高 南， 李俊林，2， 郝東利

(1.中國科學院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室，江蘇 南京210008;2.南京林業(yè)大學森林資源與環(huán)境學院，江蘇 南京210037)

水稻生產(chǎn)過程中時常遇到季節(jié)性和區(qū)域性的干旱、高鹽等非生物逆境脅迫，嚴重影響水稻的產(chǎn)量和品質(zhì)［1-3］。轉(zhuǎn)基因是提高水稻抗非生物逆境能力的主要技術措施之一［1］。篩選合適的基因，是進行轉(zhuǎn)基因水稻培育的前提。Shaker家族K+通道成員在植物體內(nèi)的增強表達能提高植物的抗逆性，例如將水稻的K+通道基因OsKAT1轉(zhuǎn)入水稻愈傷組織，轉(zhuǎn)基因水稻愈傷組織的抗鹽脅迫能力明顯提高［4-5］。因此，Shaker家族K+通道成員是重要的候選基因。Shaker家族成員具有各自獨立的 表 達 模 式［6-8］。擬 南 芥［Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.］的KAT1基因在葉保衛(wèi)細胞中表達，KAT2基因在葉保衛(wèi)細胞、葉韌皮部和花中表達［6］;玉米(Zea maysL.)的ZMK2.1基因和煙草(Nicotiana tabacumL.)的NKT6基因主要在葉中表達［7-8］。與無NaCl 脅迫的處理相比，NaCl 脅迫處理強烈抑制了擬南芥根中AKT1的表達量，但是沒有改變地上部AKT1的表達量和擬南芥AKT2和SKOR的表達量［9］。在干旱脅迫下，煙草(Nicotiana tabacumL.)葉中NKT6的表達量低于對照［8］。在外源ABA 的脅迫下，KAT1、KAT2和NKT6在葉中的表達量降低［8，10］。水稻基因組測序已經(jīng)完成，其K+通道的研究較少［4-5，11-12］。水稻生長在水中，可能具有其他旱地植物不具有的特性。因此，挖掘水稻自身的基因，研究其在脅迫下的響應特征，對進行水稻抗逆改良有重要意義。本研究通過電子克隆、生物信息學分析和實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative PCR， RTqPCR)分析的方法，克隆水稻抵抗逆境脅迫的相關基因并進行分析。

1 材料與方法

1.1 材料

水稻(Orazy sativaL.cv Nipponbare)種子由中國科學院南京土壤研究所土壤-植物營養(yǎng)與肥料室保存。Trizol RNA 提取試劑盒(RNAisoTMPlus)、MMLV 反轉(zhuǎn)錄酶、DNase I、TaqDNA 聚合酶、DL2000 DNA Marker、大腸桿菌DH5α、pMD-18T 載體、質(zhì)粒小提試劑盒、限制性內(nèi)切酶和熒光定量PCR 用試劑盒購自寶生物(大連)有限公司(TaKaRa Co.Ltd.，Dalian，China)。胰蛋白胨和酵母提取物購自Oxoid公司(Oxoid Ltd，Basingstoke，Hampshire，England)。脫落酸(ABA)、甘露醇(Mannitol)和聚乙二醇-6000(PEG-6000)購自Sigma 公司(Sigma-Aldrich Co.LLC.，St.Louis，USA)。其他化學試劑均為國產(chǎn)分析純。

NCBI(美國國立生物技術信息中心)中Gen-Bank 數(shù)據(jù)庫中已經(jīng)注冊的蛋白質(zhì)序列:擬南芥的AKT1(NP_180233.1)、KAT1(NP_199436.1)、KAT2(NP_193563.3)、AKT2/3(NP_567651.1)、AtKC1(P92960.1)KAT3(NP_194991.1)、AKT5(NP_194976.1)、AKT6(NP_180131.3)、GORK(NP_198566.2)、SKOR(NP_186934.1)、KCO1(Q8LBL1.2)、KCO2(CAB64717.1)、KCO3(CAB40380.1)、KCO4(Q9FWX6.2)、KCO5(CAB62162.1)和KCO6(AEE84005.1);玉米的KZM1(NP_001105240.1)、KZM2 (NP _ 001105161.1)和 ZMK2.1 (NP _001105240.1);煙草的NKT1(BAD81034.1)、NKT2(BAD81033.1)、NKT2 (BAD81033.1)、NKT3(ACI45550.2)和NKT5(ACJ05642.2);普通小麥(Triticum aestivumL.)的TaAKT1(AAF36832.1);雨樹［Samanea saman(Jacq.) Merr.］的 SPICK1(AAD16278.1)和SPICK2(AAD39492.1);胡蘿卜(Daucus carotaL.)的KDC1(CAB62555.1);水稻的OsKAT1(NP_001044290.1)。

1.2 方法

1.2.1 水稻幼苗培養(yǎng)和處理 水稻種子用自來水洗凈，置于1%(質(zhì)量體積比)的NaClO 溶液中劇烈振蕩20 min，再用蒸餾水清洗6 ～8 次，最后在蒸餾水中吸脹24 h。將表面滅菌的水稻種子均勻鋪在尼龍網(wǎng)上，放到人工氣候箱中黑暗條件下萌發(fā)3 d，每天更換蒸餾水。將發(fā)芽的種子轉(zhuǎn)到改良的木村營養(yǎng)液［13］中，繼續(xù)在人工氣候箱中生長。培養(yǎng)條件條件:光照16 h，黑暗8 h，溫度為28 ℃，相對濕度為70%。改良后的木村營養(yǎng)液配方為0.36 mmol/L KCl，0.36 mmol/L (NH4)2SO4，0.18 mmol/L NaH2PO4，0.55 mmol/L MgSO4，0.36 mmol/L Ca(NO3)2，0.18 mmol/L NaNO3，0.50 μmol/L H2SiO3，30.00 μmol/L Na2Fe-EDTA，46.26 μmol/L H3BO3，9.15 μmol/L MnCl2，0.76 μmol/L ZnSO4，0.32 μmol/L CuSO4，0.32 μmol/L Na2MoO4，pH5.6。營養(yǎng)液每3 d 更換一次。選取長勢一致健壯的14 d苗齡水稻幼苗，移至改良后的木村營養(yǎng)液中(對照)及分別含100 mmol/L NaCl、10 % (質(zhì)量體積比)PEG-6000 和20 μmol/L ABA 的上述改良木村營養(yǎng)液中進行脅迫處理。處理3 h、6 h、24 h 和48 h 后，收獲地上部或根部，迅速放入液氮中速凍，然后置于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.2 水稻總RNA 的提取和cDNA 第一鏈的合成

取凍存的水稻樣品，液氮中研磨成細末，取約100 mg 細末加入1 ml Trizol，然后按說明書操作步驟進行抽提。為除去基因組DNA 污染，得到的RNA 采用DNase I 于37 ℃酶解30 min，氯仿抽提，100 %乙醇沉淀。得到的沉淀用70 %乙醇洗滌后晾干，溶解于40 μl DEPC(焦炭酸二乙酯)水中。RNA 經(jīng)電泳檢測、紫外檢測合格后，按說明書操作步驟用反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.3OsKAT2基因cDNA 序列的獲得 在水稻數(shù)據(jù)庫(Rice genome annotation project，RGAP)中，以擬南芥KAT1基因蛋白質(zhì)序列為查詢探針，進行BlastP 比對(http://rice.plantbiology.msu.edu/analyses_search_blast.shtml)，得到1 條可能的鉀離子通道序列(LOC_Os01g11250)。根據(jù)其CDS 兩端序列，設計上游引物F1 (5'-ATGGCAGCTAGAAGCGAGCTTCTC-3')和下游引物R1(5'-CTAAAGATGACCGCTGACAAAAGCC-3')。 以地上部cDNA 為模板，進行50 μl 體系的PCR 擴增。反應條件為:第一步，94 ℃變性5 min;第二步，94 ℃變性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸3 min，重復35 個循環(huán);第三步，72 ℃延伸7 min。得到的PCR產(chǎn)物在質(zhì)量濃度為1.0%的瓊脂糖凝膠中電泳分離，回收目的片段并連接到pMD18 克隆載體，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并送寶生物(大連)有限公司(TaKaRa Co.Ltd.，Dalian，China)測序。

1.2.4OsKAT2基因的生物信息學分析 用DNAMAN8.0 分析測序得到的cDNA 開放閱讀框并推測其編碼的氨基酸序列。用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)在線分析Os-KAT2 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。使用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)在 線分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構。使用ProtScale (http://web.expasy.org/protscale/)在線分析親水性/疏水性預測。使用WoLF PSORT (http://wolfpsort.org/)在線分析蛋白質(zhì)序列上潛在的結(jié)構域和功能位點。使用MotifScan (http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)和CCD (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在 線 分析預測蛋白質(zhì)亞細胞定位。使用NetPhos (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)在線分析蛋白質(zhì)磷酸化位點。使用SignalP4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)在線分析蛋白質(zhì)信號序列。使用SOPMA (http://npsa-pbil.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page = npsa_sopma.html)在線分析蛋白質(zhì)二級結(jié)構。使用Phyre2(http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id =index)在線預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構。利用MEGA6.05 軟件，采用Neighbor-joining法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.5 實時熒光定量PCR 分析 應用RT-qPCR技術分析OsKAT2在水稻不同部位(根部和地上部)和不同脅迫處理下的表達水平，每個處理3 個重復。目的基因所用上游引物為F3(5'-GAAAACAGCGATGACAGACGAGT-3')，下游引物為R3(5'-AAGCCATAGAATGACCATTATTAGC-3')。 用看家基因OsActin基因作為內(nèi)標，上游引物為Os-ActinF464(5'-CATGTTTGAGACCTTCAACACCCCTGCTA-3')，下 游 引 物 為 OsActinR933 (5'-ATGTAGTCTCATGGATACCCGCAGCTT-3')。按試劑盒說明書進行(TaKaRa SYBR? PremixEx TaqTM)操作和數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 OsKAT2 基因的獲得和序列分析

2.1.1 cDNA 序列分析 利用引物F1 和R1 進行cDNA 編碼區(qū)序列的RT-PCR 擴增。測序結(jié)果顯示，OsKAT2基因的ORF 區(qū)為1 806 bp。推導可知Os-KAT2 蛋白質(zhì)含601 個氨基酸殘基。除比RGAP 中推測的ORF 序列(1 707 bp)多104 bp(圖1)外，其余堿基兩者相同。

2.1.2 OsKAT2 蛋白質(zhì)理化性質(zhì)分析 用Prot-Param 軟件分析，OsKAT2 蛋白質(zhì)中含量較高的氨基酸殘基包括亮氨酸殘基(11.6%)、異亮氨酸殘基(8.2%)和精氨酸殘基(6.5%)，含量較低的有色氨酸殘基(1.7%)、組氨酸殘基(2.5%)和蛋氨酸殘基(2.5%)等。帶負電荷的氨基酸(天冬氨酸+谷氨酸)殘基為61 個，帶正電荷的氨基酸(精氨酸+賴氨酸)殘基為68 個。OsKAT2 蛋白質(zhì)共有9 854個原子，分子量為6 980 639，蛋白質(zhì)的分子式為C3164H4938N846O876S30，理論等電點為8.57。在哺乳動物的網(wǎng)織紅細胞、酵母和大腸桿菌中的半衰期分別為30 h(體外)、＞20 h(體內(nèi))和＞10 h(體內(nèi));該蛋白質(zhì)不穩(wěn)定指數(shù)為37.22，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。

2.1.3 OsKAT2 蛋白質(zhì)的親水性/疏水性和亞細胞定位 用ProtScale 預測OsKAT2 蛋白質(zhì)親水性/疏水性。結(jié)果(圖2)顯示，氨基酸的最低分值為-3.011，最高分值為2.756。從整體來看，親水氨基酸殘基分布在整條肽鏈，且多于疏水性氨基酸殘基。使用TMHMM 進行預測，參數(shù)設置為默認值，OsKAT2 蛋白質(zhì)為跨膜蛋白質(zhì)。WolfPsort 預測該蛋白質(zhì)可能在細胞質(zhì)膜上。

圖1 水稻數(shù)據(jù)庫(RGAP)中推測的OsKAT2 序列與RT-PCR 獲得的OsKAT2 序列比對Fig.1 Alignment of OsKAT2 sequences achieved by rice genome annotation and RT-PCR

圖2 OsAKT2 蛋白質(zhì)的親水性/疏水性預測Fig.2 Prediction of hydrophilicity /hydrophobicity of protein OsKAT2

2.1.4 OsKAT2 蛋白質(zhì)結(jié)構域和功能位點預測用MotifScan 和CCD 預測OsKAT2 蛋白質(zhì)序列上潛在的結(jié)構域和功能位點。結(jié)果表明，該蛋白質(zhì)可能存在的翻譯后修飾位點包括4 個N-糖基化位點、2個蛋白激酶磷酸化位點、3個酪蛋白激酶II位點、6個N-酰基化位點和7 個蛋白激酶C 磷酸化位點;發(fā)現(xiàn)有5 種結(jié)構域(圖3)，分別是環(huán)腺苷一磷酸結(jié)合結(jié)構域(Crp，CO G0664)、離子轉(zhuǎn)運結(jié)構域(Ion_trans_2，pfam07885)、離子轉(zhuǎn)運結(jié)構域(Ion_trans，pfam00520)、未知功能的DUF3354 超級家族結(jié)構域(DUF3354，pfam11834)和環(huán)核苷酸結(jié)合結(jié)構域(CAP_ED，cd00038)。該蛋白質(zhì)具有Shaker基因家族的典型特征，即在蛋白質(zhì)的N 末端包括6 個跨膜區(qū)(S1 ～S6)，有電壓感受區(qū)和高度保守的通道孔區(qū)。用磷酸化位點預測程序NetPhos 2.0 進行預測，發(fā)現(xiàn)OsKAT2 有15 個潛在的絲氨酸磷酸化位點、7個潛在的蘇氨酸磷酸化位點和4 個潛在的酪氨酸磷酸化位點。利用SignalP 4.1 Server 在線分析Os-KAT2 蛋白質(zhì)信號肽情況，結(jié)果顯示，該蛋白質(zhì)不含信號肽序列。推測OsKAT2 屬于Shaker家族，可能具有吸收K+的功能。

圖3 OsKAT2 蛋白質(zhì)的結(jié)構域預測Fig.3 Prediction of conserved domain of protein OsKAT2

2.1.5 OsKAT2 蛋白質(zhì)二級結(jié)構和三級結(jié)構分析

用SOPMA 軟件預測OsKAT2 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構。結(jié)果顯示，OsKAT2 蛋白質(zhì)由54.08% 的α-螺旋、15.64%的折疊延伸、3.3%的β-轉(zhuǎn)角和26.96%的無規(guī)則卷曲構成。折疊延伸和的β-轉(zhuǎn)角不均勻地分布在整個蛋白質(zhì)的多肽鏈上。依據(jù)模板c2ptmA，采用折疊識別法用Phyer 在線軟件預測OsKAT2 蛋白質(zhì)序列主鏈原子位置生成預測蛋白質(zhì)三級結(jié)構模型(圖4)，最后依據(jù)能量最小化原理使側(cè)鏈集團處于能量最小的位置。

圖4 預測的OsKAT2 蛋白質(zhì)三級結(jié)構Fig.4 Prediction of 3D structure of protein OsKAT2

2.1.6OsKAT2編碼基因的系統(tǒng)進化分析 搜索與水稻K+通道蛋白質(zhì)OsKAT2 同源的擬南芥及相關植物蛋白質(zhì)序列，運用MEGA6.05 軟件繪制構建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果(圖5)顯示，構建的系統(tǒng)進化樹可分為6 組，其中I、II、III、IV、V 組為Shaker家族的K+通道蛋白質(zhì)，第VI 組為KCO 家族的K+通道蛋白質(zhì)，OsKAT2 位于第II 組中。從圖5 可以看出，水稻OsKAT2 在進化上與單子葉植物玉米的KZM2 和ZMK2.1 的進化關系最近?？梢酝茰y，OsKAT2 可能是Shaker家族的內(nèi)向整流蛋白質(zhì)。

圖5 部分植物鉀離子通道的系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of potassium channels of some plants

2.2 OsKAT2 基因的表達特點

采用RT-qPCR 對水稻OsKAT2基因在非脅迫下的表達部位進行分析。結(jié)果(圖6)表明，OsKAT2基因地上部的表達量比根的表達量多近10 倍。因此，在分析干旱、高鹽和ABA 脅迫對水稻OsKAT2基因表達的影響時，以地上部為研究部位。由圖7 可見，在正常對照條件下，水稻地上部OsKAT2基因有表達，隨著培養(yǎng)時間的延長，其表達的豐度也有增減。在PEG 模擬干旱、NaCl 模擬高鹽和ABA 的脅迫下，水稻地上部OsKAT2基因表達量明顯下調(diào)，且不同處理響應的程度不同。在PEG-6000 處理3 h 時，水稻地上部OsKAT2基因相對表達量明顯降低;當處理24 h 時，水稻地上部OsKAT2基因相對表達量降低最大，可達68.6%;當處理48 h 時，水稻地上部OsKAT2基因相對表達量降低略有下降，仍然可以達到36.2%。在NaCl 處理6 h 時，水稻地上部Os-KAT2基因相對表達量減少62.9%;當處理24 h 時，水稻地上部OsKAT2基因相對表達量降低最大，可達72.7%%;當處理48 h 時，水稻地上部OsKAT2基因相對表達量降低達到61.2%。在ABA 處理3 h時，水稻地上部OsKAT2基因相對表達量減少68.4%;當處理6 h 時，水稻地上部OsKAT2基因相對表達量的降低最大，可達73.3%;當處理24 h 時，水稻地上部OsKAT2基因相對表達量降低略有減少?？傮w上，水稻地上部OsKAT2基因在ABA 脅迫時下調(diào)表達最明顯。

圖6 OsKAT2 基因在水稻不同器官中的表達Fig.6 Expression levels of OsKAT2 in different organs of rice

圖7 水稻地上部OsKAT2 基因在非生物脅迫下的誘導表達Fig.7 Inducible expression of OsKAT2 in rice shoot under abiotic stresses

3 討論

同源克隆在獲得植物新基因中有廣泛的應用［8，14-15］。本研究通過電子克隆的方法，獲得了一個可能的K+通道基因。應用生物信息學的方法和工具對OsKAT2基因進行了分析，發(fā)現(xiàn)OsKAT2 蛋白質(zhì)為疏水性蛋白質(zhì)，α-螺旋和折疊延伸是主要的構成原件，這些與大多數(shù)KAT1 類K+通道蛋白質(zhì)的特征是一致的。OsKAT2 蛋白質(zhì)含離子轉(zhuǎn)運結(jié)構域(pfam07885 和pfam00520)，功能分析結(jié)果說明該蛋白質(zhì)屬于陽離子轉(zhuǎn)運蛋白質(zhì)。OsKAT2 蛋白質(zhì)與KZM2 和ZMK2.1 的同源性較高，含K+通道的標志性序列TxxTxGYGD［8，16-17］。OsKAT2 不存在錨定蛋白質(zhì)結(jié)構域，這與大部分Shaker家族第II 組成員在C-末端胞內(nèi)結(jié)構上存在一致性，說明OsKAT2 可能不參與通道蛋白質(zhì)亞基的異聚化作用，而在與其他蛋白質(zhì)的互作或細胞膜錨定的過程中發(fā)揮作用［17］。上述結(jié)果說明OsKAT2基因是一個K+通道基因。然而，來源不同的同源通道往往有其獨特之處［7］。水稻長期生長在淹水環(huán)境中，其K+通道在長期適應物種生境的進化過程中，可能形成了有別于擬南芥和玉米等旱生植物的獨特功能特征和作用機制［12］。OsKAT2的功能還需要進一步研究。

植物在適應非生物逆境脅迫過程中，許多基因的表達會發(fā)生變化，由此導致體內(nèi)一些生物化學與生物物理過程的適應性調(diào)整，如離子含量的增加，脯氨酸的積累等，進而抗非生物逆境的能力增強［4-5］。其中，部分響應非生物逆境脅迫的基因能提高作物抵抗非生物逆境脅迫的能力。在本研究中，利用RT-qPCR 測定了OsKAT2在模擬干旱(PEG 處理)、高鹽和外源ABA 脅迫下表達量的變化。結(jié)果表明，OsKAT2主要在地上部表達，受模擬干旱、高鹽和外源ABA 脅迫誘導下調(diào)。ZMK2.1、KAT2等基因與OsKAT2高度同源，基因的表達部位主要在地上部［6-7］，與本研究的結(jié)果一致。在系統(tǒng)進化樹第II組的KAT1、KAT2和NKT6基因，在ABA 等逆境條件下，葉片中的表達量降低［6，8，10］，這與本研究中Os-KAT2在脅迫時的表達特征基本一致。ZMK2.1、KAT2、KAT1、KAT2和NKT6等基因均參與保衛(wèi)細胞的運動，在植物抵抗非生物逆境脅迫中發(fā)揮重要的作用［6-8，10］。因此，推測OsKAT2可能在水稻抵抗逆境脅迫中發(fā)揮作用，是一個能通過轉(zhuǎn)基因技術提高水稻抗非生物逆境能力的候選基因。除轉(zhuǎn)錄水平外，OsKAT2 蛋白質(zhì)存在翻譯后修飾位點，即OsKAT2 與大多數(shù)Shaker家族K+通道一樣也存在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控。對OsKAT2 在干旱、高鹽和ABA 等逆境脅迫下的蛋白質(zhì)水平調(diào)控還需要進一步研究。

本研究獲得了一個Shaker家族K+通道基因OsKAT2。該基因編碼產(chǎn)物OsKAT2 由601 個氨基酸組成，包含K+通道的保守結(jié)構域，屬于Shaker家族第II 組。OsKAT2的mRNA 在水稻地上部大量表達;干旱、高鹽和外源ABA 脅迫處理誘導OsKAT2的表達量下調(diào)。初步推測OsKAT2可能在水稻抵抗逆境脅迫中發(fā)揮作用，是一個水稻抗非生物逆境改良的候選基因。

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