華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科（武漢）

葉 楓 馬曉丹△ 高 雷△ 徐 利△ 侯 鵬△ 吳曉燕△ 伍麗萍△ 施秉銀△

GD是B細(xì)胞介導(dǎo)、T細(xì)胞依賴(lài)的自身免疫性疾病，其發(fā)病機(jī)制主要是針對(duì)TSHR的自身抗體TSAbs模擬TSH作用，與TSH受體結(jié)合，引起甲狀腺腫大、甲狀腺激素釋放增加，最終引發(fā)臨床甲亢。而甲狀腺細(xì)胞合成的各種免疫相關(guān)因子維持甲狀腺內(nèi)的自身免疫過(guò)程［1］。CD80／CD86主要表達(dá)于活化的APC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，與配體CD28／CTLA-4結(jié)合，為T(mén)細(xì)胞活化提供第2信號(hào)；誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1／Th2分化；參與B細(xì)胞增殖活化的調(diào)節(jié)，在自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［2］。本研究主要是通過(guò)Graves病動(dòng)物模型探討CD80／CD86在各組織的表達(dá)及可能的意義。

材料與方法

1 重組腺病毒的構(gòu)建 經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、篩選得到的重組質(zhì)粒pDC316-TSHR289，與重組腺病毒骨架質(zhì)粒pBHGloxdel E13cre共轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，出現(xiàn)噬斑后凍溶細(xì)胞3次，收集上清，經(jīng)鑒定正確后接種293細(xì)胞進(jìn)行大量擴(kuò)增。

2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 將23只6～8周齡SPF級(jí)雌性BALB／c小鼠隨機(jī)分為兩組：對(duì)照組（7只），甲亢組（16只）。飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SPF級(jí)動(dòng)物房，兩組小鼠分別于第1、21天經(jīng)股四頭肌注射50μl包含有1×109顆粒的 Ad-Lacz（對(duì)照組）、Ad-TSHR289（甲亢組）的PBS誘導(dǎo)甲亢。所有小鼠于第2次免疫后兩周摘除眼球采血，脫臼處死。然后固定，剪毛，常規(guī)消毒頸部、腹部皮膚，顯微鏡下逐層剪開(kāi)皮膚、肌肉組織，取一側(cè)甲狀腺置于2ml的無(wú)菌、無(wú)RNA酶的凍存管，放入液氮罐中保存，另一側(cè)甲狀腺置于4%多聚甲醛中固定，用于組織學(xué)觀察。打開(kāi)胸腔、腹腔，取心臟、胸腺、脾臟、肝臟置于2ml的無(wú)菌、無(wú)RNA酶的凍存管，放入液氮罐中保存。

3 小鼠血清TRAb、TT4測(cè)定 以放射免疫法進(jìn)行測(cè)定。

4 甲狀腺組織病理學(xué)檢查 小鼠處死后，分離甲狀腺，4%甲醛固定，石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察。

5 實(shí)時(shí)定量PCR實(shí)驗(yàn) 提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，取八連管，做好標(biāo)記，加入反應(yīng)體系：蒸餾水6μl，SYBR Green Realtime PCR Master Mix 10μl，引物2μl（CD80上游引物：GGCAAGGCAGCAATACCTTA，下 游 引 物：CTCTTTGTGCTGCTGATTCG；CD86上游引物：TCTCCACGGAAACAGCATCT，下游 引 物：CTTACGGAAGCACCCATGAT），cDNA 2μl總量20μl；反應(yīng)條件：PCR擴(kuò)增條件為：預(yù)變性95℃10s，變性95℃5s，復(fù)性55℃15s，延伸72℃15s，40個(gè)循環(huán)?；虮磉_(dá)量通過(guò)計(jì)算2-△△（Ct）得出結(jié)果。在進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)時(shí)，均設(shè)置陰性對(duì)照（即不含任何cDNA模板，但具有所有反應(yīng)試劑的PCR反應(yīng)體系）。瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行參物鑒定。

6 CD86免疫組化及評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

6．1 免疫組化 甲狀腺組織標(biāo)本經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)、3%過(guò)氧化氫室溫15min消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；山羊血清37℃封閉20min后，滴加一抗（1∶200稀釋?zhuān)?℃冰箱過(guò)夜。過(guò)夜后復(fù)溫40min至1h。PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；滴加生物素化二抗，37℃孵育30min，PBS緩沖液沖洗3次，每次5min；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)膠封片；顯微鏡下觀察、分析。

6．2 評(píng)分標(biāo)準(zhǔn) 每個(gè)組織塊評(píng)分由兩部分組成：總分＝陽(yáng)性面積＋強(qiáng)度。陽(yáng)性面積評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，陽(yáng)性濾泡個(gè)數(shù)／總濾泡個(gè)數(shù)＜25%；1分，25%≤陽(yáng)性濾泡個(gè)數(shù)／總濾泡個(gè)數(shù)＜50%；2分，50%≤陽(yáng)性濾泡個(gè)數(shù)／總濾泡個(gè)數(shù)＜75%；3分，陽(yáng)性濾泡個(gè)數(shù)／總濾泡個(gè)數(shù)≥75%。強(qiáng)度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)（選擇陽(yáng)性率最高的濾泡）：0分，陽(yáng)性濾泡上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)／總濾泡上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)＜25%；1分，25%≤陽(yáng)性濾泡上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)／總濾泡上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)＜50%；2分，50%陽(yáng)性濾泡上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)／總濾泡上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)＜75%；3分，陽(yáng)性濾泡上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)／總濾泡上皮細(xì)胞個(gè)數(shù)≥75%。總分：0～1，低表達(dá)或不表達(dá)；2～4，較強(qiáng)表達(dá)；5～6強(qiáng)表達(dá)。

7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組應(yīng)用SPSS13．0統(tǒng)計(jì)軟件包，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 血清T4結(jié)果 以對(duì)照組小鼠血清T4的作為正常上下限（24．92～104．9ng／ml），超過(guò)正常上限視為甲亢（見(jiàn)圖1）。

圖1 對(duì)照組（Ad-LacZ）和造模組（Ad-TSHR289）小鼠血清T4水平 陰影部分代表對(duì)照組小鼠血清T4的，血清T4水平高于上限的小鼠視為甲亢鼠（甲亢組）

2 CD80／CD86在甲狀腺組織中的表達(dá) 既往的研究由于受到藥物干預(yù)以及環(huán)境因素等的影響，關(guān)于CD80／CD86在甲狀腺組織的表達(dá)尚無(wú)統(tǒng)一結(jié)論，我們首先檢測(cè)了CD80／CD86在甲狀腺組織mRNA水平的表達(dá)（見(jiàn)圖2A），我們發(fā)現(xiàn)：CD86mRNA水平表達(dá)在造模組以及甲亢組均明顯增高（P＜0．05），而CD80mRNA水平的表達(dá)在各組間無(wú)顯著性差異（P＞0．05）。造模組及對(duì)照組均有4只小鼠低表達(dá)或不表達(dá)CD86；造模組有9只小鼠而對(duì)照組僅有3只小鼠較強(qiáng)表達(dá)CD86；造模組有3只小鼠高表達(dá)CD86（見(jiàn)圖2B）。造模組CD86的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組明顯升高（P＜0．05），甲狀腺濾泡上皮細(xì)胞CD86也有較強(qiáng)表達(dá)（見(jiàn)圖2C）。

圖2 對(duì)照組、造模組和甲亢組小鼠甲狀腺組織CD80／CD86mRNA以及蛋白水平的表達(dá) 陽(yáng)性染色如箭頭所示：a～c為CD86（×400）；a，低表達(dá)；b，較強(qiáng)表達(dá)；c，強(qiáng)表達(dá)

3 CD80／CD86在其它組織中的表達(dá) 見(jiàn)圖3。與對(duì)照組相比，造模組及甲亢組CD86在肝臟組織的表達(dá)明顯增高（P＜0．05），而在心臟組織、胸腺組織、脾臟組織的表達(dá)無(wú)明顯差異（P＞0．05），CD80在各組織的表達(dá)無(wú)顯著性差異（P＞0．05）。

圖3 對(duì)照組、造模組和甲亢組小鼠不同組織CD80／CD86 mRNA水平的表達(dá)

討 論

B7是分子量為44～54KDa的I型跨膜糖蛋白，屬于丁酰苯受體家族，目前研究較多的是CD80和CD86。CD80、CD86主要表達(dá)于活化的APC細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和B細(xì)胞，兩者結(jié)構(gòu)上都有IgV和IgC區(qū)，具有25%的同源序列，配體均為CD28／CTLA-4，且都通過(guò)與配體結(jié)合為T(mén)細(xì)胞活化提供第二信號(hào)，但兩者無(wú)論是在結(jié)構(gòu)上還是功能上均存在一些區(qū)別［3，4］。①相對(duì)于CD86，CD80與配體的結(jié)合能力較強(qiáng)，它與CTLA-4、CD28結(jié)合的平衡解離常數(shù)（Kd）分別為0．2μM、4μM，而CD86大約弱5～10倍，其 Kd值分別為2．6μM、20μM；②兩者與配體結(jié)合的傾向性不一樣，CD80主要與CTLA-4結(jié)合，下調(diào)T細(xì)胞自身免疫反應(yīng)，在同種異體移植誘導(dǎo)免疫耐受中起著重要作用，而CD86更傾向與CD28結(jié)合，介導(dǎo)T細(xì)胞活化；③表達(dá)時(shí)間不一致，雖然CD80與CTLA-4不是組成性地表達(dá)，但都是在細(xì)胞活化后若干天上調(diào)，CD80可穩(wěn)定表達(dá)4～5d，而CD86與CD28組成性地表達(dá)，在APC活化后迅速上調(diào)，48h達(dá)高峰；④ Th1／Th2分化，CD80和CD86參與誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1／Th2分化，CD80更傾向于誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th1分化，而CD86促進(jìn)IL-4的產(chǎn)生，誘導(dǎo)T細(xì)胞向Th2分化，抑制體內(nèi)CD80表達(dá)會(huì)加重自身免疫反應(yīng)，而抑制體內(nèi)CD86表達(dá)會(huì)減弱自身免疫反應(yīng)。例如：在1型糖尿病小鼠體內(nèi)注射抗CD80抗體可加重病情發(fā)展，而注射抗CD86抗體可阻止該病的發(fā)生。⑤介導(dǎo)B細(xì)胞作用，CD80、CD86在介導(dǎo)B細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中扮演著不同的角色。CD86促進(jìn)B細(xì)胞增殖活化，增加IgG1、IgG2a以及IgE的產(chǎn)生，上調(diào)抗-凋亡分子的表達(dá)，而CD80作用相反。因此，盡管CD80和CD86分子結(jié)構(gòu)同源，而且有著共同的配體，但兩者在免疫反應(yīng)中的作用不同，導(dǎo)致T和B細(xì)胞向不同的方向發(fā)展。

B7-CD28／CTLA-4體內(nèi)的雙向調(diào)節(jié)作用，決定了其在自身免疫性疾病中的重要性。大量研究發(fā)現(xiàn)：B7-CD28／CTLA-4共刺激因子功能異常在自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展以及病生機(jī)制中起著重要作用。在自身免疫性疾病，如：MS、RA、銀屑病以及SLE等患者體內(nèi)均發(fā)現(xiàn)CD80或CD86的高表達(dá)，本研究發(fā)現(xiàn)：Ad-TSHR289干預(yù)組小鼠甲狀腺組織CD86的表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組明顯增高。CD86是體內(nèi)重要的共刺激因子，高表達(dá)于活化的T細(xì)胞、樹(shù)突狀細(xì)胞，在自身免疫性疾病的早期階段起著重要作用，CD86的高表達(dá)可能參與了甲亢的發(fā)病機(jī)制。因此，我們對(duì)比了甲亢鼠與對(duì)照鼠甲狀腺組織CD86的表達(dá)，我們發(fā)現(xiàn)甲亢鼠甲狀腺組織CD86表達(dá)明顯增高，并且血清T4水平與甲狀腺組織CD86的表達(dá)有正相關(guān)趨勢(shì)，這進(jìn)一步表明：CD86在甲亢發(fā)病機(jī)制中的重要性。值得注意的是：在我們的研究中，我們僅發(fā)現(xiàn)CD86明顯增高，并未發(fā)現(xiàn)CD80的增高，這可能與它們?cè)诮閷?dǎo)輔助性T細(xì)胞向Th1和Th2分化中起著不同的作用有關(guān)。Th1和Th2型輔助性T細(xì)胞之間的平衡破壞是GD發(fā)病機(jī)制中一個(gè)很重要的因素。以前也有研究發(fā)現(xiàn)甲亢患者體內(nèi)CD86明顯增高并認(rèn)為CD86在促使甲狀腺組織輔助性T細(xì)胞向Th2分化中起著重要作用［5］，但關(guān)于甲亢到底是Th1還是Th2介導(dǎo)為主的疾病的爭(zhēng)論由來(lái)已久，我們的研究在一定程度上更支持甲亢是Th2介導(dǎo)為主的自身免疫性疾病。另外，Marek［6］等通過(guò)體內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)：T3以及L-T4可增加CD86＋DCs細(xì)胞比例，而對(duì)CD80＋DCs細(xì)胞無(wú)影響，進(jìn)一步表明CD86而不是CD80與GD密切相關(guān)。

既往研究發(fā)現(xiàn)：CD86在急性肝功能衰竭的肝臟組織的多種細(xì)胞中的表達(dá)明顯升高，而且CD86在大面積肝壞死以及肝臟炎性侵潤(rùn)之前就增高了，意味著它們?cè)诟谓M織損傷前就已經(jīng)起到了重要的作用，是肝損傷的潛在危險(xiǎn)因素［7］。本研究也發(fā)現(xiàn)：甲亢組小鼠肝臟組織的CD86表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組明顯增高。因此我們認(rèn)為：甲亢組小鼠肝臟組織的CD86的明顯增高可能是甲亢肝損的潛在危險(xiǎn)因素，當(dāng)然這還需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

總之，我們的研究發(fā)現(xiàn)造模組和甲亢組小鼠甲狀腺組織高表達(dá)CD86，認(rèn)為CD86可能參與了GD的發(fā)病機(jī)制。同時(shí)肝臟組織的CD86的上調(diào)可能是甲亢引起肝臟損傷的潛在危險(xiǎn)因素。

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