西安市中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科（西安710003） 董 玉 周 宇 李滿祥 劉 安 李東繁 黃妙毅

隨著吸煙人數(shù)的增多及環(huán)境嚴重污染，慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary disease，COPD）患病率和病死率逐年上升，嚴重影響人類健康。吸煙是COPD最重要的危險因素，香煙煙霧中的活性氧類物質(zhì) （ROS）等，能夠通過活化ERK和J n k信號通路，誘發(fā)下游相關(guān)粘液蛋白的表達，繼而促進氣管粘液高分泌［1，2］。而氣管粘液高分泌是COPD重要病理生理特征之一。近年來很多研究表明：它可以導致并加重呼吸道氣流阻塞，加速肺功能下降進程，易導致氣管內(nèi)感染且不易控制，增加該疾病的住院率及病死率，粘液高分泌已成為影響COPD病情和預后的獨立危險因素［3］。粘蛋白（Mucin，MUC）5AC是氣管主要的分泌型粘蛋白，在人氣管上皮的杯狀細胞中高度表達，也是病理性增加的主要粘蛋白表型［4］。羅氟司特為磷酸二酯酶-4（PDE4）抑制劑，主要通過抑制PDE，增加cAMP或cGMP含量調(diào)控細胞生理功能，可舒張支氣管、減輕水腫、抑制免疫及炎癥細胞活性，被廣泛用于治療支氣管哮喘和COPD［5］。本研究擬對PDE4抑制劑羅氟司特對煙霧誘導大鼠粘液高分泌中Muc5AC表達的抑制作用及相關(guān)信號傳導通路進行探討，為臨床的靶向性治療奠定基礎。

材料與方法

1 材料與試劑 Wistar大鼠購自西安交通大學醫(yī)學院動物實驗中心?？俁NA提取試劑盒（RNAfast200）購自上海飛捷生物技術(shù)公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa公司；引物由上海生物工程技術(shù)服務有限公司合成；兔抗MUC5 AC抗體購自Abcam；SP試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京中杉金橋。

2 COPD大鼠模型建立及分組

2．1 動物分組：選擇12周清潔級健康 Wistar大鼠24只，雌雄各半，體重190～220g，體重降次排序，按隨機數(shù)字表方法將大鼠分為對照組、煙霧組、藥物組、煙霧＋藥物組（簡稱煙＋藥組），每組6只。飼養(yǎng)環(huán)境：對照組和藥物組大鼠置于無煙環(huán)境中飼養(yǎng)，煙霧組和煙＋藥組大鼠暴露于有煙環(huán)境；對照組和煙霧組大鼠以等劑量注射用水灌胃，藥物組和煙＋藥組大鼠用等劑量羅氟司特灌胃；雌雄分箱同溫（18～20℃）、同濕度（40%～60%），自由飲水，普通食料喂養(yǎng)16周。

2．2 大鼠模型建立：①羅氟司特灌胃：藥物組和煙＋藥組大鼠給予羅氟司特0．5mg／d，每日上午9：00灌胃1次，共16周。其他兩組等量注射用水灌胃。②熏煙：將煙霧組和煙＋藥組大鼠置于自制有機玻璃染毒箱內(nèi)，箱頂留有直徑為1．5cm的通氣孔，箱內(nèi)放置鈉石灰吸收CO2，以無水CaCl2吸收水蒸氣。將香煙點燃后接于煙嘴上，用60ml注射器連續(xù)吸人煙霧，并通過接有三通的輸液管注入箱內(nèi)，每次16支香煙，箱中煙霧濃度約為7%。抽吸完畢等待30min，2次／d，間隔4h，共16周。其他兩組大鼠不熏煙，常氧下相同時間和條件飼養(yǎng)。③標本采集：16周后結(jié)束造模，各組大鼠麻醉后行氣管插管，夾閉其右主支氣管，緩慢注入生理鹽水2ml灌注左肺，反復3次，回收率為60%～80%。BALF以1500r／min離心10min。取上清液-70℃保存。取右肺葉，由肺門至肺緣作最大切面。部分肺組織液氮保存待測，其余肺組織浸泡于10%中性甲醛中固定4h，常規(guī)制備石蠟切片，待HE染色常規(guī)病理學檢查及免疫組織化學檢測。

3 免疫組化法檢測大鼠支氣管、肺組織粘蛋白MUC5AC表達水平 采用過氧化物酶標記的鏈酶卵白素（SP）染色法，石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，3%過氧化氫，室溫5～10min以滅活內(nèi)源性酶，蒸餾水洗3次，微波抗原修復，滴加正常山羊血清封閉液，室溫20 min；滴加適當稀釋的一抗（1∶50），4℃過夜；滴加相應的生物標記二抗，濕盒內(nèi)室溫孵育30min，滴加鏈霉卵白素（PBS稀釋），室溫孵育20min；二氨基聯(lián)本胺（DAB）和H2O2孵育2min，將DAB底物工作液滴加于切片上，顯微鏡下控制顯色，自來水充分沖洗終止顯色反應。蘇木素輕度復染，脫水，透明，封片，顯微鏡觀察。

4 RT-PCR法檢測各組肺組織粘蛋白MUC5 AC轉(zhuǎn)錄水平

4．1 組織總RNA的提?。喝吮窘M織約50mg，用Trizol提取總RNA，嚴格按說明書操作。取RNA 5μl，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（日本Takara公司）合成cDNA鏈，再以逆轉(zhuǎn)錄反應液1μl作為模板，加入PCRMix 12．5μl，上游引物lμl，下游引物1μl及ddH2O 9．5μl至25μl反應體系，用PCR擴增儀進行擴增。MUC5AC引物序列 上游：5ˊTCAACGGAGACTGCGAGTACAC3′下游：5ˊ-TCTTGATGGCCTTGGAGCA3′；內(nèi)參 GAPDH 上游：5′GAAGGTGAAGGTCGGAGTC3′，下 游：5′GAAGATGGTGATGGGATTTC3′，產(chǎn)物220bp。引物由上海生工合成。

4．2 PCR反應條件：變性94℃30s，退火58℃30s，延伸72℃30s，共30個循環(huán)，72℃延伸5min終止反應。擴增產(chǎn)物用20g／L瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠成像系統(tǒng)攝影。應用Chemi Image 5500自動電泳凝膠成像分析儀測定目標產(chǎn)物與β-actin擴增帶平均灰度值（A），計算目標產(chǎn)物 mRNA表達指數(shù)（I），I＝A產(chǎn)物／Aβ-actin。

5 Western法檢測大鼠支氣管／肺組織粘蛋白MUC5AC表達水平 提取各組大鼠支氣管／肺組織總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。SDS-PAGE凝膠電泳，半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)至PVDF膜。5%脫脂牛奶室溫封閉1h。加一抗稀釋液4℃孵育過夜。TBST緩沖液洗膜后加入二抗稀釋液室溫孵育1h。ECL化學發(fā)光，暗室顯影。

6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13．0軟件包對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 四組大鼠肺組織病理學變化 光鏡下煙霧組大鼠氣管管壁充血水腫明顯，存在廣泛的黏膜上皮脫落、糜爛及潰瘍形成，黏膜內(nèi)杯狀細胞增生肥大，可見大量炎癥細胞浸潤，且呼吸細支氣管、終末細支氣管及肺泡腔擴大，形成小葉中央性肺氣腫，呈COPD改變。單純羅氟司特干預組的肺組織與對照組相比無明顯變化。而煙霧＋羅氟司特組大鼠肺組織以上改變均較煙霧組輕，僅存在少量杯狀細胞增生及少量炎癥細胞浸潤。

2 四組大鼠肺組織MUC5AC免疫組化染色結(jié)果 見圖1。與正常對照組相比，煙霧組MUC5AC的陽性表達率及表達強度明顯增加，單純羅氟司特處理組MUC5AC的表達水平無明顯變化，而煙霧＋羅氟司特組MUC5AC的陽性表達水平雖高于正常對照組，但與煙霧組相比，其表達水平顯著降低。

圖1 各組大鼠肺組織MUC5AC蛋白免疫組化染色結(jié)果A：對照組B：煙霧組C：羅氟司特組D：煙霧 ＋ 羅氟司特組

3 四組大鼠肺組織MUC5AC在mRNA和蛋白水平的表達情況 見表1及圖2～3。PCR結(jié)果顯示：煙霧組中大鼠肺組織中MUC5AC mRNA表達水平明顯高于對照組（P＜0．01）；單純羅氟司特干預組的MUC5AC mRNA的表達水平較對照組低（P＜0．05）；而煙霧＋羅氟司特組的MUC5AC mRNA表達水平雖高于對照組，但與煙霧組相比，其MUC5AC mRNA表達水平明顯降低（P＜0．05）；應用 Western-Blot法檢測各組小鼠肺組織MUC5AC蛋白表達變化情況與mRNA水平變化一致。

表1 各組中MUC5AC和MUC5AC mRNA的含量（±s，n＝6）

表1 各組中MUC5AC和MUC5AC mRNA的含量（±s，n＝6）

注：＊與對照組相比，P＜0．05；＃ 與煙霧組相比，P＜0．05

1．00±0．01 1．00±0．03煙霧組 3．11±0．04＊ 2．27±0．08＊羅氟司特 0．86±0．02＊ 0．49±0．01＊煙霧＋羅氟司特 1．35±0．02＃ 1．68±0．05 MUC5AC MUC5AC mRNA對照組組 別＃

圖2 各組大鼠肺組織MUC5AC mRNA表達水平

圖3 各組大鼠肺組織MUC5AC蛋白表達水平

討 論

近年來 ，關(guān)于哮喘的發(fā)病機制的研究已取得了重要進展，目前認為哮喘是嗜酸粒細胞、肥大細胞和T淋巴細胞等多種炎癥細胞參與的氣管慢性炎癥性疾病，以可逆性氣管阻塞和氣管高反應性為特征［6，7］。COPD氣流受限與呼吸道炎癥密切相關(guān)，呼吸道粘液大量分泌是炎癥反應的結(jié)果，而粘液又是細菌良好培養(yǎng)基，形成惡性循環(huán)加重炎癥反應和氣流阻塞。粘蛋白是粘液的主要組成成分，在肺表達的至少有10種，其中MUC2、MUC5AC、MUC5B為氣管主要的分泌性粘蛋白，通常認為MUC5AC是氣管中主要粘蛋白基因而且是氣道杯狀細胞增生的標志［8］。羅氟司特能夠抑制肺纖維化、氣道重塑、粘液分泌及肺氣腫等［9，10］。Diana等在實驗中發(fā)現(xiàn)羅氟司特顯著抑制了COPD患者痰液中中性粒細胞、嗜酸粒細胞的數(shù)量，細胞因子IL-8、中性粒細胞彈性蛋白酶及嗜酸粒細胞陽離子蛋白水平亦受到明顯抑制；與此同時，評價氣道阻塞程度的重要指標FEV1在治療后獲得了明顯改善，提示羅氟司特促進了疾病緩解［11］。羅氟司特作為第2代選擇性PDE抑制劑的代表，已先后在歐洲、美國批準上市，用于COPD的治療，其對于中重度COPD患者預防急性加重、改善肺功能及提高生存質(zhì)量等方面的作用得到肯定，應用前景廣闊。羅氟司特作為選擇性PDE4抑制劑的優(yōu)勢在于廣泛抑制了COPD患者氣道中各類炎癥細胞的募集、炎癥介質(zhì)、細胞因子、趨化因子及蛋白酶的釋放，從而產(chǎn)生有效的抗炎作用［12］。羅氟司特能抑制人氣管黏液上皮細胞MUC5AC mRNA的表達和粘蛋白的分泌［7］。而且已證實羅氟司特可抑制成纖維細胞趨化及其介導的膠原收縮，還可抑制TNF-a誘導的成纖維細胞釋放前MMP-1、MMP-1及MMP-9增加［13］，以上結(jié)果均提示：PDE4抑制劑可能在氣管壁重塑中起抑制作用。目前國內(nèi)外還沒有報道羅氟司特抑制MUC5AC mRNA的表達和粘蛋白分泌的動物實驗及其發(fā)生機制的研究。本研究通過熏煙法建立COPD大鼠模型，使用免疫組化法，PCR及 Western等測定MUC5AC蛋白含量，煙霧組大鼠肺組織MUC5AC的mRNA及蛋白表達水平明顯升高，而煙霧＋羅氟司特組MUC5AC的表達水平較煙霧組顯著降低。選擇性PDE抑制劑羅氟司特能夠通過降低MUC5AC的水平，從而為COPD的治療提供一個新的靶點。

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