周麗霞， 肖 勇， 楊耀東

(中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南省熱帶油料作物生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南 文昌571339)

大腸桿菌(Escherichia coli)O157∶ H7 屬于腸桿菌科埃希氏菌屬，是一種毒性較強(qiáng)的食源性病原菌，主要通過飲用水、牛奶等食品進(jìn)行傳播［1-5］，人體感染該類病原菌會(huì)患有腹瀉、出血性結(jié)腸炎等疾病，此外還可引發(fā)溶血性尿毒綜合癥及血栓性血小板減少紫斑等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重者可導(dǎo)致死亡［6-7］。因此，快速、靈敏的檢測(cè)和分析此類感染性病原菌對(duì)于疾病防治、環(huán)境保護(hù)等都具有十分重要的意義。傳統(tǒng)的病原菌檢測(cè)方法通常建立在免疫學(xué)和細(xì)菌分離的基礎(chǔ)上，如細(xì)胞計(jì)數(shù)法、酶聯(lián)免疫吸附法、PCR 分析法等，該類方法具有較高的準(zhǔn)確度，但也存在很多缺點(diǎn)，如細(xì)菌培養(yǎng)費(fèi)時(shí)，檢測(cè)不靈敏，分離過程中造成菌數(shù)目的損失等［8-10］。因此，傳統(tǒng)的檢測(cè)方法已遠(yuǎn)不能滿足現(xiàn)代生活和醫(yī)學(xué)應(yīng)用中對(duì)大腸桿菌O157∶ H7 快速靈敏檢測(cè)的要求，探索一種快速、靈敏、低成本和易操作的病原菌檢測(cè)新方法對(duì)于預(yù)防疾病傳播和環(huán)境保護(hù)都具有深遠(yuǎn)的意義。

隨著納米科技與生物學(xué)的深入發(fā)展，金納米顆粒作為納米材料的重要成員之一，其在量子尺寸效應(yīng)、光穩(wěn)定性和生物相容性等方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，已在微生物和細(xì)胞檢測(cè)領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用［11］。本試驗(yàn)利用抗體功能化金納米顆粒與大腸桿菌之間的聚合，發(fā)展了一種基于金納米顆粒的比色法，并用此方法分別對(duì)緩沖液體系和礦泉水中大腸桿菌O157∶H7 進(jìn)行快速檢測(cè)，以期為多種食源性病原菌的快速、靈敏檢測(cè)提供新思路。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

HAuCl4購(gòu)于天津市化學(xué)試劑研究所;檸檬酸三鈉購(gòu)于天津市化學(xué)試劑一廠;多克隆羊抗大腸桿菌O157∶ H7 抗體、溶菌肉湯(LB)培養(yǎng)基、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)-碳化二亞胺(EDC·HCl)購(gòu)于北京鼎國(guó)生物科技有限公司;E.coliO157∶ H7 購(gòu)于廣州環(huán)凱生物科技有限公司;E.coliO149 購(gòu)于廣東省微生物研究所;E.coliDH5α 購(gòu)于廣東省微生物研究所微生物菌種保藏中心。

JEOL-1230 型透射電子顯微鏡購(gòu)自日本JEOL公司;高速離心機(jī)購(gòu)于日本Hitachi 公司;納米粒度及Zeta 電位儀(Nano-ZS)購(gòu)于英國(guó)Malvern 公司;Lambda 900UV 光譜儀購(gòu)自Perkin Elmer 公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 金納米顆粒的制備、生物修飾及表征 參照文獻(xiàn)［12］報(bào)道的方法制備金納米顆粒，在100 ml 的燒杯中，加入濃度為0.01%的氯金酸50 ml，加熱攪拌至沸騰后，加入濃度為1.00%的檸檬酸三鈉2 ml，繼續(xù)保持沸騰并反應(yīng)15 min，溶液顏色變?yōu)榫萍t色，停止加熱并使其自然冷卻至室溫，即合成了金納米顆粒。

參照文獻(xiàn)［13］、［14］方法進(jìn)行納米顆粒的生物修飾。取1 ml 金納米顆粒溶液，離心后去掉上清液，向體系中加入10 μl 巰基丙酸，輕輕混勻后室溫下放置4 d，高速離心后用pH 為7.4 的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌一次，然后將顆粒分散在1 ml PBS 中。向體系中加入3.5 mgNHS，于25 ℃下反應(yīng)30 min，再加入50 μl 1 mg/ml 的多克隆羊抗大腸桿菌O157∶ H7抗體和3.5 mg EDC·HCl，于25 ℃下反應(yīng)3 h，待反應(yīng)終止后離心除去上清液，然后分散在PBS 緩沖液中，并避光于4 ℃保存。采用納米粒度儀及Zeta 電位儀、透射電鏡和紫外吸收對(duì)修飾前后的顆粒進(jìn)行表征［15］。

1.2.2E.coliO157∶ H7 的培養(yǎng) 將含有0.5 g 酵母提取物、1.0 g 蛋白胨和0.5 g NaCl 的LB 培養(yǎng)基粉末溶于100 ml 水中，于121 ℃下高溫滅菌30 min［16］。分別將E.coliO157∶ H7、E.coliO149 和E.coliDH5α 在液體培養(yǎng)基中于37 ℃培養(yǎng)2.5 ～3.0 h，用涂板計(jì)數(shù)法計(jì)算初始菌濃度，并將培養(yǎng)好的菌懸液放在4 ℃保存。

1.2.3E.coliO157∶ H7 的檢測(cè) 將1 ml 6.3 ×106個(gè)E.coliO157∶ H7 菌懸液8 000 r/min離心5 min，去除上清液后，加入1 ml pH 為7.4 的PBS 緩沖液沖洗2 次，并最終將菌充分分散在1 ml PBS 緩沖液中。根據(jù)梯度濃度稀釋法，得到濃度為1 ml 6.3 ×101～6.3 ×106個(gè)菌懸液。

分別取100 μl 終濃度為9.3 mg/ml的抗體功能化金納米顆粒，加入400 μl 上述不同濃度的菌懸液，于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h。根據(jù)抗原-抗體的免疫特異性結(jié)合，原本分散的金納米顆粒集中聚合在菌的表面，根據(jù)金納米顆粒的尺寸效應(yīng)，使得混合體系的顏色發(fā)生變化。由于緩沖液中目標(biāo)菌的濃度不同，顆粒的聚合程度也不同，混合體系的顏色也逐漸由紅色變?yōu)樗{(lán)色，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌O157∶ H7快速、直觀地檢測(cè)。

1.2.4 食品中大腸桿菌O157∶ H7 的檢測(cè) 為考察該檢測(cè)方法的實(shí)用性，從當(dāng)?shù)爻匈I了瓶裝礦泉水，人為加入目標(biāo)菌后直接使用。將1 ml 4.1×106個(gè)E.coliO157∶ H7 菌懸液8 000 r/min離心5 min，去除上清液后，加入1 ml 礦泉水沖洗2 次，并最終將菌充分分散在1 ml 礦泉水中。根據(jù)梯度濃度稀釋法，得到濃度為1 ml 4.1×101～4.1×106個(gè)菌懸液。

2 結(jié)果與分析

2.1 金納米顆粒的表征

合成的金納米顆粒形貌如圖1 所示，顆粒呈規(guī)則的球形，大小均勻且分散性較好，另外，納米粒度儀測(cè)定出金納米顆粒的平均直徑約為(12.3 ±2.0)nm，該結(jié)果與電鏡圖的大小基本吻合，有利于顆粒的下一步應(yīng)用。圖2 為金納米顆粒修飾巰基丙酸前后的吸收光譜，測(cè)得其最大熒光發(fā)射峰位于520 nm左右。當(dāng)顆粒表面修飾了巰基丙酸后，表面有大量的羧基基團(tuán)，其電位約為-44.7 mV(圖3)，這一結(jié)果表明，顆粒表面成功地修飾了大量巰基丙酸。

圖1 金納米顆粒的透射電鏡圖Fig.1 Transmission electron microscopic(TEM)image of gold nanoparticles

圖2 金納米顆粒修飾前后的吸收光譜圖Fig.2 Absorption spectrum of gold nanoparticles and modified gold nanoparticles

圖3 羧基化金納米顆粒的Zeta 電位圖Fig.3 Zeta potential spectrum of carboxyl modified nanoparticles

2.2 大腸桿菌O157∶ H7 的檢測(cè)

2.2.1 可行性考察 基于金納米顆粒的比色法對(duì)1 ml 6.3 ×105個(gè)大腸桿菌純培養(yǎng)物陽性對(duì)照和陰性對(duì)照(陰性對(duì)照1:以無菌緩沖液取代大腸桿菌O157∶ H7;陰性對(duì)照2:以裸金納米顆粒取代功能化金納米顆粒)進(jìn)行可行性考察。結(jié)果顯示，在陽性對(duì)照組中，抗體功能化金納米顆粒與目標(biāo)菌共孵育后，體系顏色變?yōu)樗{(lán)色，而在2 個(gè)陰性對(duì)照中，體系顏色仍為紅色，幾乎沒有發(fā)生顏色變化，這一結(jié)果說明該方法檢測(cè)大腸桿菌O157∶ H7 是可行的，同時(shí)表明抗體與金納米顆粒的交聯(lián)效果較好。

2.2.2 大腸桿菌O157∶ H7 的檢測(cè)結(jié)果 基于金納米顆粒的比色法對(duì)梯度濃度為1 ml 6.3 ×101～6.3 ×106個(gè)大腸桿菌O157∶ H7 進(jìn)行檢測(cè)，通過溶液顏色的變化，來考察方法的檢測(cè)靈敏度。結(jié)果顯示，當(dāng)菌液濃度為1 ml 6.3 ×102個(gè)時(shí)，體系顏色由紅色變?yōu)樽仙?，隨著菌濃度的增大，顏色逐漸變?yōu)樗{(lán)色，因此，該方法檢測(cè)下限為1 ml 6.3 ×102個(gè)大腸桿菌O157∶ H7。為進(jìn)一步驗(yàn)證這一結(jié)果，取適量濃度為1 ml 6.3 ×103個(gè)大腸桿菌O157∶ H7 與功能化金納米顆粒的混合液滴在銅網(wǎng)上，室溫下放置24 h 陰干，在透射電鏡下觀察金納米顆粒與大腸桿菌O157∶ H7的形態(tài)(圖4)，發(fā)現(xiàn)大腸桿菌O157∶ H7表面成功聚集了一定量的金納米顆粒。

圖4 金納米顆粒與大腸桿菌O157∶ H7 的透射電鏡圖Fig.4 TEM image of the mixture of E.coli O157 ∶ H7 and gold nanoparticles

2.3 檢測(cè)方法的特異性考察

為進(jìn)一步評(píng)價(jià)該檢測(cè)方法的特異性，現(xiàn)分別采用E.coliDH5α(1 ml 5.7 ×105個(gè))和E.coliO149(1 ml 7.2 × 105個(gè))作為非目標(biāo)菌，與大腸桿菌O157∶ H7經(jīng)過同樣的處理方法后，加入抗體功能化金納米顆粒，并于37 ℃恒溫孵育1 h?？疾旖Y(jié)果顯示，當(dāng)分別采用無菌緩沖液、E.coliO149、E.coliDH5α 代替目標(biāo)菌(E.coliO157∶ H7)時(shí)，體系顏色均未發(fā)生變化，而加入大腸桿菌O157∶ H7 時(shí)，體系顏色從紅色變?yōu)樗{(lán)色，由此可見，該方法的檢測(cè)特異性較好。同時(shí)，我們測(cè)定了每個(gè)體系的紫外吸收光譜，如圖5 所示，當(dāng)體系中加入大腸桿菌O157∶ H7時(shí)，金納米顆粒520 nm 吸收峰降低，隨著顆粒的聚集程度增大，在630 nm 出現(xiàn)新的吸收峰。表明只有大腸桿菌O157∶ H7 誘導(dǎo)金納米顆粒聚集，而其他非目標(biāo)菌未與功能化顆粒結(jié)合，這一結(jié)果進(jìn)一步證明該方法具有較好的檢測(cè)特異性，未出現(xiàn)抗體與非目標(biāo)菌的交叉反應(yīng)。

圖5 不同菌存在時(shí)金納米顆粒的吸收光譜Fig.5 Absorption spectra of gold nanoparticles in the presence of different bacteria

2.4 食品中大腸桿菌O157∶ H 7 的檢測(cè)

為證明基于金納米顆粒的比色法可用于檢測(cè)食品中的大腸桿菌O157∶ H7，用礦泉水配制了400 μl終濃度為1 ml 4.1 × 101～4.1 × 106個(gè)大腸桿菌O157∶ H7，并分別加入100 μl 抗體功能化的金納米顆粒，于37 ℃恒溫中孵育1 h。結(jié)果顯示，當(dāng)菌濃度為1 ml 4.1 ×102個(gè)時(shí)，體系顏色由紅色變?yōu)樽仙?，隨著菌濃度的增大，體系顏色逐漸變?yōu)樗{(lán)色。為進(jìn)一步證明該檢測(cè)方法的靈敏度，分別對(duì)1 ml 4.1 ×101個(gè)和1 ml 4.1 ×102個(gè)菌濃度的反應(yīng)體系進(jìn)行光譜分析，結(jié)果(圖6)顯示，1 ml 4.1 ×101個(gè)菌濃度的反應(yīng)體系在520 nm 有吸收峰，630 nm 處無鋒，而1 ml 4.1 ×102個(gè)菌濃度的反應(yīng)體系在520 nm的吸收峰降低，隨著顆粒的聚集程度增大，在630 nm 出現(xiàn)新的吸收峰。表明應(yīng)用該比色法對(duì)礦泉水樣本進(jìn)行檢測(cè)，其靈敏度為1 ml 4.1 ×102個(gè) 大腸桿菌O157∶ H7。

圖6 不同濃度大腸桿菌O157∶ H7 存在時(shí)金納米顆粒的吸收光譜Fig.6 Absorption spectra of gold nanoparticles in the presence of different concentrations of E.coli

3 結(jié)論

基于抗體功能化的金納米顆粒，發(fā)展了一種直觀、簡(jiǎn)便的比色分析法用于大腸桿菌O157∶ H7 的檢測(cè)。該方法巧妙的運(yùn)用了金納米顆粒的量子尺寸效應(yīng)，由于聚集程度不同，其吸收光譜發(fā)生紅移，從而引起溶液顏色發(fā)生不同的變化，實(shí)現(xiàn)了對(duì)緩沖體系和礦泉水中目標(biāo)菌的快速檢測(cè)。若采用針對(duì)其他病原菌以及細(xì)胞的特異性抗體，有望成為一種通用的方法用于食品檢測(cè)、疾病診斷和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域中多種病原菌與細(xì)胞的測(cè)定與分析。

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