金珊珊，柯斌榕，吳小平* ，湯坤鵬

(1．福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心，福州350002;2．福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所，福州350014)

利用菌草栽培食藥用菌已經(jīng)得到了廣泛的研究。菌草具有投資少，周期短，成本低的特點(diǎn)，同時(shí)也防止水土流失。栽培食用菌后的菌袋廢料回收利用可制作生物肥，又可制作成動(dòng)物飼料，以此形成一個(gè)綜合的循環(huán)利用，減少在栽培食用菌方面消耗的木材。項(xiàng)麗娟［1-2］等人以菌草為主料，高粱、麥麩為輔料栽培銀耳，得出子實(shí)體出芽早，展片優(yōu)于棉籽殼。蔡楊星［3］利用菌草栽培猴頭菇，和傳統(tǒng)木屑配方比較，子實(shí)體蛋白質(zhì)含量是木屑栽培的子實(shí)體含量的1.14倍，總氨基酸含量也略高。將菌草作為栽培大球蓋菇的原料，具有原基形成時(shí)間短，朵型較好，產(chǎn)量高等特點(diǎn)［4］。林占熺利用芒萁、五節(jié)芒、巨菌草代替闊葉木栽培食藥用菌如鹿角靈芝，王凱［5］等人比較菌草栽培的9種靈芝的生長(zhǎng)狀況，選出適宜栽培的菌種。但是還未見通過雜交選育菌草栽培專用靈芝菌株的報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)選擇以菌草作為培養(yǎng)基質(zhì)，分析不同雜交菌株的農(nóng)藝性狀及有效成分含量，篩選出適合菌草栽培的靈芝雜交菌株。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 供試菌種

親本:1)AL:安嶺靈芝基地子實(shí)體分離;2)JCL:菌草鹿角靈芝子實(shí)體分離。

雜交種:J－7/AL－7，J－15/AL－2，J－16/AL－9，J－29/AL－1，J－1/AL－12，J－6/AL－7，J－6/AL－2保藏于福建農(nóng)林大學(xué)菌物研究中心 (以上菌株通過單孢雜交獲得)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

濃硫酸，重蒸酚，冰醋酸，高氯酸，香草醛，98%乙醇 (以上溶劑均為分析純?cè)噭?，甲醇，乙腈(色譜級(jí))，熊果酸對(duì)照品 (上海源葉生物科技有限公司)，靈芝酸A對(duì)照品 (大連美侖生物技術(shù)有限公司)，葡萄糖 (上海源葉生物科技有限公司)。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海申生科技有限公司);分光光度計(jì) (北京北分瑞利儀器公司);超快速分離液相色譜儀 (日本島津)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法:

1.2.1 原種制作

原種配方:木屑76%，麩皮20%，玉米粉3%，石膏1%，加水至含水量60%～65%之間，攪拌約0.5 h至均勻，使原料充分吸水。每個(gè)原種瓶裝濕料約450 g壓實(shí)，用自制棉塞塞緊;1.5 Mpa，121℃高壓滅菌150 min，滅菌后冷卻至30℃以下接種，25℃黑暗條件下培養(yǎng)菌絲并按時(shí)通風(fēng)，保持室內(nèi)空氣相對(duì)濕度60%左右。

1.2.2 栽培袋制作

栽培料配方:芒萁30%，五節(jié)芒43%，麩皮25%，石膏2%。按比例稱料加水拌勻人工拌料，每個(gè)處理重復(fù)30袋，每個(gè)菌袋裝濕料約900 g。pH控制在4～6，含水量控制在60%左右。滅菌后接種，菌袋于25℃左右在黑暗條件下培養(yǎng)，隔3天后觀察是否有雜菌污染，并及時(shí)清理菌袋。

1.2.3 生長(zhǎng)速度測(cè)定

采用大試管裝栽培料測(cè)9株菌種的生長(zhǎng)速度，每個(gè)菌種做5個(gè)平行，每隔3天用刻度尺測(cè)生長(zhǎng)量，一共記錄4次，計(jì)算平均每天的生長(zhǎng)速度，以此速度預(yù)測(cè)菌袋的生長(zhǎng)速度，生長(zhǎng)速度快的菌株可以減少菌種生長(zhǎng)周期。

1.2.4 出芝管理

菌絲滿袋后，將菌袋轉(zhuǎn)移至出菇房，調(diào)整出菇溫度控制在26～28℃，室內(nèi)空氣相對(duì)濕度為90%～95%，適當(dāng)通風(fēng)換氣使二氧化碳含量不高于0.1%，并給予1 500 lx以上的光照。待靈芝菌蓋邊緣白色或黃色生長(zhǎng)圈消失轉(zhuǎn)為棕褐色，菌蓋開始革質(zhì)化，菌管層出紅褐色孢子時(shí)，表明子實(shí)體成熟，即可采收。采收后稱鮮芝總重，將新鮮靈芝放入烘干箱中55～60℃烘干，收集烘干靈芝，密封。

1.2.5 多糖提取及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

采用苯酚－硫酸法測(cè)定靈芝子實(shí)體多糖含量［6］。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作:精密稱取干燥的葡萄糖50 mg，定容于500 mL容量瓶中。其濃度為0.1 mg/mL，分別吸取0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，加入5%苯酚溶液1 mL，搖勻，快速加入硫酸5 mL。搖勻，充分混合，靜置10 min后30℃水浴20 min，冷卻，490 nm下測(cè)定吸光值。

多糖提取方法［7］:精確稱取靈芝干燥子實(shí)體粉末2 g，加蒸餾水90℃回流提取，料液比為1∶50，回流提取3 h，過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將提取液濃縮，定容至25 mL。吸取10 mL多糖溶液，加入98%以上乙醇80 mL，醇沉過夜 (約12 h)，醇沉后，5 000 r/min離心10 min，棄上清液，將沉淀用蒸餾水定容至25 mL。吸取上述定容樣品0.5 mL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的步驟進(jìn)行操作，在490 nm下檢測(cè)吸光值，并記錄。

1.2.6 總?cè)铺崛〖皹?biāo)準(zhǔn)液的制備

熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:精密稱取熊果酸對(duì)照品10 mg，定溶于10 mL甲醇中，得到熊果酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋到0.5 mg/mL。精密吸取0.6，0.8，1.0，1.2，1.4，1.6 mL標(biāo)準(zhǔn)液，60℃水浴蒸干，加5%香草醛－冰醋酸溶液0.5 mL，再加高氯酸0.8 mL，搖勻后60℃水浴15 min，冰浴冷卻后加5 mL冰醋酸，靜置30 min后，在548 nm下測(cè)吸光度。

總?cè)铺崛》椒ǎ?］:精確稱取靈芝子實(shí)體粉末2 g，加85%乙醇50 mL，超聲20 min，反復(fù)提取2次，將2次提取液合并過濾，將濾液減壓旋蒸蒸干，用甲醇溶出定容于50 mL容量瓶中。按繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線步驟進(jìn)行操作，在548 nm下檢測(cè)吸光值。

1.2.7 液相指紋圖譜比較

精密稱取7.6 mg靈芝酸A，用甲醇定容于10 mL容量瓶中，制備成0.76 mg/mL的對(duì)照品溶液，再將母液稀釋到0.076 mg/mL進(jìn)樣，以靈芝酸A為對(duì)照品優(yōu)化色譜條件，經(jīng)優(yōu)化得到色譜條件為:0.1%乙酸 (A)和乙腈 (B)梯度洗脫，洗脫比例為B濃度為0～20 min:30% ～40%;20～25 min:40% ～55%;25～30 min:55% ～65%;30～40 min:65% ～65%。柱溫40℃;流速0.8 mL/min;紫外波長(zhǎng)為254 nm;色譜柱為InertsustainC18。將上述提取的總?cè)铺崛∥镞^0.45 um的濾膜，進(jìn)樣量為10 uL。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

運(yùn)用DPS7.05軟件采用Duncan's新復(fù)極差法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，表1、表3、表4中小寫字母代表在0.05水平下比較，差異顯著;大寫字母代表在0.01水平下比較，差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雜交菌株菌絲生長(zhǎng)速度比較

JCL，J－6/AL－7，J－16/AL－9，J－16/AL－2，J－15/AL－2無顯著差異，J－7/AL－7，J－6/AL－2，J－1/AL－12，AL無顯著差異，親本JCL的生長(zhǎng)速度最快，可達(dá)0.75 cm/d，另一親本AL菌株的生長(zhǎng)速度最慢0.65 cm/d(表1)。在這些雜交種之中J－6/AL－7，J－16/AL－9菌株的生長(zhǎng)速度最快。J－1/AL－12菌株的生長(zhǎng)速度最慢。

2.2 靈芝高產(chǎn)雜交菌株篩選

雜交種的菌蓋形態(tài)各不相同，差異較大，親本AL和JCL成腎形，J－6/AL－2子實(shí)體菌蓋褶皺;J－1/AL－12子實(shí)體菌柄較長(zhǎng)，可能該菌株在同樣條件下對(duì)二氧化碳濃度較敏感;J－16/AL－9子實(shí)體原基較多;菌蓋較小，J－15/AL－2子實(shí)體較厚，菌蓋比較飽滿，而且菌柄較短;J－7/AL－7子實(shí)體呈腎形，形狀較美觀 (表2)。J－6/AL－7原基分化較多且菌柄連結(jié)在一起，J－29/AL－1原基分化多，菌蓋小 (圖1)。

各菌株產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率見表3。

生物轉(zhuǎn)化率=芝鮮重/栽培袋料干重×100% (1)

由方差分析表得出，各個(gè)菌種的差異是顯著的，J－1/AL－12，J－6/AL－7的產(chǎn)量均高于親本AL的產(chǎn)量，且J－1/AL－12的產(chǎn)量和親本AL和JCL有顯著性差異。J－29/AL－1產(chǎn)量最低，低于2個(gè)親本菌種。

表1 菌絲生長(zhǎng)速度Table 1 The growth rates of myceliu

表2 子實(shí)體形態(tài)描述Table 2 The Morphology description of fruiting body

圖1 不同菌株靈芝生長(zhǎng)形態(tài)Figure 1 The morphology of fruiting body in different strains

表3 不同菌株的產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率Table 3 The production of fruiting body and biological conversion rates

2.3 靈芝高活性雜交菌株篩選

2.3.1 線性關(guān)系考察

以葡萄糖為對(duì)照品，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:y=8.755x+0.011 1，R2=0.999 3。另外以熊果酸為對(duì)照品，線性回歸方程為y=5.42x－0.037 6，R2=0.996 9。

2.3.2 多糖、三萜含量測(cè)定與比較

按多糖含量從高到低的順序?qū)㈧`芝菌株排列成表4結(jié)果。菌株間的三萜含量和多糖含量差異較大，其中J－1/AL－12子實(shí)體三萜含量最高，可達(dá)9.24 mg/g。J－29/AL－1的多糖含量高，最高可達(dá)20.05 mg/g。

2.4.3 靈芝三萜液相圖譜分析

按照液相色譜條件，進(jìn)樣量10 uL，樣品在45 min內(nèi)色譜峰已全部跑出，根據(jù)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版進(jìn)行比較。

對(duì)不同雜交種的指紋圖譜進(jìn)行比較與分析，出峰時(shí)間集中在14 min到30 min內(nèi) (圖2)。S9(J－6/AL－7)的指紋圖譜與其他圖譜的相似性較小僅0.140到0.608。由此可以得出J－6/AL－7的三萜成分與其他菌株相比較存在一定差異。其他菌株間的差異在0.586到0.982之間。除了 J－6/AL－7菌株，其他菌株盡管從圖譜相似度上分析存在較大差異，但其特征峰基本一致。

表4 多糖與三萜含量Table 4 The contents of polysaccharides and triterpenoid

圖2 雜交靈芝指紋圖譜Figure 2 The fingerprint of fruiting body in different strain

表5 不同菌種指紋圖譜相似度分析Table 5 The comparison of similarity

2.4 不同栽培配方靈芝三萜指紋圖譜分析

如圖3所示，以JCL菌株為例分析不同栽培料配方子實(shí)體的差異，S1、S2分別為菌草配方和木屑配方靈芝三萜指紋圖譜，通過中藥色譜指紋圖譜評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版比較指紋圖譜間的差異，得出2個(gè)圖譜間的相似度為0.843。從圖譜上可以看出特征峰的數(shù)量及峰形基本一致，說明同一菌株不同配方靈芝子實(shí)體的三萜指紋圖譜無明顯差異。

圖3 木屑與菌草配方靈芝三萜指紋圖譜Figure 3 The fingerprint of fruiting body in two different formulation

3 討論

在生產(chǎn)上，產(chǎn)量已經(jīng)作為重要的指標(biāo)之一，在篩選菌株時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度和產(chǎn)量是2個(gè)重要的因素。同時(shí)，有效成分是鑒定靈芝品質(zhì)的重要依據(jù)，萜類和多糖類物質(zhì)是靈芝中含量較多的化合物，因此，可成為篩選菌株的另一個(gè)因素。試驗(yàn)中J－1/AL－12的單袋產(chǎn)量和生物轉(zhuǎn)化率均高于2個(gè)親本，分別是46.98 g和11.75%，并且子實(shí)體朵形整齊。靈芝的多糖及三萜成分是靈芝質(zhì)量的重要指標(biāo)，J－29/AL－1菌株的多糖含量最高，其含量為20.05 mg/g，該菌株的三萜含量也比較高，但其產(chǎn)量很低;J－1/AL－12三萜含量最高，多糖含量也較高，三萜和多糖含量分別是9.24 mg/g和17.30 mg/g;J－6/AL－7的發(fā)菌速度最快，產(chǎn)量較高，但是其有效成分含量一般。綜合分析，菌株J－1/AL－12的長(zhǎng)勢(shì)較好，產(chǎn)量最高，并且有效成分含量較高，可以作為適合菌草栽培的菌種。建立指紋圖譜可以鑒別靈芝三萜成分的差異，建立質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［9］。本實(shí)驗(yàn)通過液相色譜比較菌株間圖譜的差異，發(fā)現(xiàn)不同雜交菌株其三萜指紋圖譜相似度在0.586到0.982之間，此差異的存在有以下幾方面原因:有效物質(zhì)的含量有差異;可能菌株存在微量的化合物有差異，還有待進(jìn)一步證實(shí)。另有研究表明同一菌株在不同培養(yǎng)基相同培養(yǎng)條件下三萜指紋圖譜相似度大于0.96［10］，而本實(shí)驗(yàn)的木屑配方和菌草配方的靈芝三萜液相圖譜及特征峰也均無明顯差異，與前人得出的結(jié)果較一致。同時(shí)也得出可以用菌草代替木屑作為原料栽培靈芝，醇提物幾乎無差異。篩選適合菌草栽培的雜交菌株具有可實(shí)踐性意義。

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