孫菲菲， 李建剛， 王 夏， 王 強(qiáng)， 侯喜林

(1.南京市蔬菜科學(xué)研究所，江蘇 南京210042;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京210095;3.中國科學(xué)院土壤環(huán)境與污染修復(fù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國科學(xué)院南京土壤研究所，江蘇 南京210008)

在蔬菜生產(chǎn)中，氮素營養(yǎng)是影響蔬菜產(chǎn)量和品質(zhì)的關(guān)鍵因素。眾所周知，NO-3的同化是蔬菜作物獲取氮素營養(yǎng)的主要途徑。硝酸還原酶(NR)是NO-3同化步驟中的第一個(gè)酶，也是整個(gè)同化過程的限速酶，在植物氮素代謝過程中起關(guān)鍵作用［1］。植物吸收利用環(huán)境中的NO3-，需經(jīng)過2 個(gè)同化反應(yīng)步驟:首先由NR將NO3-還原為亞硝態(tài)氮(NO2-)，然后再由亞硝酸還原酶(NiR)將NO-2還原為NH+4 ，才能進(jìn)一步進(jìn)行氨基酸及蛋白質(zhì)的合成。氨的初始同化發(fā)生在GS/GOGAT(谷氨酸合成)循環(huán)中，該循環(huán)承擔(dān)著氮代謝的中心作用［2］，而谷氨酰胺合成酶(GS)是處于氮代謝中心的多功能酶，參與多種氮代謝的調(diào)節(jié)［3］。一些學(xué)者研究認(rèn)為追施外源氮素能夠提高植物葉片NR和GS的活性［4-5］。王月福等［3］報(bào)道純氮對(duì)提高冬小麥葉片NR和GS的活性以及籽粒蛋白質(zhì)含量有促進(jìn)作用。柴小清等［5］研究發(fā)現(xiàn)NO-3-N 和NH+4-N 能夠顯著提高小麥GS及NR的活性。但是，在分子水平上研究氮代謝關(guān)鍵酶的基因表達(dá)在國內(nèi)鮮有報(bào)道。

不結(jié)球白菜是喜硝態(tài)氮的蔬菜，在其栽培過程中適量施用硝態(tài)氮可大大提高其產(chǎn)量和品質(zhì)，但是過量的硝酸鹽供應(yīng)可導(dǎo)致土壤中高硝酸鹽殘留而使土壤受到污染。本試驗(yàn)通過實(shí)時(shí)定量PCR 法，在轉(zhuǎn)錄水平上研究氮代謝關(guān)鍵酶(硝酸還原酶、亞硝酸還原酶和谷氨酰胺合成酶)基因在NO-3-N 和NH+4-N 2 種不同形態(tài)氮素條件下以及NO-3-N 不同濃度和時(shí)間處理下的表達(dá)變化，在分子水平上揭示氮素條件和氮代謝關(guān)鍵酶基因表達(dá)的關(guān)系，為不結(jié)球白菜的優(yōu)質(zhì)育種和科學(xué)栽培提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

植物材料為不結(jié)球白菜品種蘇州青，由南京市蔬菜科學(xué)研究所提供。種子消毒后催芽，播在裝有蛭石和珍珠巖的育苗盤中，出苗后澆去離子水，7 d 后澆1/4 Hoagland 營養(yǎng)液，至幼苗長至3 片真葉時(shí)使用。

1.2 方法

1.2.1 處理方法 營養(yǎng)液配方以1/2 濃度Hoagland 營養(yǎng)液配方［6］為基礎(chǔ)，并加以改進(jìn)。NO3- 以Ca(NO3)2和KNO3為硝態(tài)氮源;NH4+以(NH4)2SO4為銨態(tài)氮源。硝態(tài)氮營養(yǎng)液的組成成分如下:

Ca (NO3)2·4H2O 590.00 mg/L、KNO3253.00 mg/L、KH2PO468.00 mg/L、MgSO4·7H2O 347.00 mg/L、H3BO31.43 mg/L、MnSO4·4H2O 1.07 mg/L、ZnSO4·7H2O 0.11 mg/L、CuSO4·5H2O 0.04 mg/L、(NH4)Mo7O24·4H2O 0.01 mg/L、Na2Fe-EDTA(乙二胺四乙酸鐵鈉鹽)12.00 mg/L，硝態(tài)氮的濃度依次為0、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L。銨態(tài)氮營養(yǎng)液配方中以(NH4)2SO4、CaCl2和KCl 代替Ca(NO3)2和KNO3，其他組分與硝態(tài)氮營養(yǎng)液相同，銨態(tài)氮的濃度分別為5 mg/L和10 mg/L。為了維持營養(yǎng)液中NO3-和NH4+的濃度及離子平衡，用0.1 mmol/L KOH 和0.1 mmol/L HCl 調(diào) 節(jié)pH 值 至6.5 ～6.8。分別用上述7 種營養(yǎng)液培養(yǎng)幼苗，以1/2濃度Hoagland 營養(yǎng)液培養(yǎng)的幼苗為對(duì)照。4 h 后同時(shí)采集對(duì)照及各處理的根系及葉片，保存于-70 ℃冰箱。另外，使用NO3--N 濃度為30 mmol/L的營養(yǎng)液對(duì)幼苗進(jìn)行培養(yǎng)，分別在處理0 h(對(duì)照)、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 時(shí)同時(shí)采集對(duì)照與各處理幼苗的根系和葉片，作為試驗(yàn)材料?？紤]到光照對(duì)基因表達(dá)的影響，在每一個(gè)處理過程中都給予持續(xù)光照。

1.2.2 RNA 提取和鑒定 總RNA 提取按T Simple RNA 提取試劑盒(美國Bioflux 公司)說明書進(jìn)行。根據(jù)OD260/OD280比值判定RNA 樣品的純度滿足實(shí)時(shí)定量PCR 的要求。

1.2.3 sscDNA 的合成 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照大連TaKaRa 生物公司的TaKaRa RNA PCR Kit(AMV)Ver.2.1 試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.4 引物設(shè)計(jì) 目的基因包括不結(jié)球白菜硝酸還原酶基因(BcNR)、亞硝酸還原酶基因(BcNiR)、細(xì)胞質(zhì)型谷氨酰胺合成酶基因(BcGS1)和 葉綠體型谷氨酰胺合成酶基因(BcGS2)，引物序列見表1。內(nèi)標(biāo)基因選用不結(jié)球白菜Actin基因，引物為:反向5'-GTTGCTATCCAGGCTGTTCT-3'和正向5'-AGCGTGAGGAAGAGCATAAC-3'，PCR 產(chǎn)物長度為118 bp。

1.2.5 實(shí)時(shí)定量PCR 采用實(shí)時(shí)定量PCR 法在Roter Gene 3000 real-time PCR 儀(Gene 公司)上進(jìn)行上述基因的表達(dá)分析，以對(duì)照根系中基因的表達(dá)作為標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)值設(shè)為1，其余樣本為其相對(duì)表達(dá)值BcGS1只在根系中檢測(cè)，以對(duì)照根系中該基因的表達(dá)作為標(biāo)準(zhǔn)。BcGS2只在葉片中檢測(cè)，以對(duì)照葉片中該基因的表達(dá)作為標(biāo)準(zhǔn)，每個(gè)樣品設(shè)置3 次重復(fù)。使用TaKaRa 公司的SYBR PremixEx TaqTM試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR 檢測(cè)。反應(yīng)體系為25 μl 反應(yīng)混合物，每個(gè)引物最終濃度為400 nmol/L。熱啟動(dòng)程序?yàn)?95 ℃變性2 min;95 ℃10 s，57℃(BcNR)、56 ℃(BcNiR)、55 ℃(BcGS1)、56 ℃(BcGS2)20 s，72 ℃20 s，共40 個(gè)循環(huán)。數(shù)據(jù)由Roter Gene 6.0(Gene 公司)和Excel 軟件分析。

表1 目的基因引物序列Table 1 Primer sequences of genes of interest

2 結(jié)果

2.1 不同氮素條件對(duì)BcNR 基因表達(dá)的影響

2.1.1 NO3--N 由圖1A 可見，葉片中BcNR基因的轉(zhuǎn)錄明顯高于根系，幾乎是根系的4 倍之多。但無論是根系還是葉片中，在0 ～30 mmol/L NO3--N處理4 h 條件下，BcNR基因的表達(dá)均隨NO3--N 濃度的增加而增加，在30 mmol/L NO3--N 誘導(dǎo)條件下達(dá)到最大值，此時(shí)葉片中的BcNR的表達(dá)與對(duì)照相比增加了3.2 倍，根系中也增加了2 倍。40 mmol/L NO3--N誘導(dǎo)條件下，BcNR基因的表達(dá)較對(duì)照增加，但是低于30 mmol/L 下的表達(dá)量。說明太高濃度的NO3--N 反而不利于BcNR基因的表達(dá)。

以含30 mmol/L NO3--N 的營養(yǎng)液對(duì)不結(jié)球白菜根系和葉片的BcNR基因持續(xù)誘導(dǎo)，葉片中BcNR基因的表達(dá)在誘導(dǎo)4 h 時(shí)達(dá)到最大，幾乎是對(duì)照的4倍之多，而根系中的BcNR基因在誘導(dǎo)6 h 的表達(dá)量最大，之后隨著時(shí)間的延長均持續(xù)下降，到誘導(dǎo)12 h時(shí)根系BcNR基因表達(dá)量是對(duì)照的近9 倍，而葉片中比對(duì)照高1.2 倍(圖1B)。

圖1 NO －3 -N 濃度(A)和持續(xù)誘導(dǎo)時(shí)間(B)對(duì)BcNR 基因表達(dá)量的影響Fig.1 Concentrations(A)and induction time of duration(B)of NO －3 -N on BcNR gene expression in the leaves and roots of non-heading Chinese cabbage

2.1.2 NH4+-N 5 mmol/L 的NH4+-N 對(duì)根系和葉片中BcNR的表達(dá)水平影響不大，10 mmol/L的NH4+-N 對(duì)其表達(dá)產(chǎn)生了很大的抑制作用，根系中BcNR的表達(dá)下降了約50%，而葉片中下降了約40%(圖2)。

2.2 不同氮素條件對(duì)BcNiR 基因表達(dá)的影響

在不同氮素條件下，BcNiR基因的表達(dá)與BcNR呈現(xiàn)出幾乎相同的變化規(guī)律。

2.2.1 NO3--N 根系和葉片中BcNiR基因都是在30 mmol/L NO3--N 濃度下達(dá)到最大表達(dá)量，根系中相對(duì)于對(duì)照增加了1.8 倍，葉片中也增加了3 倍;40 mmol/L NO3--N 下的BcNiR的表達(dá)量較30 mmol/L略有下降(圖3A)。

圖2 NH 4+ -N 濃度對(duì)不結(jié)球白菜根系和葉片BcNR 基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of NH 4+ -N concentrations on BcNR expressions in the leaves and roots of non-heading Chinese cabbage

以含30 mmol/L NO-3-N 的營養(yǎng)液對(duì)不結(jié)球白菜根系和葉片的BcNiR基因持續(xù)誘導(dǎo)，無論在根系還是葉片中BcNiR的表達(dá)都是在4 h 達(dá)到最大值，6 h 時(shí)雖然有所下降，但是下降幅度很小，與BcNR的表達(dá)相比，BcNiR在12 h 的葉片中仍然有很高的表達(dá)量，幾乎達(dá)到對(duì)照的5.2 倍(圖3B)。

圖3 NO 3－ -N 濃度(A)和誘導(dǎo)時(shí)間(B)對(duì)不結(jié)球白菜根系和葉片BcNiR 基因表達(dá)的影響Fig.3 Effect of NO 3－ -N concentrations(A)and induction time of duration(B)of NO 3－ -N on BcNiR expression in the leaves and roots of non－h(huán)eading Chinese cabbage

2.2.2 NH4+-N NH4+-N 誘導(dǎo)同樣對(duì)BcNiR基因的表達(dá)有一定的抑制作用，在5 mmol/L NH+4 -N 誘導(dǎo)條件下，根系和葉片中該基因的表達(dá)量下降了約20%，在10 mmol/L NH+4 -N 處理下，下降了約50%(圖4)。

圖4 NH 4+ -N 濃度對(duì)不結(jié)球白菜根系和葉片BcNiR 基因表達(dá)的影響Fig.4 Effect of NH 4+ -N concentrations on BcNiR expressions in the leaves and roots of non-heading Chinese cabbage

2.3 不同氮素條件對(duì)根系中BcGS1 基因表達(dá)的影響

2.3.1 NO3--N NO3--N 誘導(dǎo)促進(jìn)了BcGS1基因的表達(dá)，20 mmol/L NO3--N 誘導(dǎo)使BcGS1基因的表達(dá)量達(dá)到最大，30 mmol/L 下該基因的表達(dá)與20 mmol/L 相近，40 mmol/L 時(shí)雖有所下降，仍達(dá)到對(duì)照的3.6 倍(圖5A)。

在NO3--N 誘導(dǎo)前期隨著時(shí)間的延長BcGS1基因的表達(dá)逐漸增加，到6 h 達(dá)到最大值，達(dá)到對(duì)照的17 倍，后期的誘導(dǎo)反而使BcGS1基因的表達(dá)持續(xù)下降(圖5B)。

2.3.2 NH4+-N NH4+-N 促進(jìn)了BcGS1基因的表達(dá)，5 mmol/LNH4+-N 誘導(dǎo)使BcGS1基因的表達(dá)提高 了139% ，10 mmol/LNH4+-N誘導(dǎo)使BcGS1基因的表達(dá)提高了236% (圖6)。

圖5 NO －3 -N 濃度(A)和處理時(shí)間(B)對(duì)不結(jié)球白菜根系BcGS1 基因表達(dá)的影響Fig.5 Effects of NO －3 -N concentrations(A)and induction time of duration(B)of NO －3 -N on BcGS1 expression in the root of non-heading Chinese cabbage

圖6 不同NH 4+ -N 濃度對(duì)不結(jié)球白菜根系BcGS1 基因表達(dá)的影響Fig.6 Effects of NH 4+ -N concentrations on BcGS1expressions in the root of non-heading Chinese cabbage

2.4 不同氮素條件對(duì)葉片中BcGS2 基因表達(dá)的影響

2.4.1 NO3--N NO3--N 對(duì)BcGS2基因的表達(dá)具有一定的促進(jìn)作用。由圖7A 可見，0 ～20 mmol/LBcGS2基因的表達(dá)隨著NO3--N 濃度的增大而增加，20 mmol/L NO3--N 誘導(dǎo)使BcGS2基因的表達(dá)增加近7 倍，NO3--N 濃度高于20 mmol/L后，BcGS2基因的表達(dá)水平不再增加。說明適當(dāng)提高氮素濃度可以有效促進(jìn)GS2基因表達(dá)，提高葉片中GS酶的濃度，從而降低葉片中NH4+的濃度，提高同化吸收氮素的效率。

隨著NO3--N 誘導(dǎo)時(shí)間的延長，BcGS2基因的表達(dá)量持續(xù)上升，直到12 h 仍沒有下降的趨勢(shì)，但上升幅度明顯減少。

圖7 NO 3－ -N 濃度(A)和誘導(dǎo)時(shí)間(B)對(duì)不結(jié)球白菜葉片BcGS2 基因表達(dá)的影響Fig.7 Effects of NO3－ -N concentrations(A)and induction time of duration on BcGS2 expression in the leaves of non-heading Chinese cabbage

2.4.2 NH4+-N NH4+-N 誘導(dǎo)顯著促進(jìn)了BcGS2基因的表達(dá)，5 mmol/L NH4+-N 誘導(dǎo)使該基因的表達(dá)量增加了68%，10 mmol/L NH4+-N 誘導(dǎo)使其增加了133%(圖8)。

圖8 NH 4+ -N 濃度對(duì)不結(jié)球白菜葉片BcGS2 基因表達(dá)的影響Fig.8 Effects of NH 4+ -N concentrations on BcGS2 expressions in the leaves of non-heading Chinese cabbage

3 討論

硝酸還原酶(NR)是植物NO3-同化的關(guān)鍵酶，植物體內(nèi)硝酸還原酶活力的高低直接影響介質(zhì)中NO3-的利用，是作物的營養(yǎng)指標(biāo)之一［7］。硝酸還原酶基因的表達(dá)受到很多外界因子的調(diào)控，如NO3-［8］、谷氨酰胺［9］、NO2-［10］、碳代謝產(chǎn)物［11］等。在高等植物中，NO3-是誘導(dǎo)植物硝酸還原酶體內(nèi)合成的最重要因子，NO3-對(duì)硝酸還原酶的調(diào)控研究也最多。NO3-能誘導(dǎo)硝酸還原酶的表達(dá)，這在很多作物上己經(jīng)得到證實(shí)，如擬南芥［12-13］、煙草［14］、油菜［15］等。本研究中，NO3-誘導(dǎo)了不結(jié)球白菜硝酸還原酶BcNR和亞硝酸還原酶BcNiR兩個(gè)基因的表達(dá)，說明NO3-的誘導(dǎo)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，這與Crawford［16］的結(jié)論一致。

Miyazaki［17］將大麥在無氮條件下培養(yǎng)7 d，然后轉(zhuǎn)移到15 mmol/L 硝酸鹽介質(zhì)中培養(yǎng)，硝酸鹽誘導(dǎo)2 h 后NR 基因即表達(dá)。本研究中在30 mmol/L NO3--N的誘導(dǎo)下，BcNR在2 h 就有很高的表達(dá)，說明硝酸鹽對(duì)BcNR基因的誘導(dǎo)具有瞬時(shí)效應(yīng)。30 mmol/L NO3--N 誘導(dǎo)4 h 可使BcNR基因的表達(dá)達(dá)到高峰，高于30 mmol/L或長于4 h 的誘導(dǎo)都不能再提高BcNR的表達(dá)。這可能是由于NO-3-N 刺激BcNR基因的表達(dá)從而增加了酶蛋白的合成，使硝酸鹽的同化效率增加，進(jìn)而產(chǎn)生了較多的氮代謝產(chǎn)物如NH+4、谷氨酰胺、天冬酰胺等，這些代謝產(chǎn)物的積累對(duì)BcNR基因的表達(dá)產(chǎn)生了反饋抑制作用［18-20］。Andrea 等［14］也認(rèn)為，谷氨酰胺和(或)天冬酰胺的體內(nèi)積累對(duì)NR基因表達(dá)有負(fù)調(diào)控作用。因此，高濃度(10 mmol/L)的NH4+-N 處理降低了BcNR基因的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，無論是NO3--N 還是NH4+-N 處理，BcNiR與BcNR在根系和葉片中表現(xiàn)出幾乎相同的表達(dá)模式，意味著它們?cè)诟髯缘膯?dòng)子區(qū)共享一個(gè)調(diào)節(jié)元件，這與Back等［21］在菠菜上的報(bào)道一致。

GS存在多種同功酶，根據(jù)其在亞細(xì)胞的定位，可以分為胞液型GS1和質(zhì)體型GS2。GS1在植物的根中大量存在，其主要功能是催化根中硝酸鹽還原的銨和從土壤中吸收的銨同化成有機(jī)形態(tài)氮［22］;GS2普遍存在于植物葉片的葉綠體中，其不但在硝酸還原生成的NH+4的初級(jí)同化起作用，更重要的是負(fù)責(zé)光呼吸過程中和氨基酸代謝產(chǎn)生的NH+4的再同化，在高等植物吸收同化氮素的過程中發(fā)揮著重要作用［23］。因此，我們?cè)诟抵兄粰z測(cè)BcGS1的表達(dá)，而BcGS2的表達(dá)只在葉片中檢測(cè)。植物以硝態(tài)氮為氮源時(shí)，需通過硝酸還原酶和亞硝酸還原酶把NO3-還原為NH4+，這2 種酶即成為影響植物吸收氮素和GS的主要因素。本研究以NO3--N 為外部氮源時(shí)，處理初期可以明顯促進(jìn)根系中BcGS1基因的表達(dá)，且表達(dá)水平隨著氮濃度的增大而增加。這可能是由于根系中吸收了大量的NO3-，而NO3-是硝酸還原酶的底物，NO3-可以促進(jìn)BcNR和BcNiR基因的表達(dá)同時(shí)刺激它們的活性，在根部累積大量的NH4+，從而促進(jìn)了BcGS1基因的表達(dá)。葉片中BcGS2基因的表達(dá)也受到NO3--N 的誘導(dǎo)，這是因?yàn)镹O3-可以通過莖維管系統(tǒng)直接運(yùn)輸至葉片，進(jìn)而刺激葉片中大量的NO3-還原為NH4+，從而提升了葉部NH4+的水平，促進(jìn)了BcGS2基因的表達(dá)。隨著硝態(tài)氮處理時(shí)間的增加，不結(jié)球白菜根系中的BcGS1的轉(zhuǎn)錄水平呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因?yàn)橹参锿貭I養(yǎng)的能力除了和GS基因表達(dá)有關(guān)之外，還和GS酶的活性息息相關(guān)。Hayakawa 等研究證實(shí)，NO3-在水稻幼苗期即可提高GS2的活性，在72 h后更加促進(jìn)GS2的活性［24］。也就是說，NO3-對(duì)GS2的活性起到促進(jìn)作用。不結(jié)球白菜在用硝態(tài)氮處理后，隨著時(shí)間的推移，BcGS1基因的表達(dá)下降也可能與其活性的大幅度提升有關(guān)，我們推測(cè)延長處理時(shí)間BcGS2基因的表達(dá)可能也會(huì)下降。

高等植物中，外源氮對(duì)氮素同化酶表達(dá)的影響因植物種類、組織器官、環(huán)境的差異以及氮源的不同而有別［25-26］。植物缺少氮素不是因?yàn)橥寥乐腥狈Φ兀侵参飳o機(jī)態(tài)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)態(tài)氮的能力?。?7］。硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶是植物氮代謝過程中的關(guān)鍵酶，這些酶基因的高效表達(dá)有利于植物對(duì)氮的高效利用，從而在低氮肥條件下促進(jìn)植物的生長。

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