陜西省人民醫(yī)院西院二病區(qū) （西安710068） 劉延梅 馬少君 苗 青 尙 亮

肺纖維化是多種原因引起的慢性肺間質(zhì)疾病共同的病理變化，是肺組織對(duì)損傷的一種動(dòng)態(tài)的病理修復(fù)過程，其病理特點(diǎn)為肺泡上皮細(xì)胞損傷，引起細(xì)胞外基質(zhì)過度沉積，最終導(dǎo)致肺組織異常結(jié)構(gòu)重塑［1］。但是其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，臨床上缺乏有效的治療手段。糖皮質(zhì)激素是傳統(tǒng)的抗肺纖維化藥物，普遍應(yīng)用于肺纖維化疾病的治療，但療效欠佳，且長期使用副作用較大，尋找新的治療手段是目前研究的熱點(diǎn)［2，3］。干細(xì)胞由于他特殊的免疫學(xué)特征，如低免疫原性和免疫調(diào)節(jié)功能，可能通過多靶點(diǎn)對(duì)免疫細(xì)胞亞群進(jìn)行調(diào)節(jié)從而逆轉(zhuǎn)自身免疫應(yīng)答的紊亂，其多向分化的潛能有助于損傷肺泡結(jié)構(gòu)的修復(fù)，為肺纖維化的治療帶來了希望的曙光［4］。川穹嗪，學(xué)名2，3，5，6-四甲基吡嗪（Tetramethylpyrazine，TMP），已有研究報(bào)道川穹嗪可以抑制纖維細(xì)胞的分裂、增殖，降低血漿內(nèi)皮素含量，調(diào)節(jié)血栓素 A2（TXA2）前列腺素I2（PGI2）平衡等而抑制膠原生成［5］，因此提示，川穹嗪具有抗纖維化的作用。本研究首先建立了博萊霉素（Bleomycin，BLM）誘導(dǎo)肺纖維化，然后通過干細(xì)胞（Embryonic stem cell，ESC）和TMP聯(lián)合治療肺纖維化，探討治療肺纖維化的可行性。

材料與方法

1 主要試劑 BLM哈爾濱博萊制藥有限公司產(chǎn)品。羥脯氨酸（Hydroxyproline，Hyp）標(biāo)準(zhǔn)品，分析純，中國科學(xué)院生物物理所中生公司產(chǎn)品。雄性小鼠來源的S8胚胎干細(xì)胞，由西安交通大學(xué)發(fā)育生物學(xué)教研室提供。制成濃度1．0×106／ml的單細(xì)胞作為供體。小鼠抗大鼠MMP-2、小鼠抗大鼠MMP-9、小鼠抗大鼠GAPDH單克隆抗體，均為美國Abcam公司產(chǎn)品。辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗小鼠抗體，美國Millipore公司產(chǎn)品?；瘜W(xué)發(fā)光底物，美國Millipore公司產(chǎn)品。十二烷基硫酸鈉（Sodium dodecylsulfate，SDS）和40%聚丙烯酰胺（Polyacrylamide），美國Amresco公司產(chǎn)品。其他化學(xué)試劑為國產(chǎn)分析純。

2 動(dòng)物分組與肺纖維化模型制備 SPF級(jí)Wistar雌性大鼠50只，體質(zhì)量180±20g，購買并飼養(yǎng)于西安交通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲食。50只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組（10只）和模型組（40只）。10%水合氯醛腹腔內(nèi)注射麻醉，將大鼠仰位固定于操作臺(tái)，備皮，無菌條件下縱向剪開頸部皮膚分離肌肉，暴露氣管，用1ml注射器向氣管內(nèi)一次性滴注BLM（8．5 mg／kg）或同體積的生理鹽水，立即拔除針頭，將動(dòng)物直立旋轉(zhuǎn)1～2min，使藥液盡可能到達(dá)兩側(cè)肺部并均勻分布，縫合皮膚，常規(guī)飼養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組（A組，注射生理鹽水組）10只；肺纖維化模型組（B組）10只，氣管內(nèi)注入BLM；ESC治療組（C組）10只，于氣管內(nèi)注入BLM后，3日后通過尾靜脈給予ESC 1．0×106／ml DMEM 培養(yǎng)液1ml；TMP治療組（D組）10只，于氣管內(nèi)注入BLM后，3d后通過尾靜脈給予 TMP 100mg／kg；聯(lián)合治療組（E 組）10只，于氣管內(nèi)注入BLM后，3d后通過尾靜脈給予ESC 1．0×106／ml DMEM 培養(yǎng)液1ml，之后進(jìn)行尾靜脈注射TMP 100mg／kg。以肺纖維化化模型組出現(xiàn)大鼠死亡為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)。

3 肺組織病理學(xué)染色 各取5組大鼠的右肺中葉組織，置入4%低聚甲醛中固定，經(jīng)乙醇梯度脫水，二甲苯透明2次，石蠟包埋，切片厚度3μm，進(jìn)行HE染色。

4 肺組織Hyp含量測(cè)定 采用鹽酸水解法進(jìn)行Hyp含量的測(cè)定，具體方法如下：稱取100mg濕肺組織，4℃勻漿，加入12mol／L HCl，105℃水解18h，過濾，取100μl水解液，40℃烘干。同時(shí)取Hyp標(biāo)準(zhǔn)液樣品0．2～1．6μg設(shè)為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，用氯胺T溶液0．2 ml和歐氏液［含25%（w／v）對(duì)二甲基氨基苯甲醛和27．3%（v／v）高氯酸異丙醇溶液］反應(yīng)，50℃水浴90 min，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照樣品于波長558nm處的吸光度值（A558），計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線。同上方法測(cè)定肺組織樣本A558值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣本Hyp含量，用肺組織濕重予以校正。Hyp含量單位：μg／mg。

5 Western blot檢測(cè)肺組織 MMP-2與 MMP-9蛋白的表達(dá) 采用蛋白印跡法檢測(cè)MMP-2和MMP-9的表達(dá)，其具體步驟為：提取肺組織總蛋白，取30μg總蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺變性凝膠電泳。電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用脫脂奶粉封閉，分別與特異性抗大鼠抗體進(jìn)行孵育（MMP-2，1∶1000；MMP-9，1∶500），充分洗滌后孵育辣根過氧化物酶偶聯(lián)抗小鼠抗體，ECL化學(xué)發(fā)光，X線攝片。將同一張蛋白印跡膜曝光后，用0．5%SDS洗脫抗體，再用GAPDH進(jìn)行孵育雜交以作為內(nèi)參照。每項(xiàng)實(shí)驗(yàn)重復(fù)檢測(cè)3批以上的不同樣本。

6 采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組大鼠肺組織的細(xì)胞凋亡率 其步驟如下：稱取10mg濕肺組織，剪碎該組織，采用膠原酶于37℃進(jìn)行4h的消化，然后利用400目篩網(wǎng)過濾細(xì)胞，按照羅氏細(xì)胞凋亡試劑盒操作方法進(jìn)行染色，并在BeckmanEpics-XL檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

7 Masson染色 Masson染色法選用福州邁新公司出廠的染色試劑盒進(jìn)行。試劑A：Masson復(fù)合染色液，試劑B：分化液，試劑C：1%磷鉬酸水溶液，試劑D：2%苯胺藍(lán)染液，按說明書進(jìn)行操作。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本組數(shù)據(jù)全部采用SPSS11．5軟件做統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)間采用單因素方差分析，兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 各組大鼠體質(zhì)量及肺組織Hyp含量的變化見圖1。正常對(duì)照組大鼠體質(zhì)量逐漸增加明顯（301．3±14．1g），活動(dòng)自如，毛發(fā)光亮，造模過程中無死亡，其肺組織內(nèi) Hyp的含量為1．69±0．19μg／mg。未治療肺纖維化模型組大鼠體質(zhì)量增加緩慢（179．7±15．8 g），活動(dòng)較少，眼睛無神，毛發(fā)無光澤，于實(shí)驗(yàn)第3周時(shí)開始死亡，其肺組織內(nèi)Hyp的含量顯著升高為2．27±0．26μg／mg；ESC與川穹嗪聯(lián)合治療組模型組大鼠，隨著時(shí)間的延長，其質(zhì)量逐漸增加（298．7±16．2g），未出現(xiàn)死亡，其肺組織內(nèi)Hyp的含量略有升高（1．74±0．14μg／mg）。而單治療組其體質(zhì)量增加緩慢，其肺組織內(nèi)Hyp的含量的升高介于正常組和模型組之間。

圖1 肺纖維化大鼠體質(zhì)量與肺組織Hyp含量的變化 A）大鼠體質(zhì)量的測(cè)定；B）大鼠Hyb含量的測(cè)定；＊＊P＜0．05

圖2 肺纖維化形成過程中大鼠肺組織病理學(xué)的變化（HE染色×200）A正常組；B肺纖維化組；CESC組；DTMP組；E ESC與TMP治療組

圖3 肺纖維化治療后大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的變化 A正常組；B肺纖維化組；C ESC組；D TMP組；E ESC與TMP治療組

2 大鼠肺組織的病理學(xué)變化 見圖2。正常對(duì)照組大鼠肺組織肺泡結(jié)構(gòu)正常。模型組大鼠處死后肺泡間隔增厚，肺泡壁與肺泡腔內(nèi)均可見大量炎細(xì)胞，以粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞為主，其肺泡結(jié)構(gòu)破壞，形成嚴(yán)重的肺纖維化。而ESC與TMP雙治療組，其形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常，雖可見粒細(xì)胞、炎細(xì)胞等，但是其形態(tài)結(jié)構(gòu)尚可，足以維持其正常的肺組織結(jié)構(gòu)，根據(jù)此結(jié)果可以推斷，ESC與TMP在體內(nèi)有效的抑制了肺纖維化。

3 大鼠肺組織細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 取新鮮的肺組織，首先對(duì)組織進(jìn)行剪碎，然后用膠原酶進(jìn)行消化，按照試劑盒說明書進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)，與正常對(duì)照組大鼠比較，肺纖維化化組的肺細(xì)胞凋亡明顯增高，高達(dá)48．3%，而經(jīng)ESC和TMP聯(lián)合作用后，其細(xì)胞凋亡率明顯下降至2．25%。而其他組的細(xì)胞均有一定的凋亡或死亡。

4 大鼠肺組織MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)的變化見圖4。正常對(duì)照組大鼠肺組織中均能檢測(cè)到有MMP-2與MMP-9蛋白的表達(dá)。而在處死肺纖維化組的肺組織中，明顯檢測(cè)到了MMP-2與MMP-9蛋白的表達(dá)量的增高，而單治療組頁檢測(cè)到 MMP-2與MMP-9蛋白的提高。雙治療組，其MMP-2與MMP-9的表達(dá)水平與對(duì)照組基本抑制。

5 大鼠肺組織的Masson染色結(jié)果 在不同大鼠處理組中，切取肺組織，常規(guī)石蠟包埋，切片，行MASSON染色觀察肺纖維化程度，從圖5中可知：雙治療組中，其Masson染色的結(jié)果顯示，其肺纖維化明顯抑制，與對(duì)照組基本一致。

圖4 各組大鼠肺組織中MMP-2與MMP-9蛋白表達(dá)的變化 1正常組；2肺纖維化組；3ESC組；4TMP組；5ESC與TMP雙治療組

圖5 各組大鼠肺組織中Masson染色結(jié)果 1正常組；2肺纖維化組；3ESC組；4TMP組；5ESC與TMP雙治療組

討 論

肺纖維化是由多種病因引起的肺泡間質(zhì)性炎癥繼以肺泡結(jié)構(gòu)進(jìn)行性損害、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白膠原沉積為特征的慢性炎癥性疾?。?］。其基本病理變化是一個(gè)由肺泡炎、大量的膠原增生而發(fā)展為肺間質(zhì)纖維化的過程，早期表現(xiàn)為脫屑性問質(zhì)性肺炎和肺泡Ⅱ型細(xì)胞增生，晚期表現(xiàn)為肺間質(zhì)纖維化和蜂窩肺［7］。目前肺纖維化的治療以糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑為主，但治療反應(yīng)差，且副作用較大，多數(shù)患者不能耐受長期用藥［2，3］，因此，深入研究其發(fā)病機(jī)制與防治措施具有重要的理論意義與臨床價(jià)值。

本實(shí)驗(yàn)采用博來霉素氣管內(nèi)誘導(dǎo)大鼠肺纖維化形成，然后采用ESC和TMP分別（聯(lián)合）治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，接受ESC與TMP聯(lián)合治療后，肺纖維化模型大鼠的體質(zhì)量增加，狀態(tài)良好；肺羥脯氨酸含量明顯降低；肺臟病理檢查顯示肺組織炎癥程度降低，結(jié)構(gòu)破壞減輕。流式細(xì)胞結(jié)果顯示細(xì)胞凋亡指數(shù)降低，其核心蛋白MMP-2和MMP-9的表達(dá)明顯下調(diào)。

川穹嗪是從傘形科蒿木屬植物根莖的川穹中提取出的主要有效成分，在臨床上具有活血化瘀，抗血小板凝集，擴(kuò)張小動(dòng)脈，改善微循環(huán)，抗氧化，拮抗鈣離子等作用［8～11］。此外川穹嗪能夠防治藥物所致肺纖維化，可減少內(nèi)皮細(xì)胞通透性和細(xì)胞因子的分泌，抗自由基，抑制成纖維細(xì)胞的增殖和膠原的合成［12］。本研究通過HE染色檢測(cè)到經(jīng)川穹嗪治療后，肺間質(zhì)細(xì)胞內(nèi)的炎癥細(xì)胞明顯減少，其形態(tài)結(jié)構(gòu)趨于正常，進(jìn)一步改善了大鼠的生存質(zhì)量。

干細(xì)胞具有高度的分化潛能，在重建器官功能方面具有特殊的優(yōu)勢(shì)，這一點(diǎn)正在糖尿病、心臟、肝臟、腎臟、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病中受到越來越多的研究關(guān)注［13～17］。有學(xué)者研究干細(xì)胞對(duì)肺纖維化的治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠接受博來霉素暴露后，靜脈給予間充質(zhì)干細(xì)胞，肺組織的羥脯氨酸含量減少［18，19］。提示干細(xì)胞治療有利于減輕肺纖維化。胚胎干細(xì)胞從早期的胚泡中分離培養(yǎng)，可以增殖許多代而仍然保持未分化狀態(tài)，從而能在實(shí)驗(yàn)室里大量生產(chǎn)。而且ESC取材方便且體外易于分離培養(yǎng)，對(duì)機(jī)體損傷小，免疫原性弱，組織相容性好，因此本試驗(yàn)選擇胚胎干細(xì)胞作為治療用干細(xì)胞的來源。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)博來霉素處理的肺纖維化小鼠，經(jīng)靜脈給予間充質(zhì)干細(xì)胞，其肺組織的羥脯氨酸含量減少，其肺功能得到明顯恢復(fù)［18，19］。該研究結(jié)果提示：采用干細(xì)胞治療有利于減輕肺纖維化。另有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，在損傷肺組織中，注射干細(xì)胞能明顯抑制基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）的活性，減少組織中膠原的沉積，有利于減輕肺損傷［20］。本實(shí)驗(yàn)中ESC與TMP雙治療組中HYP含量較模型組明顯減少，MMP-2與MMP-9明顯抑制，表明組織中膠原沉積減少，從而明顯改善肺纖維化。

較傳統(tǒng)治療方法而言，ESC具有不可比擬的優(yōu)勢(shì)，但對(duì)ESC的研究大多處于實(shí)驗(yàn)室階段。我們的研究亦進(jìn)一步證實(shí)了ESC聯(lián)合TMP能夠減輕博萊霉素誘導(dǎo)的大鼠肺纖維化，且通過尾靜脈注射的方式可以達(dá)到該療效，其可能與局部微環(huán)境互相影響，如影響MMP-2、MMP-9等重要的致纖維化的細(xì)胞因子的合成或釋放、Hyb的合成等相關(guān)，其具體的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制有待我們進(jìn)一步研究。隨著對(duì)ESC及TMP生物學(xué)特性的深入了解和探索，該方法將會(huì)對(duì)人類疾病的治療起到巨大的推進(jìn)作用。

［1］ Thannickal VJ，Toews GB，White ES，etal．Mechanisms of pulmonary fibrosis［J］．Annu Rev Med，2004，55：395-417．

［2］ Uruga H，Hanada S，Kishi K．Prednisone，azathioprine，and N-acetylcysteine for pulmonary fibrosis［J］．N Engl J Med，2012，367（9）：870-871．

［3］ Izumi S，Iikura M，Hirano S．Prednisone，azathioprine，and N-acetylcysteine for pulmonary fibrosis［J］．N Engl J Med，2012，367（9）：870-871．

［4］ Chua F，Gauldie J，Laurent GJ．Pulmonary fibrosis：searching for model answers［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2005，33（1）：9-13．

［5］ Zeng Z，Zhu W，Zhou X，etal．Tetramethylpyrazine，a Chinese drug，blocks coronary vasoconstriction by endothelin-1 and decreases plasma endothelin-1levels in experimental animals［J］．J Cardiovasc Pharmacol，1998，31（Suppl 1）：S313-316．

［6］ Cook DN，Brass DM，Schwartz DA．A matrix for new ideas in pulmonary fibrosis［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2002，27（2）：122-124．

［7］ Noble PW，Barkauskas CE，Jiang D．Pulmonary fibrosis：patterns and perpetrators［J］．J Clin Invest 2012，122（8）：2756-2762．

［8］ Hsieh SC，Lin IH，Tseng WL，etal．Prescription profile of potentially aristolochic acid containing Chinese herbal products：an analysis of national health insurance data in Taiwan between 1997and 2003［J］．Chin Med，2008，3（1）：13-15．

［9］ Wang SL，Lin Y，Tang ZY．Research progress on the protection of tetramethylpyrazine in different kinds of damage of nervous system and its mechanisms［J］．Chinese Pharmacological Bulletin，2010，26（4）：438-442．

［10］ Hu JZ，Huang JH，Xiao ZM，etal．Tetramethylpyrazine accelerates the function recovery of traumatic spinal cord in rat model by attenuating inflammation［J］．J Neurol Sci，2013，324（1-2）：94-99．

［11］ Tang Q，Han R，Xiao H，etal．Neuroprotective effects of tanshinone IIA and／or tetramethylpyrazine in cerebral ischemic injury in vivo and in vitro［J］．Brain Res，2012，1488（1）：81-91．

［12］ Zhang JH，Tu ml，Lei HD，etal．The effect of N-acetylcysteine and tetramethylpyrazine on bleomycin-induced pulmonary fibrosis and TGF-β［J］．Journal of Hubei Medical College，2006，25（5）：71-72．

［13］ Guo Z，Zhou X，Li J，etal．Mesenchymal stem cells reprogram host macrophages to attenuate obliterative bronchiolitis in murine orthotopic tracheal transplantation［J］．Int Immunopharmacol，2013，15（4）：726-734．

［14］ Gupta K，Hergrueter A，Owen CA．Adipose-derived stem cells weigh in as novel therapeutics for acute lung injury［J］．Stem Cell Res Ther，2013，4（1）：19-21．

［15］ Puri MC，Nagy A．Concise review：Embryonic stem cells versus induced pluripotent stem cells：the game is on［J］．Stem Cell，2012，30（1）：10-14．

［16］ Williams LA，Davis-Dusenbery BN，Eggan KC．Snap-Shot：directed differentiation of pluripotent stem cells［J］．Cell，2012，149（5）：1171-1174．

［17］ Stripp BR，Shapiro SD．Stem cells in lung disease，repair，and the potential for therapeutic interventions：State-of-the-art and future challenges［J］．Am J Respir Cell Mol Biol，2006，34（5）：517-518．

［18］ Neuringer IP，Randell SH．Stem cells and repair of lung injuries［J］．Respir Res，2004，5：6-14．

［19］ Banerjee ER，Laflamme MA，Papayannopoulou T，et al．Human embryonic stem cells differentiated to lung lineage-specific cells ameliorate pulmonary fibrosis in a xenograft transplant mouse model［J］．PLoS One，2012，7（3）：33165．

［20］ Ortiz LA，Gambelli F，McBride C，etal．Mesenchymal stem cell engraftment in lung is enhanced in response to bleomycin exposure and ameliorates its fibrotic effects［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2003，100（14）：8407-8411．