彭靜靜

(泰山學院生物與釀酒工程學院，山東 泰安271021)

農業(yè)廢棄物是指農業(yè)生產和農副產品加工后的剩余物，主要包括農作物或果樹的秸稈或枝條、雜草、落葉、果實外殼、玉米芯、甘蔗渣、麥麩皮、玉米麩等，其主要化學成份是纖維素、半纖維素、木質素等，是亟待開發(fā)的重要可再生資源［1］。中國是一個農業(yè)大國，每年秸稈產量達6.7×108t，占世界秸稈總產量的20% ～30%［2］。開發(fā)利用這一大類半纖維素資源具有一定的經濟效益和社會效益。利用富含木聚糖類半纖維素的農業(yè)廢棄物提取木糖(生產木糖醇)和制備低聚木糖的研究已成為當前該領域的研究前沿。

研究發(fā)現(xiàn)，來自嗜熱厭氧乙醇菌(Thermoanae robacter ethanolicusJW200)的阿拉伯/木糖苷酶，以人工底物測試，其木糖苷酶活性和阿拉伯糖苷酶活性分別為180 IU/mg和1 000 IU/mg，遠遠高于其他木糖苷酶或阿拉伯糖苷酶所顯示的活性［3］。疏棉狀嗜熱絲孢菌(Thermomyces lanuginosusDSM 5826)所產生的木聚糖酶A(XynA)屬于G/11 家族，具有較好的熱穩(wěn)定性，在高溫和堿性條件下有效且穩(wěn)定，沒有纖維素活性，具有極大的工業(yè)化應用前景。該木聚糖酶優(yōu)先降解高聚合度的木聚糖鏈，產物是不同聚合度的低聚木糖，不產生木單糖，這對于生產低聚木糖具有很好的應用價值［4］。

同時使用多種自然克隆到的特異水解某一多糖結構的水解酶來降解木聚糖，雖然清潔高效，但工序復雜，成本高。在不改變酶自身優(yōu)良性質的條件下，如果將有關的水解酶融合串聯(lián)成一個具有多種水解酶活性的多功能酶，或通過融合標簽回收重復利用酶，來提高融合酶的綜合效率，這將大大簡化工序和降低成本［5-6］。

pHsh 及其衍生質粒是近年發(fā)展起來的新型大腸桿菌表達載體，其調控外源基因表達的原理不同于其他表達系統(tǒng)，并且具有表達水平高、成本低廉等特點［7］。本研究用pHsh 作為表達載體，將嗜熱厭氧乙醇菌的雙活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)和來源于疏棉狀嗜熱絲孢菌的木聚糖酶A(XynA)進行基因融合，期望得到多功能酶的融合表達質粒pHsh-xarB-xynA，為工業(yè)化酶法降解半纖維素提供有效的技術路線。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜熱厭氧乙醇菌(T.ethanolicusJW200)編號ATCC31550，由美國佐治亞大學微生物系Wiegel 教授分離并惠贈。采用厭氧培養(yǎng)基培養(yǎng)，69 ℃靜置培養(yǎng)8 h［8-9］。大腸桿菌為Escherichia coliJM109 (購自Promega 公司)。采用Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基:胰蛋白胨10 g/L，酵母膏5 g/L，NaCl 10 g/L，2%的瓊脂粉。

含有疏棉狀嗜熱絲孢菌(T.lanuginosusDSM 5826)木聚糖酶A(XynA)基因的質粒pHsh-xynA2由本實驗早期構建并保存。質粒pHsh 屬于熱激表達載體，由大腸桿菌σ32因子調控，包括一個熱激啟動子和終止子，通過熱激誘導外源基因表達［10-12］。

1.2 方法

1.2.1 基因操作

1.2.1.1 重組質粒pHsh-xarB的構建 嗜熱厭氧乙醇菌(T.ethanolicusJW200)基因組提取與DNA操作采用分子克隆技術標準方法進行。用電轉化方法進行質粒轉化，質粒和PCR 產物采用Qiagen plasmid kit 和PCR purification kit(Qiagen USA)純化。

根據GenBank 中T.ethanolicusJW200 雙活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)的基因序列(GenBank 登錄號AF135015)設計引物xarB-N 和xarB-C。xarBN:5'-GCAAGCCATTATATTTAGATTC-3';xarB-C:5'-CCCCTCGAGCTATTTATTCTCTACCCTTAC -3';下劃線為XhoI 酶切位點;

以提取的嗜熱厭氧乙醇菌的基因組為模板，利用相應的上下游引物擴增基因xarB。為提高所擴增片段的保真性，用Pyrobest DNA 聚合酶對模板進行擴增。反應體系(50 μl):10×Buffer 5 μl;dNTP(每種堿基各2.5 mmol/L)4 μl;xarB-N(50 μmol/L)1 μl;xarB-C(50 μmol/L)1 μl;模板(10 μg/ml)1 μl;Pyrobest DNA polymerase(1.25 U/μl)1 μl;H2O 37 μl。95 ℃變性5 min，加Pyrobest DNA 聚合酶1 μl;然后94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，循環(huán)30 次后，72 ℃保溫10 min。

PCR 產物驗證正確后過柱純化，用XhoI 進行單酶切，并與經XhoI 和平端酶StuI 雙酶切的質粒pHsh 16 ℃下連接6 ～12 h，將連接液電擊轉化至E.coliJM109 中，挑取陽性克隆，提取并驗證質粒，所得質粒命名為pHsh-xarB，雙酶切驗證正確的質粒送上海美吉生物技術公司測序。

1.2.1.2 重組質粒pHsh-xarB-xynA的構建 根據GenBank 中T.lanuginosusDSM 5826 木聚糖酶A(XynA)基因序列(GenBank 登錄號U35436)以及本實驗室最終優(yōu)化的pHsh-xynA2的木聚糖酶A(XynA)基因序列，設計引物xynA-N 和xynA-C。xynAN: 5'-CAGACTACCCCGAACAG-3'; xynA-C: 5'-CATATGTTTTTCTCCTTCTTG-3'。

以pHsh-xynA2為模板，利用相應的上下游引物xynA-N 和xynA-C 進行PCR，擴增出線性pHsh-xynA2，以測序正確的pHsh-xarB為模板，以xarB-N 和xarB-C 為引物擴增出xarB，并將其磷酸化處理，之后與線性pHsh-xynA2進行連接反應，轉化連接液至E.coliDH 10B，得到重組質粒pHsh-xarB-xynA，酶切驗證正確的質粒送上海美吉生物技術公司測序。

擴增線性pHsh-xynA2時，為提高所擴增片段的保真性，用Pyrobest DNA 酶對模板進行擴增。反應體系50 μl:10 ×Buffer 5 μl;dNTP(每種堿基各2.5 mmol/L)4 μl;xynA-N(50 μmol/L)1 μl;xynA-C(50 μmol/L)1 μl;模板(10 μg/ml)1 μl;Pyrobest DNA polymerase(1.25 U/μl)1 μl;H2O 37 μl。95 ℃變性5 min，加Pyrobest DNA 聚合酶1 μl;然后94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸3min，循環(huán)30次后，72 ℃保溫10 min。PCR 擴增產物電泳檢測正確后純化，割膠回收DNA 片段，乙醇沉淀濃縮，16 ℃下連接6 ～12 h。

1.2.2 重組蛋白的表達與純化 重組質粒pHsh

xarB-xynA電轉化到宿主細胞E.coliJM109 中，挑取重組單菌落接種于含100 g/ml 的氨芐青霉素的LB 培養(yǎng)液中，30 ℃振蕩培養(yǎng)至OD600達到0.6 ～0.8時轉入42 ℃水浴搖床進行熱激表達，繼續(xù)培養(yǎng)8 h后離心收集菌體。用50 mmol/L pH 值為7.5 的Tris-HCl 緩沖液洗滌細胞2 次，并用相同緩沖液重懸細胞，置于冰水浴中用超聲波破碎后，將細胞碎片于12 000 r/min 離心10 min，去除上清液即為粗酶液。將粗酶液在60 ℃熱處理30 min 后，4 ℃12 000 r/min離心30 min 去除變性蛋白。

1.2.3 阿拉伯/木糖苷酶活性測定 阿拉伯/木糖苷酶活性是根據底物對硝基苯酚-木糖苷/阿拉伯呋喃糖苷釋放對硝基苯酚(pNP)的量來確定，采用分光光度法。測定體系為200 μl，包括10 μl 20 mmol/L底物pNPAF/pNPX，180 μl 50 mmol/L pH 6.2 的鄰苯二甲酸氫鉀-咪唑(PIB)緩沖液，10 μl 適量稀釋的粗酶液，于90 ℃/70 ℃反應5 min。然后加入600 μl 1 mol/L Na2CO3終止反應并顯色，最后于405 nm 下測定吸光值。一個酶活單位U 定義為在一定反應條件下，1 min 內催化產生1 μmol 的對硝基苯酚的酶量。

1.2.4 阿拉伯/木糖苷酶、木聚糖酶及融合多功能半纖維素酶的動力學參數(shù)測定 用pH 6.2 的PIB緩沖液配制0.02 ～0.38 mmol/L的pNPX，用pH 5.8的PIB 緩沖液配制0.05 ～1.50 mmol/L的pNPAF，用pH 6.2 的PIB 緩沖液0.25 ～5.00 mg/ml的燕麥木聚糖(OSX)作為底物，然后分別在最適溫度90℃、70 ℃、65 ℃測重組融合酶的木糖苷酶、阿拉伯糖苷酶和木聚糖酶的活性。采用Lineweaver-Burk作圖法，計算游離酶和重組融合酶多種活性的米氏常數(shù)(Km)及酶促最大反應速率(Vmax)值。以上所有測定均重復3 次，保留木糖苷酶和阿拉伯糖苷酶的相對活性平均偏差(SD)小于2%以及木聚糖酶相對活性平均偏差小于5%的數(shù)據。

1.2.5 活性著色Xyn-SDS-PAGE 做膠:1%OSX加到分離膠中(其他和常規(guī)SDS-PAGE 相同)，蛋白樣品加上樣Buffer，75 ℃、3 min ，75 V 低溫冰浴跑蛋白膠。用250 ml 10 mmol/L Tris-HCl(PH 7.0)復性，1%Triton-X100 過夜漂洗，10 mmol/L Tris-HCl(PH 7.0)37 ℃過夜溫育。0.5%剛果紅室溫處理15 min 進行著色，1 mol/L NaCl 脫色，直到膠體呈現(xiàn)透明帶［13-14］。

2 結果與分析

2.1 重組質粒pHsh-xarB 的構建

擴增得到的DNA 片段經XhoI 單酶切后純化，與載體pHsh 分別經過StuI 和XhoI 雙酶切和連接，得到重組質粒pHsh-xarB。陽性轉化子抽提質粒，采用XhoI 單酶切表達質粒pHsh-xarB后釋放出4 700 bp 左右的斷帶，正好是載體pHsh(2 400 bp)與xarB基因(2 300 bp)的和，酶切結果見圖1。測序結果顯示該基因插入到載體正確位置。

圖1 重組質粒pHsh-xarB 的酶切鑒定Fig.1 Enzymatic digestion of recombinant plasmid pHsh-xarB with Xho I

2.2 重組質粒pHsh-xarB-xynA 的構建

以pHsh-xynA2為模板，利用相應的上下游引物xynA-N 和xynA-C 進行PCR，擴增出基因線性pHshxynA2，約3 000 bp(圖2A)，磷酸化處理后的xarB基因大小為2 300 bp(圖2A)。將線性pHsh-xynA2和磷酸化處理后的xarB進行連接，采用XhoI 單酶切表達質粒pHsh-xarB-xynA后釋放出5 300 bp 左右的斷帶，正好是載體pHsh(2 400 bp)與xarB+xynA基因(2 900 bp)的和(圖2B)。測序結果顯示兩基因已插入到正確位置。

圖2 PCR 產物和重組質粒pHsh-xarB-xynA 酶切鑒定Fig.2 PCR products of xarB and pHsh-xynA2 and enzymatic digestion of pHsh-xarB-xynA

2.3 重組多功能半纖維素酶的表達及檢測

SDS-PAGE 電泳結果顯示，重組菌pHsh-xarBxynA能產生大小約108 000的特異條帶，與預期的蛋白相對分子量大小一致(圖3)。

圖3 SDS-PAGE 分析重組質粒pHsh-xarB-xynA 在E.coli 中的表達Fig.3 Expression of pHsh-xarB-xynA in E.coli revealed by SDS-PAGE

2.4 游離酶及融合多功能半纖維素酶的動力學參數(shù)

游離酶XynA、XarB和融合酶XarB-XynA以OSX，pNPX 和pNPAF 作為底物的動力學參數(shù)見表1。如表1 所示，融合多功能半纖維素酶對pNPAF 和OSX的Km值均高于游離酶，而對pNPX 的Km值稍稍低于游離酶;同時，相應的融合多功能半纖維素酶作用于OSX 的Vmax則高于游離酶，而對pNPX 和pNPAF的Vmax值低于游離酶。這些數(shù)據表明，融合多功能半纖維素酶立體結構產生的空間位阻分別對木聚糖酶和雙活性阿拉伯/木糖苷酶活性產生了不同影響。

表1 游離酶及融合多功能半纖維素酶的動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of free and multi-functional enzymes

2.5 活性著色Xyn-SDS-PAGE 分析

由于木聚糖酶基因xynA在融合時放在基因xarB的后面，為了更直觀地檢測融合后的蛋白是否具有木聚糖酶的活性，可以通過往蛋白膠里添加燕麥木聚糖作為底物，結合剛果紅著色后的結果來判斷。如圖4，純化后的木聚糖酶和純化后的融合酶經過跑膠又復性后，仍具有木聚糖酶活性，降解底物后，在膠體目的蛋白的位置上呈現(xiàn)明顯的透明區(qū)，而其他地方由于燕麥木聚糖沒有降解，所以仍然是藍黑色的。

圖4 木聚糖酶的Xyn-SDS-PAGEFig.4 Xylanase activity of recombinant protein XarB-XynA rerealed by Xyn-SDS-PAGE

3 討論

由于木聚糖是高度分支的多糖，其主鏈和側鏈含有不同的側枝，主要有乙?；?、阿拉伯糖基和葡萄糖醛酸基等;當內切木聚糖酶隨機作用木聚糖時便受到這些基團的空間阻礙，而不能到達所作用的木糖苷鍵，所形成的產物只能是帶側枝的低聚糖。因此，木聚糖的完全降解需要多種水解酶的協(xié)同作用。同時使用多種自然克隆到的特異水解某一多糖結構的水解酶來降解木聚糖，雖然清潔高效，但工序復雜，成本高。在不改變酶自身優(yōu)良性質的條件下，將有關的水解酶融合串聯(lián)成一個具有多種水解酶活性的多功能酶，或通過融合標簽回收重復利用酶，來提高融合酶的綜合效率［9-11］，這將大大簡化工序和降低成本。因此今后我們考慮將木聚糖降解需要的其他類型水解酶進行基因融合，用基因工程和蛋白工程的手段得到多功能、高效率、耐高溫的降解木聚糖的融合酶。

構建合適的嗜熱菌的外源基因表達系統(tǒng)，高效率地表達一些耐熱酶，一直是人們研究的熱點。pHsh 作為一種新型表達載體，通過熱激就可以高效表達外源基因，與傳統(tǒng)的化學誘導劑如IPTG 相比，熱激誘導大幅度減少基因誘導表達時的成本，這無疑在工業(yè)化應用中具有巨大的優(yōu)越性和現(xiàn)實意義［13-14］。本研究中pHsh 系統(tǒng)成功表達了來源于嗜熱厭氧乙醇菌T.ethanolicusJW200 的雙活性阿拉伯/木糖苷酶(XarB)。由于該酶的編碼基因含有較多的稀有密碼子，因此在將來的工作中還可將這些稀有密碼子定點突變成大腸桿菌的優(yōu)勢密碼子，通過對表達質粒的TIR 區(qū)域進行mRNA 二級結構分析，優(yōu)化mRNA 二級結構，以進一步提高其表達水平。

［1］ 鄧 惠，陳 淼，刁曉平，等.蚯蚓處理甘蔗渣和牛糞混合廢棄物的初步研究［J］.江蘇農業(yè)科學，2013，41(9):329-331.

［2］ BASTAWDE K B.Xylan structure，microbial xylanase，and their mode of action［J］.World J microbiol Biotechnol，1992，8:353-368.

［3］ YIN E K，LE Y L，PEI J J，et al.High-level expression of the xylanase fromThermomyces lanuginosusinEscherichia coli［J］.World J Microbiol Biotechnol，2008，24 (2):275-280.

［4］ XUE Y M，LU C，MAO Z G，et al.Cloning and expression of arabinofuranosidase/xylosidase gene ofThermoanaerobacter ethanolicusinEscherichia coliand stability of expression products［J］.J China Agri Univ，2003，8(5):9-13.

［5］ LI W，ZHANG W W，YANG M M，et al.Cloning of the thermostable cellulase gene from newly isolatedBacillus subtilisand its expression inEscherichia coli［J］.Molecular Biotechnology，2008，40(2):195-201.

［6］ BANEYX F.Recombinant protein expression inEscherichia coli［J］.Curr Opin Biotechnol，1999，10(5):411-421.

［7］ 蔣鈺瑤，何嘉榮，王未未，等.新型大腸桿菌高效表達載體pHsh 的構建與應用［J］.微生物學通報，2012，39(3):394-400.

［8］ JIANG Y，ZHOU Q，WU K，et al.A highly efficient method for liquid and solid cultivation of the anaerobic hyperthermophilic eubacteriumThermotoga maritima［J］.FEMS Microbiol Lett，2006，259(2):254-259.

［9］ MACY J M，SNELLEN J E，HUNGATE R E.Use of syringe methods for anaerobiosis［J］.J Clin Nutr，1972，25(12):1318-1323.

［10］ SHAO W L，WU H W，PEI J J.Novel expression vector system regulated by sigma32 and methods for using it to produce recombinant protein:US，US 2007/ 0254335A1［P］.2007-11-07.

［11］ WU H W，PEI J J，WU G G，et al.Overexpression of GH10 endoxylanaseXynBfromT.maritimainE.coliby a novel vector with potential for industrial application［J］.Enzyme Microb Technol，2008，42(3):230-234.

［12］ WU H W，PEI J J，JIANG Y，et al.pHsh vectors，a novel expression system ofEscherichia colifor the large-scale production of recombinant enzymes［J］.Biotechnology Letters，2010，42(3):795-801.

［13］ LU P，F(xiàn)ENG M G，LI W F，et al.Construction and characterization of a bifunctional fusion enzyme ofBacillus-sourced β-glucanase and xylanase expressed inEscherichia coli［J］.FEMS Microbiol Lett，2006，261(2):224-230.

［14］ JIN M A，YOUNG K K，WOO J L，et al.Evaluation of a novel bifunctional xylanase-cellulose constructed by gene fusion［J］.Enzyme Microb Technol，2005，36(7):989-895.