周紅玲 劉 陽

（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院 湖南 株洲 412000）

婦科沖洗粉為我院婦科中醫(yī)醫(yī)師潛心研制的復(fù)方中藥制劑，由蛇床子、馬鞭草、地膚子等中藥所組成。該制劑具有清熱燥濕，殺蟲止癢。用于皮膚瘙癢，婦女陰癢等治療。本方為外用藥，先用開水適量浸泡30分鐘后去渣坐浴。該制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)有專屬性不強(qiáng)的化學(xué)鑒別和重現(xiàn)性差的蛇床子薄層色譜鑒別，因此對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行重新研究。本方中馬鞭草為馬鞭草科植物馬鞭草Verbena officinalis L.的干燥地上部分［1］，其主要有效成分為熊果酸，具有抗炎、抗菌和抗病毒的作用；蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri（L.）Cusson的果實(shí)［1］，其主要有效成分蛇床子素具有溫腎壯陽，燥濕，祛風(fēng)，殺蟲等作用。為有效對(duì)該制劑進(jìn)行質(zhì)量控制，本文建立薄層色譜法鑒定馬鞭草，并建立HPLC法控制方中主要有效成分蛇床子素的含量。

1 儀器與試藥

LC-10ATvp高效液相色譜儀（日本島津公司），SPD-10Avp紫外檢測(cè)器（日本島津公司），N2000色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息工程研究所），薄層色譜掃描影像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司），KQ3200型超聲波清洗器（功率300W，頻率50kHz，昆山市超聲儀器有限公司）。

對(duì)照藥材：馬鞭草（批號(hào)：121002-200703，中國藥品生物制品鑒定所）；

對(duì)照品：熊果酸（批號(hào)：110742-200516，中國藥品生物制品鑒定所）；蛇床子素（批號(hào)：110822-200305，中國藥品生物制品鑒定所）；

婦科沖洗粉（湖南中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校附屬第一醫(yī)院，60g／袋，批號(hào)：110505、110918、111105）；乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑為分析純。

2 薄層色譜方法與結(jié)果

取本品5g，加80%甲醇60ml，加熱回流1小時(shí)，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)蛹状?ml使溶解，作為供試品溶液。另取馬鞭草對(duì)照藥材1g，同法制成對(duì)照藥材溶液。再取熊果酸對(duì)照品，加甲醇制成每1ml含1mg的溶液，作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法（中國藥典2010年版一部附錄ⅥB）試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各1μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-二氯甲烷-乙酸乙酯-冰醋酸（20∶5∶8∶0.1）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（365nm）下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜和對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。結(jié)果見圖1。

3 蛇床子素含量測(cè)定方法與結(jié)果

3.1 液相色譜條件：色譜柱：Hpersil BDS C18（200mm×4.6mm×5μm）；流動(dòng)相：乙腈-水（55∶45）；流速：1.0mL·min-1；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：322nm；進(jìn)樣量：10μl。

3.2 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取經(jīng)五氧化二磷減壓干燥12小時(shí)的蛇床子素對(duì)照品10.54mg，置50ml量瓶中，用乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得濃度為0.211mg·ml-1蛇床子素對(duì)照品溶液，精密吸取上述溶液5ml置25ml容量瓶中，用乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得濃度42.2μg·ml-1蛇床子素對(duì)照品溶液。

3.3 供試品溶液的制備：取本品粉末約0.7g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定重量，超聲處理（功率300W，頻率50kHz）30分鐘，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，0.45μm微孔濾膜過濾，即得。

3.4 提取溶劑的選擇：分別用乙醇、乙酸乙酯作為提取溶劑照上法平行處理。精密吸取對(duì)照品溶液（42.2μg·ml-1）與供試品溶液各10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，并計(jì)算，結(jié)果見表1。結(jié)果表明，不同的提取溶劑對(duì)樣品中蛇床子素鈉的含量有影響，其中甲醇和乙酸乙酯較高，考慮色譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)中理論塔板數(shù)、分離度和對(duì)稱因子三個(gè)參數(shù)的結(jié)果，故選擇甲醇作為最佳提取溶劑。

表1 提取溶劑的選擇

3.5 陰性對(duì)照溶液的制備：按婦科沖洗粉制法制成缺蛇床子的陰性樣品，按3.3項(xiàng)下同法制成陰性對(duì)照溶液。

3.6 方法學(xué)考察

3.6.1 專屬性考察：分別精密吸取3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液、3.3項(xiàng)下供試品溶液以及3.5項(xiàng)下陰性對(duì)照溶液各10μl，注入液相色譜儀，結(jié)果顯示，陰性對(duì)照溶液對(duì)測(cè)定結(jié)果無干擾，見圖2-4。

3.6.2 線性關(guān)系考察：精密吸取對(duì)照品溶液（0.211mg·ml-1）1.0ml、2.0ml、4.0ml、6.0ml、8.0ml置25mL量瓶中，加入乙醇稀釋至刻度，搖勻，即得（含蛇床子素）濃度分別為8.4μg·ml-1、16.9μg·ml-1、33.8μg·ml-1、50.6μg·ml-1、67.5μg·ml-1的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別精密吸取上述各溶液10μl注入液相色譜儀，測(cè)定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，濃度為（μg·ml-1）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程為：Y=17102519.02X-6640.20，R=0.9999（n=5）。結(jié)果表明：蛇床子素鈉對(duì)照品在8.4～67.5μg·ml-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.6.3 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批號(hào)（批號(hào)：110505）樣品細(xì)粉6份，照3.3項(xiàng)下方法平行操作，精密吸取對(duì)照品溶液（42.2μg·ml-1）及上述供試品溶液10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果蛇床子素平均含量為0.14%（g／g），RSD=0.97%，結(jié)果表明該方法的重復(fù)性較好。

3.6.4 準(zhǔn)確度試驗(yàn)：取已測(cè)定含量的同一批號(hào)（批號(hào)：110505）樣品細(xì)粉（含蛇床子素1.48mg／g）6份，約0.35g，精密稱定，置25ml量瓶中，精密加入對(duì)照品溶液（42.2μg·ml-1）12.5ml，照供3.3項(xiàng)下方法平行操作，精密吸取10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果平均回收率為97.88%，RSD=0.94%，表明本方法回收率結(jié)果良好，見表2。

3.6.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)：取4.3項(xiàng)下同一供試品溶液（批號(hào)：110505），分別于配制后的0、2、4、8、12小時(shí)，精密吸取10μl，注入液相色譜儀，測(cè)定，結(jié)果RSD為1.45%，表明供試品溶液在配制后12小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。

3.7 樣品含量測(cè)定：分別吸取3.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液和3.3項(xiàng)下供試品溶液注入液相色譜儀，按2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并按外標(biāo)法計(jì)算蛇床子素的含量，結(jié)果3批樣品含量結(jié)果見表3，根據(jù)以下結(jié)果確定婦科沖洗粉中蛇床子素含量不得低于1.30mg／g。

表2 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果表

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

4 討論

4.1 蛇床子素（歐芹酚甲醚）為香豆素類化合物，不溶于水和石油醚，易溶于甲醇、丙酮和氯仿等溶劑，為獲得最大提取率，并且結(jié)合試劑的毒性大小，本文考慮用毒性較小的甲醇、乙醇和乙酸乙酯作為提取溶劑，試驗(yàn)結(jié)果表明甲醇和乙酸乙酯提取的蛇床子素含量相近并高于乙醇，但乙酸乙酯因?yàn)榉逍桶?，色譜系統(tǒng)評(píng)價(jià)參數(shù)中理論塔板數(shù)明顯低于甲醇，且對(duì)稱性較差，因此綜合上述考慮，選擇甲醇作為最佳提取溶劑。

4.2 原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中化學(xué)鑒別專屬性較差，蛇床子的薄層色譜鑒別重現(xiàn)性較差，通過本研究改進(jìn)，用馬鞭草對(duì)照藥材和熊果酸對(duì)照品同時(shí)對(duì)本方中君藥馬鞭草進(jìn)行定性鑒別，用高效液相色譜法對(duì)君藥蛇床子中主要有效成分蛇床子素進(jìn)行定量控制，且方法簡(jiǎn)便，準(zhǔn)確性和重現(xiàn)性較好，為有效控制婦科沖洗粉的質(zhì)量提供定性定量的依據(jù)。

［1］ 中華人民共和國國家藥典委員會(huì)，中國藥典［S］.一部.中國醫(yī)藥科技出版社，2010

［2］ 董文桑，劉蓉，瞿發(fā)林.HPLC法測(cè)定鎮(zhèn)痛寧膠囊中蛇床子素含量［J］.中國藥師，2009，12（6）：829-830

［3］ 唐勇，周春菊.高效液相色譜法測(cè)定陰炎凈洗液中蛇床子素含量［J］.中國藥業(yè)，2008，17（21）：36

［4］ 李小安，張軍科，史美佳，等.HPLC法同時(shí)測(cè)定阿娜爾婦潔液中蛇床子素和歐前胡素的含量［J］.西北藥學(xué)雜志，2008，23（3）：139-141