陳乃東，胡平，陳晨

1(皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽六安，237012)

2(皖西中藥與天然藥物工程技術(shù)研究中心，安徽六安，237012)

3(安徽醫(yī)科大學，安徽合肥，230032)

黃酒因酒精含量較低，在生產(chǎn)、陳化和貯運過程中易感染細菌而導致變酸甚至發(fā)臭，這種現(xiàn)象稱為酸敗，俗稱“起醭”。酸敗是我國黃酒業(yè)面臨的頭等難題［1-2］。輕度酸敗既降低原料出酒率，又損害了黃酒應(yīng)有的風味，直接影響了黃酒的品質(zhì)。重度酸敗時黃酒因變質(zhì)而無法飲用，造成了大量的人力、物力損失，還會引發(fā)因清理困難而導致的環(huán)境污染［3-4］。酸敗現(xiàn)象已成為困擾黃酒生產(chǎn)企業(yè)、使黃酒生產(chǎn)成本居高不下的主要技術(shù)難題之一［5］。

黃酒生產(chǎn)過程中滅菌不徹底、貯藏或運輸過程中染菌等是導致酸敗的主要原因，因此，確定導致黃酒酸敗的基源微生物，進而采取針對性滅菌措施是減少黃酒酸敗的有效方法。張遐耘［6］采用乳酸菌培養(yǎng)基對袋裝黃酒中的雜菌進行了檢測，認為乳酸桿菌屬是引起袋裝黃酒變渾濁的污染菌屬。謝廣發(fā)等［7］采用PCR和16S rDNA序列測定等分子生物學手段檢測和分析了酸敗不脹氣袋裝黃酒中的污染微生物，發(fā)現(xiàn)袋裝酸敗黃酒中的微生物主要是假單胞菌。毛青鐘等［8］采用MRS培養(yǎng)基對黃酒倉庫壇酒酸敗微生物進行了分離鑒定，認為酸敗黃酒中主要微生物是乳酸桿菌。這些研究為探討黃酒酸敗的基源微生物提供了很好的前期研究基礎(chǔ)，但已有的研究只是對酸敗黃酒的微生物組成進行鑒定，并未能確定導致酸敗的基源微生物。

本實驗運用高效毛細管電泳技術(shù)，通過分析酸敗黃酒原酒與黃酒原酒的組分建立酸敗黃酒原酒中酸敗成分的檢出方法，在此基礎(chǔ)上，發(fā)酵培養(yǎng)從酸敗黃酒中分離的微生物，運用建立的HPCE檢測方法，檢測酸敗黃酒微生物發(fā)酵產(chǎn)物，通過比對二者的共有峰，追蹤可能產(chǎn)生黃酒酸敗成分的微生物。在生產(chǎn)過程中，根據(jù)導致酸敗的微生物的習性，改進生產(chǎn)工藝，采取針對性滅菌或預防措施，抑制有害微生物侵入或生長，從而有效降低酸敗的發(fā)生，降低黃酒生產(chǎn)成本。本實驗為這些后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與試劑

1.1 儀器與設(shè)備

K1060型高效毛細管電泳儀，北京凱奧;42.8 cm×45 μm未涂層石英毛細管的毛細管，北京凱奧;TS-211B恒溫搖床，上海天呈實驗儀器有限公司;BKDM320奧特數(shù)碼生物顯微鏡，重慶奧特;SW-CJ-1FB凈化工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司;YM50FGN干燥內(nèi)排型壓力蒸汽滅菌器，上海三申;MJ-150-Ⅱ型霉菌培養(yǎng)箱，上海天呈實驗儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

黃酒原酒、酸敗黃酒原酒于2013年4月26日從安徽禾裕黃酒集團有限公司生產(chǎn)車間隨機抽取，每種樣品抽取10個，分別采自不同陶罐，采回后于4℃冰箱保存、備用。

精密pH試紙，上海三愛思;H3BO3，上海實意化學試劑有限公司;NaH2PO4，南京化學四試劑一廠;四硼酸鈉，新科電化劑廠;NaOH，隴西化工股份有限公司，均為國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 黃酒酸敗組分HPCE檢出分析條件

緩沖液、樣品黃酒原酒、酸敗黃酒原酒、微生物發(fā)酵產(chǎn)物，測定前以Na2CO3溶液調(diào)pH至10.0后，以0.45 μm纖維素膜過濾后備用。

通過反復預實驗，確定黃酒原酒、酸敗黃酒原酒檢測條件為:pH 10.0的0.075 mol/L磷酸氫二鈉-四硼酸鈉、檢測波長215 nm、分離電壓8.0 kV。

進樣前毛細管用緩沖溶液洗5 min左右，連續(xù)進樣3～5次后及時更換新的分離緩沖溶液，以保證遷移時間和校正峰面積的重現(xiàn)性。

2.2 培養(yǎng)基

PDA-黃酒培養(yǎng)基:在復合馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)基礎(chǔ)上，以黃酒原酒代替蒸餾水。去皮馬鈴薯200.0 g切成小塊，黃酒原酒煮15.0 min，紗布過濾，濾液加入葡萄糖20.0 g，KH2PO43.0 g，MgSO4·7H2O 1.5 g(或MgSO40.73 g)，VB1微量(10 mg)，加黃酒原酒定容至1.0 L。固體培養(yǎng)基加入2.0%的瓊脂。121℃滅菌15 min，備用。

2.3 酸敗黃酒原酒微生物分離及其發(fā)酵培養(yǎng)

采用固體PDA-黃酒培養(yǎng)基，平板劃線法反復分離純化培養(yǎng)酸敗黃酒中的菌株;革蘭氏染色后觀測分離菌株孢子形態(tài)。

液體PDA-黃酒培養(yǎng)基發(fā)酵培養(yǎng)分離純化得到的菌株。培養(yǎng)條件:150 mL三角瓶、每瓶30 mL液體PDA-黃酒培養(yǎng)基、兩步活化法培養(yǎng)分離的菌株［9-11］、搖床轉(zhuǎn)速180 r/min、溫度28℃、培養(yǎng)6 d后取出，發(fā)酵液濾紙過濾后繼以0.45 μm纖維素膜過濾，備用。

2.4 黃酒酸敗基源微生物檢出

采用2.1建立的方法檢測發(fā)酵液，分析對比微生物發(fā)酵產(chǎn)物與黃酒原酒及酸敗黃酒原酒的HPCE檢測結(jié)果，確定導致黃酒酸敗的可能基源微生物。

2.5 黃酒酸敗基源微生物導致黃酒酸敗性能的驗證

將黃酒酸敗基源微生物轉(zhuǎn)接入未變質(zhì)黃酒原酒中，采用2.3方法條件培養(yǎng)，HPCE對黃酒中的組分進行分析，以確定引起黃酒變質(zhì)的微生物。

3 結(jié)果和討論

3.1 黃酒酸敗組份HPCE檢出結(jié)果

在本實驗條件下，檢得10種黃酒原酒與10種酸敗黃酒原酒樣品成分HPCE模式圖如圖1所示。對比分析可見，黃酒各組分基本實現(xiàn)分離，各組分出峰時間主要集中在11.0～14.0 min(7個組分峰)和17.0～24.0 min(11個組分峰)。此外，7.0～9.0 min存在5個弱峰。多次重復測定，檢測到黃酒原酒的物質(zhì)峰數(shù)量、各組分的保留時間、峰面積等重現(xiàn)性良好，證明實驗建立的黃酒原酒HPCE檢測方法穩(wěn)定性、重現(xiàn)性較好。

圖1 黃酒原酒和酸敗黃酒原酒的組分HPCE檢測結(jié)果對比Fig.1 Comparison between yellow rice wine respondence to its rancid partener detected by established HPCE

相同條件下檢測酸敗黃酒原酒(圖1)，與黃酒原酒對比分析其保留時間、相對峰位置、峰形，在11.0 min前，未檢測到明顯組分峰，在11.0～14.0 min只有3個峰(僅有1個為共有峰，TR=11.8 min)，17.0～24.0 min部分僅有2個共有峰(TR=22.4 min，23.6 min)及3個小峰。在27.0～31.0 min，增加了5個峰，在TR=46.3 min處，新增了1個較強的峰。酸敗黃酒原酒與黃酒原酒HPCE檢測結(jié)果存在顯著差異。酸敗黃酒原酒是在生產(chǎn)原料黃酒過程中混進有害微生物，其生長代謝消耗醪液中的營養(yǎng)物質(zhì)，產(chǎn)生導致酸敗的物質(zhì)形成的。因此，酸敗黃酒的HPCE圖中新增的峰包含導致黃酒酸敗的部分或全部物質(zhì)，在11～27.0 min內(nèi)缺失的共有峰代表有害微生物發(fā)酵所消耗的組分。這為進一步追蹤黃酒酸敗的基源——有害微生物提供了可能。

3.2 酸敗黃酒原酒微生物分離結(jié)果

采用PDA-黃酒培養(yǎng)基、平板劃線法，反復分離純化培養(yǎng)后得到8株菌株，分別編號為OM-1～OM-8。其菌落形態(tài)及菌株細胞的形態(tài)如圖2、圖3所示。

圖2 酸敗黃酒原酒中分離的菌株菌落形態(tài)Fig.2 The microorganisms from the rancid yellow rice wine

圖3 酸敗黃酒原酒中分離的菌株細胞形態(tài)(放大1600倍)Fig.3 The microorganism from the rancid yellow rice wine

3.3 酸敗黃酒微生物發(fā)酵產(chǎn)物HPCE檢測結(jié)果

從酸敗黃酒原酒中分離的菌株OM-1～OM-8，采用液體PDA-黃酒培養(yǎng)基，經(jīng)搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，采用2.1構(gòu)建的黃酒酸敗組份HPCE檢出方法分析其發(fā)酵產(chǎn)物的組分，結(jié)果如圖4所示。在TR=27.0～31.0 min區(qū)間，菌株OM-1～OM-4、OM-6～OM-8發(fā)酵產(chǎn)物均未檢出與酸敗黃酒原酒的共有峰，表明菌株OM-1～OM-4、OM-6～OM-8不是導致黃酒酸敗的可能菌株。菌株OM-5發(fā)酵產(chǎn)物中檢測與黃酒酸敗組分的共有峰peak1～peak5(圖4)，而且共有峰peak1～peak4為酸敗黃酒原酒相對于黃酒原酒的特征峰——可能的酸敗組分HPCE色譜峰，提示菌株OM-5可能是導致黃酒酸敗的關(guān)鍵微生物之一。

為了探討OM-5菌株P(guān)DA-黃酒培養(yǎng)基發(fā)酵液檢出的peak1～peak5與黃酒組分的相關(guān)性，將OM-5菌株接種至復合PDA培養(yǎng)基(不含黃酒)及牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，在相同的條件下發(fā)酵培養(yǎng)6 d后，按2.1建立的HPCE分析方法檢測發(fā)酵液的組分，結(jié)果如圖5所示。在復合PDA培養(yǎng)基及牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基培養(yǎng)的OM-5發(fā)酵液中，未檢測到酸敗黃酒原酒特征指紋峰，進一步證明OM-5是產(chǎn)生酸敗黃酒原酒酸敗組分的菌株之一。

圖4 酸敗黃酒原酒分離菌株發(fā)酵液高效毛細管電泳檢測結(jié)果Fig.4 The HPCE analysis on the fermentation broth of the eight microorganisms isolated from rancid yellow rice wine

圖5 不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌株OM-5發(fā)酵液高效毛細管電泳檢測結(jié)果對比Fig.5 The HPCE analysis of the fermentation broth of OM-5 cultured with different mediums

3.4 黃酒酸敗基源微生物導致黃酒酸敗性能的驗證結(jié)果

將OM-5接入未酸敗的黃酒原酒，發(fā)酵培養(yǎng)6 d后，感官評價黃酒已酸敗變質(zhì)，HPCE檢測結(jié)果如圖6所示，OM-5菌株黃酒原酒發(fā)酵液出現(xiàn)了酸敗組分峰，提示OM-5菌株是導致黃酒酸敗的微生物之一。

4 結(jié)論與展望

由于黃酒發(fā)酵是一種特殊的不滅菌的開放式雙邊發(fā)酵［12］，環(huán)境、容器、工具等衛(wèi)生差，往往會造成雜菌的侵襲，出現(xiàn)污染和感染，本研究結(jié)果表明在生產(chǎn)過程中染菌可能是導致黃酒酸敗的主要原因之一。

在本實驗條件下，酸敗黃酒中可能的酸敗物質(zhì)峰，本實驗對導致黃酒原酒酸敗的產(chǎn)酸菌種類進行分離研究，共分離OM-1～OM-8八種菌株，HPCE檢測結(jié)果表明，OM-5菌株可能是導致黃酒原酒酸敗的主要菌株之一。研究結(jié)果對闡明黃酒生產(chǎn)過程中酸敗的產(chǎn)生機制、建立預防黃酒酸敗的質(zhì)量控制方法及酸敗預警系統(tǒng)提供參考依據(jù)。

圖6 OM-5菌株黃酒原酒發(fā)酵培養(yǎng)液HPCE檢測結(jié)果Fig.6 The HPCE analysis of the fermentation broth of OM-5 cultured with yellow rice wine

［1］ 李勇波，賴櫻花，成堅，等.HPLC檢測客家黃酒酸敗前后有機酸變化及工藝優(yōu)化［J］.中國釀造，2011(11):178-182.

［2］ 馮德明，剝峙清，馬紅霞，等.黃酒酸敗時主要有機酸種類及含量分析［J］.中國釀造，2010(1):125-128.

［3］ 蔡明迪，陳希，李汴生，等.超高壓處理對黃酒陳化的影響［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2011，37(1):26-31.

［4］ 朱一松，趙光鰲，帥桂蘭，等.超濾法生產(chǎn)的純生黃酒非生物穩(wěn)定性的研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2005，31(2):26-29.

［5］ 夏艷秋，朱強，汪志君.黃酒醪液酸敗的影響因素及控制［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(7):33-37.

［6］ 張遐耘.袋裝黃酒中雜菌的檢測［J］.中國釀造，2002(9):27-28.

［7］ 謝廣發(fā)，陳建堯，李旺軍，等.酸敗袋裝黃酒中污染微生物的檢測［J］.中國釀造，2008(12):78-80.

［8］ 毛青鐘，張水娟，魯瑞剛，等.黃酒倉庫貯存壇酒的酸敗原因及控制措施研究［J］.釀酒，2009，36(4):42-46.

［9］ CHEN Nai-dong， ZHANG Jian， LIU Ji-hua， et al.Microbial transformation of ruscogenin by Gliocladium deliquescens NRRL1086:glycosylation at C-1［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2010，86(2):491-497.

［10］ CHEN Nai-dong，YUE Lei，ZHANG Jian，et al.One unique steroidal sapogenin obtained through the microbial transformation of ruscogenin by Phytophthora cactorum ATCC 32134 and its potential inhibitory effect on tissue factor(TF)procoagulant activities［J］.Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters，2010，20(14):4 015-4 017.

［11］ CHEN Nai-dong，ZHANG Jian，LIU Ji-hua，et al.Highly efficient and regio-selective glucosylation of 25(S)ruscogenin by Gliocladium deliquescens NRRL1086 ［J］.Chinese Journal of Chemistry，2010，28(3):439-442.

［12］ 夏艷秋，朱強，汪志君.黃酒醪液酸敗的影響因素及控制［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2004，30(7):33-37.