徐 沙 ， 劉立明

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糖生物學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江蘇 無錫 214122）

轉(zhuǎn)錄組（Transcriptome）指一個活細(xì)胞在特定狀態(tài)下所能轉(zhuǎn)錄出來的所有mRNA的總和，包括編碼RNA和非編碼RNA[1]。研究轉(zhuǎn)錄組的一個重要方法是利用DNA芯片技術(shù)檢測有機(jī)體基因組中基因的表達(dá)。從基因組DNA轉(zhuǎn)錄的mRNA的總和即轉(zhuǎn)錄組，也稱為表達(dá)譜，是研究細(xì)胞表型和功能的一個重要手段。微生物在遭受某種刺激時，往往會伴隨著某些基因表達(dá)水平的變化。在一個有生命的生物系統(tǒng)中，基因組是遺傳信息的儲存體，mRNA是基因表達(dá)的中間體，功能性蛋白質(zhì)是基因功能的執(zhí)行體。因此，基因組和轉(zhuǎn)錄組兩者的關(guān)系不是一一對應(yīng)的[2-3]。

作者前期研究發(fā)現(xiàn)，光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）在生產(chǎn)丙酮酸的過程中，隨著NaOH的不斷流加，發(fā)酵液滲透壓逐漸提高，成為丙酮酸進(jìn)一步積累的關(guān)鍵限制性因素[4]。作者所在研究室通過選育一株能在含有70 g/L NaCl的培養(yǎng)基中正常生長的突變株，使丙酮酸產(chǎn)量提高了41.1%[5]。目前，國內(nèi)外針對酵母應(yīng)對滲透壓脅迫的機(jī)制已有一些研究。Rep等在研究高滲脅迫對釀酒酵母轉(zhuǎn)錄水平的影響時發(fā)現(xiàn)，多數(shù)上調(diào)基因的功能是編碼滲透保護(hù)蛋白質(zhì)或者是甘油、海藻糖和糖原代謝途徑中的酶[6]。隨后，Yale等研究NaCl脅迫不同時間后（10、30 min和90 min）釀酒酵母轉(zhuǎn)錄水平的變化。結(jié)果表明，隨著脅迫時間的延長，上調(diào)基因的數(shù)量逐漸增加，且與能量相關(guān)的基因表達(dá)隨著脅迫時間的延長而升高，在30 min時出現(xiàn)峰值[7]。國內(nèi)Han Yanping等對鼠疫耶爾森氏桿菌（Yersinia pestis）在高滲和高鹽脅迫下的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)那些合成滲透保護(hù)劑轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)和一系列致病因子的基因以及一些全局性轉(zhuǎn)錄因子都發(fā)生了上調(diào)[8]。

雖然已有文獻(xiàn)報道了高滲脅迫對酵母轉(zhuǎn)錄組的影響，但在T.glabrata中尚未見文獻(xiàn)報道。T.glabrata發(fā)酵過程的主要產(chǎn)物丙酮酸，是糖酵解途徑的最終產(chǎn)物，在后續(xù)的代謝中，將進(jìn)入線粒體氧化生成乙酰CoA，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最終被氧化成CO2和水。其代謝過程中產(chǎn)生的NADH會進(jìn)入氧化磷酸化途徑，為細(xì)胞提供大量ATP。因此中心代謝途徑和能量代謝途徑對丙酮酸生產(chǎn)來說非常重要。此外，已有研究表明，氨基酸是重要的微生物相容性溶質(zhì)，可以保護(hù)細(xì)胞抵御滲透壓脅迫的影響[9]。基于上述分析，本文著重討論了糖酵解途徑、三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化和氨基酸代謝途徑中關(guān)鍵酶轉(zhuǎn)錄水平的變化，以期能夠從整體水平揭示特定生物學(xué)過程以及脅迫過程的分子機(jī)理，研究不同滲透壓條件下基因轉(zhuǎn)錄水平的變化，為后續(xù)研究如何提高T.glabrata抵御高滲脅迫的能力提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌種

T.glabrata CCTCC M202019，為煙酸（NA）、硫胺素（B1）、吡哆醇（B6）和生物素（Bio）的營養(yǎng)缺陷型，由作者所在研究室自行篩選并保藏[9]。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1 斜面和種子培養(yǎng)基 葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L， KH2PO41 g/L， MgSO4·7H2O 0.5 g/L， 瓊脂20 g/L（斜面培養(yǎng)基用）。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖100 g/L，NH4Cl 7 g/L，KH2PO45 g/L， MgSO4·7H2O 0.8 g/L， 乙酸鈉 6 g/L，煙酸4 mg/L，鹽酸硫胺素30 μg/L，煙酸吡哆醇100 μg/L，生物素 10 μg/L，核黃素 50 μg/L， CaCO340 g/L（僅限搖瓶培養(yǎng)時調(diào)節(jié)pH用）。添加NaCl改變發(fā)酵培養(yǎng)基滲透壓，0、30、50、80 g/L NaCl對應(yīng)的溶液滲透壓分別為860，1 765，2 603 mOs mol/kg和3 324 mOs mol/kg。培養(yǎng)基初始pH 5.5。維生素液過濾除菌后加入。

1.2.3 搖瓶培養(yǎng) 從新鮮斜面上接一環(huán)菌入種子培養(yǎng)基 （50 mL置于500 mL的錐形瓶），于30℃、200 r/min下?lián)u瓶培養(yǎng)24 h后，以體積分?jǐn)?shù)10%接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基。搖瓶發(fā)酵：500 mL的錐形瓶中發(fā)酵培養(yǎng)基為50 mL，溫度30℃，轉(zhuǎn)速200 r/min，發(fā)酵時間為48 h。

1.3 滲透壓測定

發(fā)酵液滲透壓采用OSMOMAT 030冰點滲透壓儀測定。

1.4 RNA的提取與表達(dá)譜芯片分析

1.4.1 總RNA抽提（Trizol法）

1）取對數(shù)生長中期的細(xì)胞，每2×107個細(xì)胞加入1 mL Trizol，在震蕩混勻后，液氮研磨充分破碎細(xì)胞。

2）按體積比1∶5加入氯仿，充分混勻后室溫靜置5 min。

3）4℃，12 000 r/min離心15 min，取出上清液并轉(zhuǎn)入新1.5 mL的離心管中，加入等體積異丙醇混勻，室溫靜置5 min。

4）4℃、12 000 r/min離心10 min，去上清液后，按體積比2∶5向沉淀中加入體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇，4℃、12 000 r/min離心洗滌沉淀15 min。

5）沉淀室溫晾干后，加入適量無RNA酶水充分溶解，測定OD260和OD280值。

6）按操作說明采用無RNA酶的DNA酶I（Takara）處理。

1.4.2 基因芯片合成 表達(dá)譜芯片由上?？党缮锕こ逃邢薰疚蠥gilent依據(jù)Torulopsis glabrata CBS 138基因組全序列設(shè)計合成?；赟anger的測序結(jié)果表明，T.glabrata CCTCC M202019的18s rRNA與該菌株100%一致。

1.4.3 芯片雜交與洗滌 委托上海康成生物工程有限公司完成。

1.4.4 芯片掃描與數(shù)據(jù)分析

1）通過 Agilent Scanner獲取圖像并在 10 μm條件下掃描像素值；

2）圖像使用Feature Extraction進(jìn)行定量分析，得到圖像定量和標(biāo)準(zhǔn)化處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 轉(zhuǎn)錄組概況

T.glabrata細(xì)胞在不同的滲透壓條件下（860、1 765、2 603 mOs mol/kg 和 3 324 mOs mol/kg）培養(yǎng)到對數(shù)生長中期，收集細(xì)胞，采用全基因組芯片檢測進(jìn)行全基因組基因表達(dá)水平分析。根據(jù)NCBI數(shù)據(jù) 庫 （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）中 的 T.glabrata CBS138基因信息，在芯片上設(shè)計了5 280個寡核苷酸探針，其中有5 009個基因的表達(dá)被檢測出來。利用GenBank、KEGG、UniProt等公共數(shù)據(jù)庫對未知基因進(jìn)行高精度注釋，結(jié)果有3 500個以上的基因可以通過基因注釋初步確定其功能。

一般認(rèn)為基因表達(dá)水平發(fā)生2倍及以上變化的基因發(fā)生了差異表達(dá)。在滲透壓為1 765、2 603 mOs mol/kg和3 324 mOs mol/kg的條件下，相對于對照條件（860 mOs mol/kg），分別有 1 335、1 155 和1 630個基因轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，818、789和770個基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。

2.2 GO功能富集

對上述差異基因進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果見圖 1。高滲脅迫條件（1 765、3 324 mOs mol/kg）與正常條件（860 mOsmol/kg）相比，發(fā)生轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)變化的基因主要集中于以下功能類群（圖1（a））：結(jié)合 （binding）、DNA 結(jié) 合 （DNA binding）、 核 酸 結(jié) 合（nucleic acid binding）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）、鎂離子結(jié)合（magnesium ion binding）、激酶活性（kinase activity）、催化活性（catalytic activity）、核苷酸結(jié)合（nucleotide binding）、水解酶（hydrolase activity）、 蛋白質(zhì)結(jié)合 （protein binding）、 肽活性（peptidase activity）、氧化還原酶活性（oxidoreductase activity）、ATP 結(jié)合 （ATP binding）、GTP 結(jié)合（GTP binding）、鋅離子結(jié)合（zinc ion binding）、金屬離子結(jié) 合 （metal ion binding）、 轉(zhuǎn)運活性 （transporter activity）、轉(zhuǎn)移酶活性（transferase activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）。

這些功能類群主要參與蛋白質(zhì)翻譯及修飾、能量代謝、核酸復(fù)制和物質(zhì)轉(zhuǎn)運等過程。轉(zhuǎn)錄發(fā)生下調(diào)的基因主要功能類群（圖1（b）），除與上調(diào)基因相同的部分之外，還包括序列特異的DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因 子 的 活 性 （sequence-specific DNA binding transcription factor activity）、解旋酶的活性（helicase activity）、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性（protein serine/threonine kinase activity）和RNA結(jié)合（RNA binding）等。

進(jìn)一步分析在較低高滲條件 （1 765 mOs mol/kg）和極端高滲條件下（3 324 mOs mol/kg）轉(zhuǎn)錄水平提高10倍以上的基因。其中已知功能的分別有90和96個（圖2，只選取提高倍數(shù)前50的基因作圖）。其中細(xì)胞壁甘露糖蛋白質(zhì)（CAGL0I06204g）、脂肪酸延伸蛋白質(zhì)（CAGL0L08184g）的轉(zhuǎn)錄水平在較低的高滲條件下提高了60倍以上；另外，產(chǎn)孢調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)（CAGL0E04840g）、磷脂酶（CAGL0J11748g）、信息素調(diào)節(jié)膜蛋白質(zhì) 4（CAGL0M02167g）和 10（CAGL0G04433g）等的轉(zhuǎn)錄水平也都有不同程度的大幅提高。在極端高滲條件下（3324 mOs mol/kg），信息素調(diào)節(jié)膜蛋白質(zhì)10甚至提高了88.6倍，而脂肪酸延伸蛋白質(zhì)和細(xì)胞壁甘露糖蛋白質(zhì)的上調(diào)水平相比較低的高滲條件略有下降，分別提高了54.9倍和34.8倍。除此之外，液泡堿性氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)（CAGL0J01375g）的轉(zhuǎn)錄在極端高滲條件下（3 324 mOs mol/kg）增加了11.70倍，高于滲透壓較低情況下（1 765 mOs mol/kg）的2.70倍。

圖1 高滲培養(yǎng)條件下差異表達(dá)基因的GO功能富集分析Fig.1 GO functional enrichment analysis of differentially expressed genes

圖2 在高滲條件下表達(dá)水平上調(diào)10倍以上的基因Fig.2 Genes upregulated more than 10 times by hyperosmotic stress

在兩種高滲條件下 （各為1 765 mOs mol/kg和3 324 mOs mol/kg）轉(zhuǎn)錄水平都提高10倍以上的基因共58個。這表明在這兩種情況下，T.glabrata細(xì)胞調(diào)控表達(dá)的機(jī)制可能有所不同。但是仍然可以發(fā)現(xiàn)，這些表達(dá)量大幅度提高的基因主要是細(xì)胞壁、細(xì)胞膜相關(guān)的和一些膜上的信息素蛋白質(zhì)基因。因為細(xì)胞外環(huán)境的改變直接作用于微生物的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，胞外滲透壓提高，胞內(nèi)水分外流，隨后胞內(nèi)溶液濃度升高，從而導(dǎo)致細(xì)胞體積減小，肽聚糖層被破壞，并最終質(zhì)壁分離。細(xì)胞壁和細(xì)胞膜最先感應(yīng)到外界環(huán)境的改變，其受影響的程度可能是最為劇烈的。

2.3 糖酵解途徑中的基因表達(dá)譜

糖酵解是將葡萄糖降解為丙酮酸并伴隨著ATP生成的一系列反應(yīng)。如表1所示，在高滲環(huán)境下，EMP途徑中有7個基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了上調(diào)，這7個基因分別涉及到6種酶，即己糖激酶（CAGL0H07579g）、 6- 磷 酸 葡 萄 糖 變 構(gòu) 酶（CAGL0K03289g）、 6- 磷 酸 葡 萄 糖 異 構(gòu) 酶（CAGL0H05445g）、 6- 磷 酸 果 糖 激 酶（CAGL0F08041g和 CAGL0L10758g）、 3-磷酸甘油酸脫氫酶 （CAGL0J00451g）和丙酮酸激酶（CAGL0E05610g）。另外，在高滲條件下，有1個基因轉(zhuǎn)錄水平略微下調(diào)，即1，6-二磷酸果糖酶（CAGL0H04939g）。 但是，1，6-二磷酸果糖酶催化1，6-二磷酸果糖為6-磷酸果糖，是EMP途徑的逆反應(yīng)，其轉(zhuǎn)錄水平的下調(diào)對EMP途徑的代謝有促進(jìn)作用。

EMP途徑中有3個酶參與不可逆反應(yīng)，分別是磷酸果糖激酶，己糖激酶和丙酮酸激酶，這3種酶調(diào)節(jié)著糖酵解的速度。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，非極端高滲環(huán)境對己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的基因轉(zhuǎn)錄有一定的誘導(dǎo)作用，但在極端高滲條件下誘導(dǎo)作用不明顯。總體而言，相比正常條件高滲環(huán)境下的酵母細(xì)胞EMP途徑略有上調(diào)，但幅度不大，而且多數(shù)基因的表達(dá)水平只在滲透壓相對較低的條件下（1 765 mOs mol/kg）有所提高，極端高滲條件下沒有基因發(fā)生明顯上調(diào)，說明EMP途徑的轉(zhuǎn)錄水平和滲透壓的影響關(guān)系不大。

2.4 三羧酸途徑中的基因表達(dá)譜

三羧酸循環(huán)（Tricarboxylic acid cycle，TCA）在動植物、微生物細(xì)胞中普遍存在，不僅是糖代謝的核心途徑，也是脂肪、蛋白質(zhì)分解代謝的最終途徑。如表2所示，T.glabrata在高滲條件下，TCA循環(huán)途徑相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平整體上調(diào)。α-酮戊二酸脫氫酶E1組 分 （CAGL0G08712g）、 檸 檬 酸 合 酶（CAGL0B03663g和CAGL0L09086g）、 異檸檬酸脫氫酶（CAGL0I07227g 和 CAGL0B04917g）、蘋果酸脫氫酶（CAGL0L05236g）、丙酮酸脫氫酶E1組分β亞基 （CAGL0K06831g）和丙酮酸脫氫酶 E2組分（CAGL0J10186g）等TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶基因，均在高滲條件下表達(dá)被誘導(dǎo)。只有延胡索酸酶（CAGL0A01045g）、丙酮酸羧化酶（CAGL0F06941g）和琥珀酸脫氫酶（CAGL0C03223g）在極端高滲條件下基因表達(dá)水平受到抑制。

表1 糖酵解途徑中的差異表達(dá)基因Table 1 Differential expression genes in EMP pathway

表2 三羧酸循環(huán)途徑中的差異表達(dá)基因Table 2 Differential expression genes of TCA cycle

TCA循環(huán)的多個反應(yīng)都是可逆的，但是檸檬酸的合成及α-酮戊二酸的氧化脫羧二步反應(yīng)是不可逆的。因此三羧酸循環(huán)的調(diào)節(jié)部位有3個，即檸檬酸合酶、異檸檬酸脫氫酶和α-酮戊二酸脫氫酶催化的反應(yīng)。這3個酶催化反應(yīng)都伴隨著ATP的形成或NADH的產(chǎn)生 （進(jìn)入氧化磷酸化途徑最終形成ATP）。在高滲條件下，這3個酶有部分基因的轉(zhuǎn)錄發(fā)生了上調(diào)?？赡艿脑蚴牵涵h(huán)境滲透壓過高，導(dǎo)致胞內(nèi)Na+含量增加，并且對細(xì)胞具有毒害作用，觸發(fā)Na+/H+反向輸送，逐出Na+，引入質(zhì)子，需要消耗一定的能量。另外，細(xì)胞需要合成一些特定的相容性溶質(zhì)來抵御滲透壓脅迫，這些物質(zhì)的合成也需要消耗能量。因此，細(xì)胞需要加快產(chǎn)能途徑的代謝來滿足微生物抵御脅迫的需要。

2.5 磷酸戊糖途徑的基因表達(dá)譜

磷酸戊糖途徑的主要作用是：產(chǎn)生NADPH（NADPH不參與呼吸鏈，不產(chǎn)生ATP），為細(xì)胞的各種合成反應(yīng)提供還原力；生成磷酸核糖，為核酸代謝做物質(zhì)準(zhǔn)備；分解戊糖，其中間產(chǎn)物為許多化合物的合成提供原料。

如表3所示，磷酸戊糖途徑在高滲條件下有13個基因8種酶轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，分別是：

葡萄糖激酶（CAGL0K11297g），葡萄糖-6磷酸異構(gòu)酶 （CAGL0H05445g），磷酸葡糖酸內(nèi)酯酶（CAGL0I02200g），核酮糖磷酸-3-異 構(gòu) 酶（CAGL0L05478g），6-磷酸果糖激酶（CAGL0F08041g和 CAGL0L10758g）， 5-磷酸核糖異構(gòu)酶 （CAGL0L03740g），核糖激酶（CAGL0L08228g），磷酸核糖焦磷酸激酶（CAGL0C05181g、CAGL0D00550g、CAGL0I05500g、CAGL0K02541g）和葡萄糖磷酸變位酶（CAGL0M02981g）。其中核糖激酶上調(diào)幅度較大。

另外，有5個基因4個酶發(fā)生下調(diào)，分別是：6-磷酸葡萄糖脫氫酶 （CAGL0J07612g），1，6-二磷酸果糖酶（CAGL0H04939g），轉(zhuǎn)醛醇酶（CAGL0B03069g、CAGL0K04235g）和葡萄糖磷酸變位酶（CAGL0K07480g）。

表3 磷酸戊糖途徑差異表達(dá)基因Table 3 Differential expression genes in pentose phosphate pathway

在磷酸戊糖途徑的氧化脫羧階段，6-磷酸葡萄糖脫氫酶的活性最低，是整個途徑的限速酶。該酶的基因表達(dá)在高滲條件下沒有明顯變化，在極端高滲條件下轉(zhuǎn)錄水平甚至受到了抑制。而其他一些基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，可能與合成特定相容性溶質(zhì)需要某些中間產(chǎn)物有關(guān)。

2.6 氧化磷酸化途徑的基因表達(dá)譜

氧化磷酸化途徑是將營養(yǎng)物質(zhì)最終氧化分解，生成CO2和水并釋放出能量的過程，稱為生物氧化，是好氧條件下細(xì)胞能量的主要來源。如表4所示，氧化磷酸化途徑轉(zhuǎn)錄水平整體呈現(xiàn)上調(diào)，有26個基因在高滲條件下轉(zhuǎn)錄水平提高。其中，H+轉(zhuǎn)運ATP酶的轉(zhuǎn)錄水平增加10倍以上，變化極為顯著。此外，值得注意的是，多數(shù)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，較低滲透壓條件（1 765 mOs mol/kg）相比極端高滲條件（3 324 mOs mol/kg）轉(zhuǎn)錄上調(diào)幅度更大；而轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)的8個基因NADH脫氫酶（NADH dehydrogenase）、 琥珀酸脫氫酶鐵硫蛋白質(zhì)（succinate dehydrogenase iron-sulfur protein）、琥珀酸脫氫酶黃素蛋白質(zhì)亞基 （succinate dehydrogenase flavoprotein subunit）、輔酶Q-細(xì)胞色素 C還原酶細(xì) 胞 色 素 C1 （ubiquinol-cytochrome c reductase cytochrome c1 subunit）、 V-型 H+-ATP 酶亞基 I（V-type H+-transporting ATPase subunit I）、 F-型 H+-ATP 酶亞基 Δ （F-type H+-ATPase subunit delta）、F-型H+-ATP酶寡霉素敏感相關(guān)蛋白質(zhì) （F-type H+-ATPase oligomycin sensitivity conferral protein）和F-型H+-ATP酶亞基h（F-type H+-ATPase subunit h），在極端高滲條件下，轉(zhuǎn)錄水平下降幅度更大?？赡艿脑蚴?，極端高滲條件使某些RNA轉(zhuǎn)錄酶的活性受到抑制，從而影響了部分基因的轉(zhuǎn)錄?？傊鲜鼋Y(jié)果表明，高滲脅迫總體上促進(jìn)了氧化磷酸化途徑基因轉(zhuǎn)錄水平的提高，但部分基因在極端高滲條件下，轉(zhuǎn)錄水平反而呈現(xiàn)下降。

表4 氧化磷酸化途徑的差異表達(dá)基因Table 4 Differential expression genes of oxidative phosphorylation

2.7 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑基因表達(dá)譜

HOG-MAPK途徑（圖3）是絕大多數(shù)酵母抵御高滲脅迫的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果表明，HOG-MAPK途徑中的關(guān)鍵基因Sho1p、Ste20p、Ste11p和Hog1p轉(zhuǎn)錄水平略有上調(diào)，但幅度不是很大；Sln1p、Ssk1p、Pbs2p和Glo1p轉(zhuǎn)錄水平有所下調(diào)，其中Pbs2p在極端高滲條件下（3 324 mOs mol/kg）受到比較明顯的抑制，轉(zhuǎn)錄水平下降至正常條件下（860 mOs mol/kg）的12.6%。

總體來說，相對于釀酒酵母和其他大部分酵母而言，高滲脅迫對T.glabrata的HOG-MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑影響不大，即高滲沒有明顯誘導(dǎo)T.glabrata信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的基因轉(zhuǎn)錄。這與研究室前期在研究T.glabrata發(fā)酵過程較少檢測到甘油生成的結(jié)果是一致的。這也表明，T.glabrata可能存在其他應(yīng)對高滲脅迫的機(jī)制。

圖3 HOG-MAPK信號通路Fig.3 HOG-MAPK signaling pathway.Dark gray：upregulated；Light gray：downregulated

2.8 氨基酸合成與代謝途徑的基因表達(dá)譜

作者分析了谷氨酸、脯氨酸和精氨酸的合成與分解代謝途徑中相關(guān)基因的表達(dá)。除精氨酸外，谷氨酸和脯氨酸都被證實可以在特定的微生物中積累，作為相容性溶質(zhì)，抵御環(huán)境脅迫的影響。分析結(jié)果如表5所示。處于精氨酸分解途徑中尿素羧化酶（CAGL0M05533g）轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào)，下降了99%以上，表明在高滲脅迫的條件下精氨酸分解能力下降。由于精氨酸的代謝與含氮有機(jī)化合物的代謝有關(guān)，在后續(xù)的研究中可以考慮表達(dá)精氨酸合成途徑中的關(guān)鍵酶，而不是敲除精氨酸分解途徑中的酶來提高精氨酸在胞內(nèi)的積累。

表5 氨基酸合成與代謝途徑的基因表達(dá)Table 5 Changes in genes expression of amino acids metabolic pathway

另外，脯氨酸和谷氨酸合成途徑中的酶轉(zhuǎn)錄水平都有一定程度的提高，但是幅度不大。因此在后續(xù)的實驗中可以考慮過量表達(dá)這些合成酶，或者通過在胞外補加脯氨酸或谷氨酸來促進(jìn)胞內(nèi)這兩種氨基酸的積累，達(dá)到提高細(xì)胞抗脅迫能力的目的。

3 討論

中心代謝途徑是最重要的葡萄糖代謝途徑，也是重要的產(chǎn)能途徑，有部分酶的基因在高滲條件下差異表達(dá)。在糖酵解途徑中，6-磷酸葡萄糖變構(gòu)酶（CAGL0K03289g）在滲透壓為 2 603 mOs mol/kg 的條件下，轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生上調(diào)。該酶催化α-6-磷酸葡萄糖到β-6-磷酸葡萄糖的反應(yīng)，可能會在一定程度上影響糖酵解途徑的碳通量?？傮w而言，發(fā)酵液滲透壓的提高誘導(dǎo)糖酵解途徑的轉(zhuǎn)錄發(fā)生上調(diào)，特別是丙酮酸激酶（CAGL0E05610g）在滲透壓為1 765 mOs mol/kg和2 603 mOs mol/kg兩個條件下，轉(zhuǎn)錄水平分別上調(diào)2.91倍和2.61倍。已有研究表明，與能量相關(guān)的基因表達(dá)會隨著高滲脅迫時間的延長而提高，特別是呼吸和能量代謝相關(guān)的基因。在釀酒酵母中，鹽脅迫30 min后，被誘導(dǎo)表達(dá)的ORFs（open reading frames，開放閱讀框）中有 9.1%是電子傳遞鏈的組分，例如細(xì)胞色素和ATP合成酶復(fù)合體等[7]。本研究中發(fā)現(xiàn)，在高滲條件下與能量相關(guān)代謝途徑（如三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化途徑等）的基因多數(shù)表達(dá)水平提高，尤其是那些參與產(chǎn)生ATP或形成NADH的基因。在有氧條件下，胞內(nèi)NADH通過氧化磷酸化途徑合成ATP。在氧化磷酸化過程中有5個酶復(fù)合體，其成分非常復(fù)雜?？傮w而言，復(fù)合體III、IV、V的轉(zhuǎn)錄水平都有明顯上調(diào)，而復(fù)合體I和II可能略有下調(diào)。氨基酸是一類重要的相容性溶質(zhì)，糖酵解途徑和三羧酸循環(huán)為其合成提供重要的前體物質(zhì)。谷氨酸合成酶（CAGL0L01089g）催化α-酮戊二酸合成谷氨酸，但研究發(fā)現(xiàn)該酶的轉(zhuǎn)錄水平并沒有發(fā)生明顯上調(diào)。而催化谷氨酸代謝形成脯氨酸或精氨酸的吡咯啉-5-羧酸脫氫酶（CAGL0D03982g）和N-乙酰谷氨酸轉(zhuǎn)移酶（CAGL0F06501g）轉(zhuǎn)錄水平都發(fā)生了明顯的上調(diào)。該結(jié)果說明T.glabrata可能與某些植物細(xì)胞類似，具有積累精氨酸或脯氨酸抵御滲透壓脅迫的生理機(jī)制。

4 結(jié)語

綜上所述，中心代謝途徑、能量代謝途徑和氨基酸代謝途徑對T.glabrata抵御滲透壓脅迫具有重要影響。作者在后面的研究中將對上述3個途徑進(jìn)行調(diào)控和改造，如通過增強T.glabrata產(chǎn)生ATP，在T.glabrata胞內(nèi)過量積累精氨酸、脯氨酸等手段，達(dá)到提高T.glabrata抵御滲透壓脅迫能力的目的。

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