王述彬， 刁衛(wèi)平， 劉金兵， 潘寶貴， 戈 偉， 郭廣君

(江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，江蘇 南京210014)

細(xì)胞質(zhì)雄性不育(Cytoplasmic male sterility，CMS)是自然界的普遍現(xiàn)象，到目前為止已在300 多種植物中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞質(zhì)雄性不育現(xiàn)象［1-3］。植物胞質(zhì)雄性不育在作物雜種優(yōu)勢利用中有著重要的應(yīng)用價值，長期以來，研究者一直對植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機理進(jìn)行探索研究。

辣椒(Capsicum annuumL.)作為常異花授粉植物，具有非常明顯的雜種優(yōu)勢。自Martin、Grawford和Perterson 最先報道辣椒雄性不育現(xiàn)象以來，國內(nèi)外圍繞辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育已開展了大量的研究工作，包括不育相關(guān)基因分子標(biāo)記篩選［4-8］、不育相關(guān)基因分離［9-11］以及不育性狀的相關(guān)機制研究［10，12］。目前，已鑒定分離的與辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育性關(guān)系最為緊密的候選基因有orf456和atp6基因，在orf456轉(zhuǎn)基因試驗中發(fā)現(xiàn)45%的轉(zhuǎn)基因植株具有雄性不育性［10］。然而，辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育資源的匱乏以及不育性狀的復(fù)雜性，使得研究者在不育相關(guān)基因分離和功能研究中仍存在明顯不足。

大量研究結(jié)果表明，線粒體基因組與CMS 直接相關(guān)，植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育是由線粒體基因突變、嵌合、不完全編輯、重組等原因產(chǎn)生新的功能區(qū)造成的［13-14］。實時熒光定量PCR(Quantitative real-time PCR，qRT-PCR)是一種新型的PCR 技術(shù)，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR 進(jìn)程中產(chǎn)物的變化，從而通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對DNA、RNA 樣品中目標(biāo)基因的表達(dá)進(jìn)行定性或者定量分析［15］。由于操作簡便、快速高效、敏感性高、特異性強的特點，qRT-PCR 已廣泛用于擬南芥、水稻等典型植物的基因表達(dá)水平的檢測［16］。

為了更好地利用辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育進(jìn)行雜種優(yōu)勢育種，進(jìn)一步闡述辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育的相關(guān)機理，本文以辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 及其相應(yīng)的保持系21B 的mtDNA 為材料，采用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)篩選辣椒胞質(zhì)雄性不育相關(guān)基因，并利用qRT-PCR 對獲得的不育相關(guān)基因在不同組織中的表達(dá)模式進(jìn)行分析，以期獲得與辣椒胞質(zhì)不育性緊密相關(guān)的候選基因，為最終克隆獲得辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所用材料為江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所辣椒課題組提供，辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 及其相應(yīng)的保持系21B 由法國不育源LEANS 經(jīng)多代回交轉(zhuǎn)育而成［17］。試驗材料種植于江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所大棚內(nèi)，常規(guī)田間管理。

1.2 線粒體DNA 提取及SRAP 和SCAR 分析

對辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 及保持系21B的黃化苗分別進(jìn)行混合取樣，構(gòu)建不育池和可育池，線粒體DNA 的提取及純化主要參考Kemble 等［18］方法，并加以改進(jìn)。參照Li 等［19］方法進(jìn)行SRAP 引物設(shè)計，引物由上海英俊生物技術(shù)有限公司合成。利用SRAP 標(biāo)記分析不育池和可育池，篩選兩池間的差異，獲得多態(tài)性條帶。根據(jù)SRAP 特異片斷測序結(jié)果，使用Primer 5.0 軟件設(shè)計SCAR 特異引物，并根據(jù)測序序列長度大小進(jìn)行SCAR 標(biāo)記命名。

1.3 多態(tài)性條帶的回收、純化、克隆與測序

參照袁穩(wěn)等［11］方法進(jìn)行多態(tài)性條帶的回收及純化，利用PCR 純化試劑盒(購自碧云天)純化二次PCR 產(chǎn)物。純化產(chǎn)物連接于pGEM-T Easy(Promega)上，并轉(zhuǎn)化DH5α 感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃培育12 ～14 h 后，挑取單克隆，在含有60 mg/L 氨芐青霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培育過夜，PCR 鑒定陽性克隆，并送往南京思普金生物科技有限公司測序。利用NCBI 網(wǎng)站上的Blast 軟件對測序結(jié)果在GenBank 中進(jìn)行序列同源性比較分析。

1.4 RNA 提取及qRT-PCR 分析

以辣椒盛花期的7 個不同組織(根、莖、葉、微花蕾、小花蕾、中花蕾、大花蕾)為試驗材料進(jìn)行總RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成，方法參照植物總RNA 提取試劑盒(購自天根生物技術(shù)公司)和反轉(zhuǎn)錄試劑盒(購自TaKaRa)操作程序進(jìn)行。以Actin1為熒光定量PCR 的內(nèi)參基因，標(biāo)準(zhǔn)曲線構(gòu)建及數(shù)據(jù)處理分析參照Wang 等［20］方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異片斷序列分析

經(jīng)SRAP 引物組合在辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A及保持系21B 的線粒體DNA 擴(kuò)增后，獲得了3 條穩(wěn)定存在的多態(tài)性條帶M6E15、M7E11和M7E12(圖1)。對多態(tài)性條帶進(jìn)行回收、純化、克隆和測序，長度大小分別為721 bp、394 bp 和285 bp，分別命名為CMS721、CMS394和CMS285。在NCBI 上進(jìn)行Blast 同源性比較分析，發(fā)現(xiàn)3 個差異片斷都與能量代謝有關(guān)(表1)。結(jié)果表明，辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 不育性產(chǎn)生的原因可能是由于線粒體基因組發(fā)生重排，導(dǎo)致線粒體功能紊亂，致 使小孢子發(fā)育過程中能量不足。

圖1 辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 及保持系21B 線粒體DNA 的SRAP 擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 SRAP amplification of mitochondrial DNA of CMS line 21A and its maintainer line 21B

表1 SRAP 分離到的辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 及保持系21B 線粒體DNA 差異片斷的序列分析Table 1 Sequence analyses of different fragments in mtDNA of CMS line 21A and its maintainer line 21B in pepper by SRAP

2.2 SRAP 標(biāo)記轉(zhuǎn)化為SCAR 標(biāo)記

根據(jù)多態(tài)性片斷測序結(jié)果，利用Prime 5.0 軟件進(jìn)行特異引物設(shè)計，分別命名為SCAR721、SCAR394和SCAR285并在辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 和保持系21B 單株DNA 中擴(kuò)增驗證。結(jié)果顯示，設(shè)計的3 對特異引物均在不育系21A 單株中得到有效擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷大小與設(shè)計預(yù)期結(jié)果一致，而在保持系中無擴(kuò)增條帶(圖2)，表明已成功將SRAP 引物轉(zhuǎn)化為SCAR 引物。

圖2 特異SCAR721引物在不育系21A 和保持系21B 單株基因組DNA 中的擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The amplification patter of genomic DNA of CMS line 21A and its maintainer line 21B by specific primer SCAR721

2.3 CMS721、CMS394、CMS285基因的表達(dá)分析

為研究花蕾發(fā)育時期與辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育性之間的關(guān)系，選取不同發(fā)育時期的花蕾(圖3)以及根、莖和葉為試驗材料提取RNA。提取的總RNA經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果顯示，電泳條帶清晰，無DNA 污染，經(jīng)分光光度計測定OD260/280為1.9 ～2.2，OD260/230為2.1 ～2.2，表明所提取的RNA純度較好，能滿足試驗需要。

圖3 不同大小的花蕾Fig.3 Buds with different size

以不育系21A 及相應(yīng)保持系21B 的葉片及花蕾(不同大小花蕾的混合樣品)cDNA 為模板，利用CMS721、CMS394和CMS285特異引物對其進(jìn)行擴(kuò)增，內(nèi)參Actin1基因為對照。擴(kuò)增結(jié)果顯示，CMS721、CMS394和CMS285基因只在不育系21A 中表達(dá)。圖4為CMS721基因在21A 及21B 中的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)只在21A 中擴(kuò)增出大小750 bp 左右的特異條帶，而在相應(yīng)的保持系中則無此條帶，說明經(jīng)mtDNA-SRAP獲得的基因CMS721、CMS394和CMS285確實與辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育性存在相關(guān)性。

圖4 CMS721基因在不育系21A 及保持系21B 中的表達(dá)Fig.4 Expression of CMS721 in CMS line 21A and its maintainer line 21B

2.4 CMS721、CMS394、CMS285基因的熒光定量分析

為了明確CMS721、CMS394和CMS285與辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育性之間的緊密程度，利用qRT-PCR 技術(shù)對上述基因在辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 盛花期7個不同組織(根、莖、葉、微花蕾、小花蕾、中花蕾和大花蕾)中的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平進(jìn)行了分析。參照Wang 等［20］方法建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，為:Y= -3.401 1x+46.611 6，相關(guān)系數(shù)為0.999 5，起始模板濃度與Ct值之間呈良好的線性關(guān)系。結(jié)果表明:CMS721、CMS394和CMS285基因在所檢測的不育系材料21A 所有組織中均有表達(dá)，組織表達(dá)的熔解曲線結(jié)果顯示為單峰，且峰值單一，說明產(chǎn)物特異性好。

圖5 為采用2(-△Ct)法和10△△CT/A法根據(jù)Ct值計算出辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 不同組織中CMS721基因的相對表達(dá)量。雖然這兩種方法計算的結(jié)果不一致，存在量的差別，但是其表達(dá)變化趨勢卻是一致的。從圖5 中可以看出，CMS721在不育系21A 7 個不同組織中的表達(dá)量存在顯著差異，尤其在中花蕾中，CMS721的表達(dá)量急劇下降。Luo等［12］研究結(jié)果表明，辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 花粉敗育主要發(fā)生在單核靠邊期，對應(yīng)的花藥發(fā)育階段為中花蕾時期，進(jìn)而推論CMS721基因是引起辣椒21A 花粉敗育的直接原因，但還需轉(zhuǎn)基因手段的進(jìn)一步驗證。此外，熒光定量分析表明CMS394和CMS285基因在辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 的小花蕾和中花蕾中的表達(dá)量也呈下降趨勢。

3 討論

國內(nèi)外對雄性不育基因的作用機制開展了廣泛的研究，通常認(rèn)為細(xì)胞質(zhì)雄性不育的發(fā)生是由于線粒體基因組分子內(nèi)或分子間發(fā)生頻繁重組，從而產(chǎn)生新的開放閱讀框(Open reading frame，ORF)，導(dǎo)致線粒體功能發(fā)生紊亂，致使小孢子發(fā)育過程中能量供應(yīng)不足，進(jìn)而導(dǎo)致雄性不育［13-14，21］。通過對多種作物的不育系和保持系的研究發(fā)現(xiàn)，與CMS 有關(guān)的基因或片段均位于線粒體基因組中，并克隆得到一些與雄性不育相關(guān)的線粒體候選基因［22-25］。辣椒上已鑒定分離出2 個線粒體基因orf456和atp6［9-10］，對它們的研究發(fā)現(xiàn)，其是雄性不育性相關(guān)的重要候選基因。本研究以辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 及相應(yīng)保持系21B 的線粒體DNA 為材料進(jìn)行SRAP 分析，獲得了3 個與能量代謝相關(guān)的基因片斷，其中差異基因片斷CMS721與已報道的辣椒雄性不育相關(guān)候選基因F0-ATPase subunit(atp6)gene 及ATP synthase subunit 6-2(atp6-2)同源性都高達(dá)99%［9］。推論本研究利用的辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 的不育性可能與CMS721相關(guān)，其不育機理可能與atp6具有相同或相似的敗育機理。說明從線粒體DNA 角度出發(fā)，更能有效地挖掘出與辣椒雄性不育相關(guān)的候選基因。

圖5 CMS721在辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 不同組織中的相對表達(dá)水平Fig.5 Relative expression levels of CMS721 in different tissues of CMS line 21A

關(guān)于辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育的細(xì)胞學(xué)特征前人已做了一定的研究。Kim 等［10］通過電鏡觀察到不育植株處于小孢子階段的花粉囊中含有空泡的花粉粒。王述彬等［26］研究結(jié)果表明辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系21A 在雄配子發(fā)育過程中，絨氈層細(xì)胞中的線粒體空泡化，結(jié)構(gòu)異常，導(dǎo)致雄性不育。Luo 等［12］對辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系敗育的細(xì)胞學(xué)機理研究結(jié)果表明，不育系21A 和保持系21B 都能進(jìn)行正常的減速分裂，保持系的四分孢子經(jīng)過單核和雙核花粉等發(fā)育時期后能形成成熟花粉粒，而不育系從單核靠邊期開始在花粉壁上形成突起，崩出內(nèi)含物，致使不育系雄配子在雙核花粉粒形成之前就完全裂解，不能發(fā)育成正常的花粉粒。

本研究中CMS721基因與已發(fā)表的雄性不育候選基因atp6相似性較高，熒光定量分析結(jié)果表明CMS721基因在盛花期中花蕾的表達(dá)量急劇下降，我們推測CMS721基因控制辣椒花藥中與能量代謝相關(guān)的蛋白質(zhì)合成，在中花蕾時期，該基因表達(dá)受阻，影響呼吸鏈和正常的電子傳遞，影響線粒體的正常生理功能，營養(yǎng)和能量供應(yīng)不足，引起小孢子敗育進(jìn)而導(dǎo)致雄性不育。至于CMS721是如何以直接或者間接方式導(dǎo)致雄性不育，以及CMS721的表達(dá)與CMS發(fā)生的直接分子證據(jù)仍需進(jìn)行深入的研究。

［1］ KAUL M L H.Male sterility in higher plants［M］.Berlin Heidelberg:Springer Verlay，1988:690-775.

［2］ 吳國平，袁 穩(wěn)，劉金兵，等.甜椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的SRAP 標(biāo)記［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2012，28(5):1114-1118.

［3］ 徐 海，單奇?zhèn)?，張永吉，?白菜Ogura 細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因組的AFLP 分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40(2):21-23.

［4］ 王得元，王 鳴，鄭學(xué)勤.用RAPD 分析辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因［J］.核農(nóng)學(xué)報，2005，19(2):99-102.

［5］ 馬繼鵬，鞏振輝，黃 煒.辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育相關(guān)線粒體基因片段的克隆及序列分析［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2008，36(2):124-128.

［6］ 王述彬，羅向東，戴亮芳，等.辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系與其保持系線粒體DNA 的RAPD 分析［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，24(1):44-47.

［7］ 劉科偉，王述彬，劉金兵，等.辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育基因的AFLP 分析［J］.分子植物育種，2009，7(4):736-742.

［8］ JO Y D，JEONG H J，KANG B C.Development of a CMS-specific marker based on chloroplast derived mitochondrial sequence in pepper［J］.Plant Biotechnol Rep，2009，3:309-315.

［9］ KIM D H，KIM B D.The organization of mitochondrialatp6gene region in male fertile and CMS lines of pepper (Capsicum annuumL.)［J］.Curr Genet，2006，49:59-67.

［10］ KIM D H，KANG J G，KIM B D.Isolation and characterization of the cytoplasmic male sterility associatedorf456gene in chili pepper(Capsicum annuumL.)［J］.Plant Mol Biol，2007，63:519-532.

［11］ 袁 穩(wěn)，吳國平，王述彬，等.辣椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系核保持系線粒體DNA 差異的SRAP 分析［J］.華北農(nóng)學(xué)報，2012，27(6):62-66.

［12］ LUO X D，DAI L F，WANG S B，et al.Male gamete development and early tapetal degeneration in cytoplasmic male-sterile pepper investigated by meiotic，anatomical and ultrastructural analyses［J］.Plant Breeding，2006，125:395-399.

［13］ BUDAR F，PELLETIER G.Male sterility in plant:occurrence，determinism，significance and use［J］.Life Scoi，2001，324(6):543-550.

［14］ SCHNABLE P S，WISE R P.The molecular basis of cytoplasmic male sterility and fertility restoration［J］.Trends in Plant Sci，1998，3:175-180.

［15］ 陳 旭，齊鳳坤，康立功，等.實時熒光定量PCR 技術(shù)研究進(jìn)展及其應(yīng)用［J］.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2010，41(8):148-155.

［16］ GIULIETTI A，OVERBERGH L，VALCKX D，et al.An overview of real-time quantitative PCR:applications to quantify cytokine gene expression［J］.Methods，2001，25(4):386-401.

［17］ 王述彬，趙華侖，劉金兵.辣(甜)椒胞質(zhì)雄性不育系雜種優(yōu)勢利用及其制種技術(shù)［J］.江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2002，18(3):143-146.

［18］ KEMBLE R J.A rapid，single leaf，nucleic acid assay for determining the cytoplasmic organelle complement of rapeseed and relatedBrassicaspecies［J］.Theor Appl Genet，1987，73:364-370.

［19］ LI G，QUIROS C F.Sequence-related amplified polymorphism(SRAP)，a new marker system based on a simple PCR reaction:its application to mapping and gene tagging inBrassica［J］.Theor Appl Genet，2001，103:455-461.

［20］ WANG S B，LIU K W，DIAO W P，et al.Evaluation of appropriate reference genes for gene expression studies in pepper by quantitative real-time PCR［J］.Mol Breeding，2012，30:1393-1400.

［21］ 張明方，楊景華，陳竹君.十字花科作物細(xì)胞質(zhì)雄性不育的分子機理［J］.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報，2003，11(5):538-544.

［22］ AKAGI H，SAKAMOTO M，SHINJYO C，et al.A unique sequence located downstream from the rice mitochondrialatp6may cause male sterility［J］.Theor Appl Genet，1994，25:52-58.

［23］ HANDA H，NAKAJIMA K.Different organization and altered transcription of the mitochondrilatp6gene in the male sterile cytoplasm of rapeseed (Brassica napusL.)［J］.Curr Genet，1992，21(2):153-159.

［24］ 王永飛，馬三梅，張魯剛，等.大白菜細(xì)胞質(zhì)雄性不育系及其保持系的RAPD 分析［J］.西北植物學(xué)報，2003，23(4):554-560.

［25］ 危文亮，王漢中，劉貴華.植物細(xì)胞質(zhì)雄性不育性與育性恢復(fù)的分子生物學(xué)研究進(jìn)展［J］.遺傳，2005(4):651-658.

［26］ 王述彬，羅向東，戴亮芳，等.辣(甜)椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系減數(shù)分裂和雄配子發(fā)生過程［J］.園藝學(xué)報，2004，31(6):807-810.