在15℃時，納米粒子的粒徑約為200 nm；而當溫度升高至37℃時，納米粒子的粒徑約為60 nm。納米粒子為形貌規(guī)整、大小均一的完整球形結(jié)構(gòu)。這一粒徑變化行為主要是由于F127分子鏈段兩端含有親水的聚乙二醇（PEG）單元，而中間為疏水的聚丙二醇（PPG）單元。當溫度升高以后，PEG與水分子之間的氫鍵被破壞，其轉(zhuǎn)變?yōu)槭杷枣湺?。此時，材料的親疏水比發(fā)生變化，由于疏水性增強，材料會向內(nèi)收縮，形成粒徑更小的納米粒子。

圖3 HA-F127納米粒子在15℃和37℃的透射電鏡照片F(xiàn)ig.3 TEM images of HA-F127 nanoparticles at 15℃and 37℃

此后，通過動態(tài)光散射測定納米粒子在水溶液中不同溫度下的粒徑，結(jié)果如表1所示。

表1 HA-F127納米粒子不同溫度下的粒徑Table 1 Average size of HA-F127 nanoparticles at different temperature

在15℃時，測得的粒徑為275.2 nm，而在37℃時的粒徑為80.8 nm，結(jié)果大于通過透射電鏡觀測到的粒徑。這主要是由于透射電鏡觀測的是納米粒子干態(tài)下的粒徑，而通過動態(tài)光散射測定得到的是粒子的水合粒徑，由于親水層中含有一定的水分子，親水性分子會向外伸展，因而粒徑比電鏡測得的結(jié)果要更大些。

2.3 體外藥物釋放

用HA-F127構(gòu)建納米粒子并包載疏水性抗腫瘤藥物阿霉素，通過紫外檢測可知藥物的包載量可達到10.6%，藥物的包封率為52.9%。載藥HA-F127納米粒子的藥物釋放行為分別在15℃和37℃條件下測試，結(jié)果如圖4所示。

圖4 HA-F127納米粒子在不同溫度的體外藥物釋放曲線Fig.4 In vitro drug release profiles ofHA-F127 nanoparticles at different temperatures

從圖4可以看出，在兩種溫度條件下，HAF127納米粒子均可以表現(xiàn)出對藥物阿霉素良好的控制釋放行為，而37℃下藥物的釋放速率和累計釋放率均快于15℃下的藥物釋放行為。這主要是由于HA-F127納米粒子具有如上所述的溫敏性質(zhì)，在37℃條件下會發(fā)生體系的收縮，此時藥物的釋放速率會明顯增快，藥物的累積釋放率也有所增加。

2.4 HA-F127細胞毒性

材料HA-F127的細胞毒性通過MTT法分別對HeLa腫瘤細胞和COS7正常細胞進行測試，結(jié)果如圖5所示。

圖5 HA-F127對HeLa和COS7細胞的細胞毒性Fig.5 Cytotoxicity of HA-F127 against HeLa and COS7 cells

從圖5可以看出，HA-F127對于兩種細胞均未表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，甚至當材料質(zhì)量濃度達到500 mg/L，兩種細胞的存活率仍可維持在90%以上。這一結(jié)果說明材料本身不具有明顯細胞毒性。這主要是由于HA本身來源于動物體內(nèi)，具有良好的生物相容性。而F127分子為FDA批準可注射進入人體的藥物輔料，其同樣具有良好的生物相容性。因而所制備的材料及構(gòu)建的納米粒子可用于后續(xù)測試。

2.5 載藥納米粒子的細胞毒性

載藥納米粒子對兩種細胞的毒性同樣通過MTT法進行，同時以等當量的藥物阿霉素作為陽性對照，結(jié)果如圖6所示。從圖6（a）中可以看出，對于HeLa腫瘤細胞藥物阿霉素的半致死質(zhì)量濃度（IC50）為0.3 mg/L，載藥納米粒子的IC50值為0.6 mg/L。由于HA-F127納米粒子本身不具有明顯的細胞毒性，這一毒性主要來自于藥物阿霉素。載藥納米粒子比藥物阿霉素對細胞的IC50略大，這主要是由于一部分藥物被包裹在納米粒子內(nèi)部，難以完全釋放進入細胞核，因而毒性有所降低。而從圖6（b）可以看出，藥物對于COS7細胞的IC50為3 mg/L，而載藥納米粒子對細胞的IC50則大于8 mg/L。對比HeLa細胞的結(jié)果可知，材料能明顯提高治療的選擇性。這主要是由于HA可識別HeLa腫瘤細胞表面過度表達的CD44受體，因而可介導(dǎo)更多藥物進入HeLa細胞。

圖6 載阿霉素HA-F127納米粒子對HeLa和COS7細胞的細胞毒性Fig.6 Cytotoxicity of DOX-loaded HA-F127 nanoparticles against HeLa and COS7 cells

2.6 細胞內(nèi)攝化行為

細胞對HA-F127載藥納米粒子的內(nèi)攝化行為通過倒置熒光顯微鏡進行觀測，照片如圖7所示。圖7（a）顯示，紅色熒光的藥物阿霉素可進入HeLa細胞并進入經(jīng)藍色熒光探針DAPI標記的細胞核，因而表現(xiàn)出對HeLa細胞的顯著毒性。圖7（b）說明，載藥納米粒子同樣可介導(dǎo)阿霉素快速進入HeLa細胞，并且可以觀測到有藥物進入細胞核。而在經(jīng)過HA預(yù)處理2 h之后，由于HA已經(jīng)與HeLa細胞表面的CD44受體相結(jié)合，此時載藥納米粒子進入細胞的效率降低，從圖7（c）可看出，紅色熒光明顯減弱，這也說明HA-F127納米粒子進入細胞的途徑主要是由配體-受體介導(dǎo)的。而對于圖7（d）COS7正常細胞，由于其表面并不含有過度表達的CD44受體，因而HA-F127納米粒子也難以在短時間內(nèi)進入細胞。利用這一優(yōu)勢，HA-F127納米粒子可包載抗腫瘤藥物特異性進入腫瘤細胞，提高藥物傳遞的靶向性。

圖7 HA-127納米粒子的細胞內(nèi)攝化行為Fig.7 Internalization of HA-127 nanoparticles

3 結(jié)語

通過“Click”化學(xué)反應(yīng)成功制備了兩親性材料HA-F127，其在水溶液中可自組裝形成納米粒子。由于F127所具有的溫敏特性，納米粒子也可以表現(xiàn)出一定的溫敏性。

納米粒子可以在疏水內(nèi)核中包載疏水性的抗腫瘤藥物阿霉素，同時利用納米粒子表面透明質(zhì)酸對腫瘤細胞表面過度表達的CD44受體的識別作用，靶向傳遞藥物進入腫瘤細胞。材料本身具有良好的生物相容性，其有望應(yīng)用于臨床抗腫瘤藥物的靶向傳遞和治療研究。

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