李欣兒，王金晶，李崎

1(江南大學(xué)教育部工業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇無(wú)錫，214122)

2(江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與工程研究室，江蘇無(wú)錫，214122)

啤酒酵母在整個(gè)啤酒釀造過(guò)程中經(jīng)受著各種來(lái)自發(fā)酵環(huán)境和工藝操作的脅迫。從起始接種至充氣麥汁至最終發(fā)酵結(jié)束時(shí)收獲酵母泥，酵母細(xì)胞必須應(yīng)對(duì)原麥汁的高滲透壓、乙醇的逐漸積累和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)逐漸匱乏等壓力［1］。這些壓力會(huì)降低細(xì)胞活性甚至造成酵母自溶［2］。因此，啤酒酵母對(duì)這些壓力的耐受性直接影響發(fā)酵周期及成品啤酒的質(zhì)量，進(jìn)而影響著最終的經(jīng)濟(jì)效益。采用高濃度麥汁發(fā)酵和后稀釋技術(shù)是提高企業(yè)發(fā)酵設(shè)備的產(chǎn)能和利用率的有效手段［3］。然而，在高濃度麥汁發(fā)酵過(guò)程中，酵母需要應(yīng)對(duì)的壓力強(qiáng)度更大，提高其對(duì)發(fā)酵環(huán)境的耐受性就更加重要。因此，提高啤酒酵母的壓力耐受性對(duì)啤酒行業(yè)的發(fā)展意義重大。

在國(guó)內(nèi)啤酒行業(yè)，有關(guān)酵母應(yīng)對(duì)發(fā)酵環(huán)境壓力的研究尚處于起步階段，而在國(guó)外已經(jīng)獲得一定的重視。酵母應(yīng)對(duì)發(fā)酵環(huán)境壓力是一個(gè)系統(tǒng)的反應(yīng)，稱為一般壓力應(yīng)對(duì)機(jī)制(generous stress response)。GSR被認(rèn)為是酵母適應(yīng)環(huán)境的進(jìn)化結(jié)果，通常會(huì)引起約200個(gè)基因的上調(diào)及相應(yīng)的蛋白質(zhì)的表達(dá)量增加［4］。國(guó)外一些研究者通過(guò)基因操作使得這些基因中的一部分過(guò)量表達(dá)，從而獲得了壓力耐受菌株［5］。然而工程菌株在食品行業(yè)存在爭(zhēng)議性，使得這種方法的應(yīng)用受到一定的限制［6］。通過(guò)馴化獲得耐性菌株則有著周期長(zhǎng)，抗性種類單一的劣勢(shì)。根據(jù)前人對(duì)酵母應(yīng)對(duì)發(fā)酵環(huán)境壓力的影響研究發(fā)現(xiàn)，酵母細(xì)胞壁在壓力應(yīng)對(duì)過(guò)程中也發(fā)揮著重要的作用［7］。

啤酒酵母細(xì)胞壁是由甘露聚糖蛋白、β-1，6-葡聚糖、β-1，3-葡聚糖和幾丁質(zhì)等相互交聯(lián)構(gòu)成的復(fù)雜的雙層網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。內(nèi)層的β-1，3-葡聚糖和幾丁質(zhì)負(fù)責(zé)保持細(xì)胞壁的剛性，外層甘露糖蛋白通過(guò)β-1，6-葡聚糖連接到內(nèi)層則決定了細(xì)胞壁的透過(guò)性［8］。這些組分協(xié)同起來(lái)保護(hù)細(xì)胞，使細(xì)胞在壓力條件下能繼續(xù)保持活力。研究發(fā)現(xiàn)在應(yīng)對(duì)壓力時(shí)，細(xì)胞壁會(huì)發(fā)生結(jié)構(gòu)上的變化，如細(xì)胞壁變厚，甘露糖蛋白含量增加。這些變化使得細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)變強(qiáng)壯，更有利于細(xì)胞的生存［9］。關(guān)于酵母細(xì)胞壁的研究發(fā)現(xiàn)β-1，3-葡聚糖合成酶抑制劑抗性菌株的細(xì)胞壁組成會(huì)發(fā)生類似的變化［10］。米卡芬凈(Micafungin)是一種棘白菌素抗真菌藥物，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制β-1，3-葡聚糖合成酶合成真菌細(xì)胞壁必需成分β-1，3葡聚糖的合成［11］。研究發(fā)現(xiàn)棘白菌素抗性菌株的FKS1基因大都發(fā)生了突變，細(xì)胞壁應(yīng)急補(bǔ)償途徑基因出現(xiàn)上調(diào)，細(xì)胞壁幾丁質(zhì)和甘露糖蛋白含量的增加［10，12-13］。結(jié)合細(xì)胞壁甘露糖蛋白與壓力的抗性研究，推測(cè)米卡芬凈抗性菌株有很大幾率比原菌株的壓力抗性提高。因此本研究選擇以米卡芬凈抗性作為初篩的條件。

本方法采用傳統(tǒng)紫外誘變手段，以酵母細(xì)胞壁葡聚糖合成酶抑制劑-米卡芬凈(Micafungin)為抗性篩選條件，在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步篩選獲得耐高滲透壓、高濃度乙醇和高溫的優(yōu)良啤酒酵母菌株。此方法相對(duì)簡(jiǎn)單方便利于在生產(chǎn)中應(yīng)用。本文在此基礎(chǔ)上對(duì)篩選所得菌株和原菌株的壓力耐受途徑的基因進(jìn)行了RT-PCR分析進(jìn)而在基因?qū)用嫔戏治瞿蛪盒缘膩?lái)源。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

啤酒酵母Saccharomyces carlsbergenesis Y-1，江南大學(xué)啤酒實(shí)驗(yàn)室保藏。啤酒酵母MR0-8和MR1-2由Y-1經(jīng)過(guò)紫外誘變篩選得到，保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。主要培養(yǎng)基如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用的主要培養(yǎng)基Table 1 Main media used in this study

主要試劑和儀器:

米卡芬凈25%，國(guó)產(chǎn);高壓蒸汽滅菌鍋，日本Hirayama-HVE-50;5804 R臺(tái)式冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司;UV1102紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，上海尤尼柯儀器有限公司;電熱恒溫水浴鍋，上海醫(yī)用恒溫設(shè)備廠;HYG-A全溫?fù)u瓶柜，太倉(cāng)市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠;生化培養(yǎng)箱(SPX-250)，上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;HPX-180BS-Ⅱ恒溫恒濕培養(yǎng)箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司;超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)安泰公司;梅特勒pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器上海有限公司;顯微鏡，日本Olympus公司;熒光定量PCR儀，瑞士羅氏公司。

1.2 主要實(shí)驗(yàn)方法

紫外線誘變:取液體YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，離心收集菌體并用無(wú)菌水洗滌2次。用0.9%(w/v)無(wú)菌生理鹽水重懸菌體，使菌體濃度達(dá)到1×106個(gè)/mL。取10 mL菌液至直徑9 cm的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，并將培養(yǎng)皿放入已經(jīng)預(yù)熱15 min的紫外燈下(15 W，30 cm)。在磁力攪拌的同時(shí)，分別將菌液在紫外線處理 0，10，15，20，25，30，35 s。將處理后的菌液在紅外線燈下稀釋到合適濃度后分別涂布到Y(jié)PD平板上，避光28℃培養(yǎng)48 h，計(jì)算致死率。

米卡芬凈抗性菌株的平板分離:經(jīng)適當(dāng)紫外線處理的菌體懸液接入液體YPD培養(yǎng)基中，在28℃下避光培養(yǎng)10 h。取100 μL菌液涂布于含合適濃度的米卡芬凈YPD平板，并于28℃下培養(yǎng)4 d。挑選具有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的菌落，并保藏于斜面上以供進(jìn)一步分離篩選。

壓力平板復(fù)篩:啤酒酵母的各項(xiàng)耐壓性能的評(píng)價(jià)是根據(jù)菌體在不同壓力YPD平板培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)情況測(cè)定的。接種酵母菌株于20 mL液體YPD培養(yǎng)基中，28℃過(guò)夜培養(yǎng)，離心收集菌體，無(wú)菌水洗滌2次，并用0.9%(w/v)無(wú)菌生理鹽水重懸菌體。調(diào)節(jié)菌體濃度使菌體懸液OD600=1.0，10倍梯度稀釋，依次取4 μL點(diǎn)滴到測(cè)試平板。培養(yǎng)3 d，觀察生長(zhǎng)情況。乙醇耐受性的評(píng)價(jià)根據(jù)菌體在含8%和10%(v/v)乙醇的YPD平板上的梯度生長(zhǎng)情況測(cè)定。高溫耐受性的評(píng)價(jià)根據(jù)菌體在35℃下YPD平板的梯度生長(zhǎng)情況測(cè)定。營(yíng)養(yǎng)饑餓耐受性的評(píng)價(jià)根據(jù)在無(wú)菌水中28℃搖瓶培養(yǎng)24 h后的菌體在YPD平板上的梯度生長(zhǎng)情況表征其營(yíng)養(yǎng)耐受性。高滲透壓耐受性以菌體在含1 mol/L NaCl的YPD固體培養(yǎng)基上的梯度生長(zhǎng)情況進(jìn)行評(píng)價(jià)。

菌株關(guān)鍵基因的RT-PCR分析:

提取總RNA:將培養(yǎng)至穩(wěn)定期的菌體懸液加入乙醇使其終體積分?jǐn)?shù)為10%。繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，未處理菌液與處理菌液一起用天根公司總RNA提取試劑盒進(jìn)行總RNA提取操作。

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按照Takara公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript?RT reagent Kit使用說(shuō)明，將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系如下:

表2 cDNA合成體系組成Table 2 The components for reverse transcription

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件如下:

37℃ 15 min(反轉(zhuǎn)錄反應(yīng))

85℃ 5 s(反轉(zhuǎn)錄酶的失活反應(yīng))

將反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA保存在-4℃冰箱中，可長(zhǎng)期保存。

qRT-PCR驗(yàn)證:應(yīng)用LightCycler Real Time PCR擴(kuò)增儀(Roche Diagnostics)的操作方法，使用Takara公司的SYBR Premix Ex Taq試劑盒，以基因 FKS1 FKS2 MSN2 MSN4 WSC2 SLT2 RHO1 CHS3 MNN9 KRE6 RLM1為引物，按照使用說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。條件如下:

95℃預(yù)變性30 s

95℃ 5 s→55℃ 20 s，40次循環(huán)(PCR反應(yīng))

95℃ 10 s→65℃ 1 min→95℃ 10 s

為保證試驗(yàn)的重現(xiàn)性，每個(gè)樣品3個(gè)平行，然后取平均值作為計(jì)算的基礎(chǔ)。

表3 qRT-PCR驗(yàn)證引物Table 3 Oligo nucleotides used in qRT-PCR verification

1.3 主要分析方法

采用酸化力法測(cè)定酵母細(xì)胞活性。

主發(fā)酵結(jié)束后，收集酵母細(xì)胞，3 000 g，1 min離心3次得干凈細(xì)胞菌體。將1.8 g上述酵母泥轉(zhuǎn)到250 mL燒杯中，加入100mL蒸餾水(25℃)，在燒杯中加入攪拌子以100 r/min攪拌，將pH計(jì)插到懸浮液中，并立即開(kāi)始計(jì)時(shí)，每10 min后測(cè)定懸浮液的pH值，同時(shí)加5mL的20.2%(w/v)葡萄糖溶液到酵母懸浮液中，繼續(xù)攪拌懸浮液，再過(guò)10 min后，測(cè)量懸液pH。酸化力(acidification power，AP)的計(jì)算:AP=6.3-pH20。

2 結(jié)果與分析

2.1 壓力耐受啤酒酵母的篩選

2.1.1 出發(fā)菌株Y-1的紫外線致死曲線

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的出發(fā)菌株Y-1在紫外線下照射不同時(shí)間。平板活菌計(jì)數(shù)法用來(lái)計(jì)算致死率。啤酒酵母Y-1的紫外線致死曲線如圖1。

由圖1可以看出:由于啤酒酵母的選育需要考慮到改良菌株的成品啤酒主題風(fēng)味基本不變，一般選擇致死率在75% ～85%之間［14］。根據(jù)圖1，將細(xì)胞懸浮液在功率15W，距離30 cm處接受紫外處理25 s(80% 致死率)，作為最佳處理?xiàng)l件進(jìn)行誘變。

2.1.2 米卡芬凈抗性濃度的確定

圖1 不同照射時(shí)間下菌株致死率的分布情況Fig.1 The yeast lethality under different UV exposure time

在YPD培養(yǎng)基中添加不同濃度的米卡芬凈，測(cè)定不同濃度對(duì)菌體的生長(zhǎng)抑制情況。結(jié)果如圖2所示。當(dāng)米卡芬凈濃度達(dá)到35 ng/mL時(shí)，菌株Y-1的生長(zhǎng)被完全抑制。因此選擇35 ng/mL的米卡芬凈濃度作為篩選條件。

2.1.3 壓力耐受菌株的篩選

培養(yǎng)啤酒酵母Y-1至對(duì)數(shù)期進(jìn)行紫外線誘變處理，經(jīng)過(guò)12 h避光培養(yǎng)后，誘變菌懸液涂布到含有35 ng/mL濃度的米卡芬凈的YPD平板。培養(yǎng)4 d后，選取40個(gè)生長(zhǎng)良好的菌落在壓力平板上培養(yǎng)(見(jiàn)1.2主要實(shí)驗(yàn)方法)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)菌株MR0-8和MR1-2表現(xiàn)了顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)(圖3)，并且1、4、12、15代菌株仍然具有米卡芬凈抗性及壓力平板上的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。因此，通過(guò)上述方法成功篩選到壓力耐受菌株MR0-8和MR1-2。

圖2 不同濃度米卡芬凈下菌株Y-1的存活率Fig.2 The survival percent of Y-1 in the presence of micafungin

圖3 啤酒酵母菌株Y-1，MR0-8和MR1-2在體積分?jǐn)?shù)為8% ～10%的乙醇，1 mol/L NaCl，35℃和饑餓壓力下的生長(zhǎng)表現(xiàn)Fig.3 Growth performances of strain Y-1，MR0-8，and MR1-2 in the presence of 8% ～10%(v/v)ethanol，1 mol/L NaCl，35℃ and starvation stress

2.2 發(fā)酵結(jié)束酵母細(xì)胞活力的比較

發(fā)酵過(guò)程中酵母受到各種壓力的脅迫，會(huì)降低細(xì)胞活力甚至引起細(xì)胞死亡。發(fā)酵結(jié)束后收集酵母測(cè)定細(xì)胞活性，結(jié)果如圖4所示。

圖4 發(fā)酵結(jié)束酵母細(xì)胞酸化力比較Fig.4 Cell viability was determined as the acidification power of cells cropped at the end of fermentation(Data are mean±standard deviation of three replicates)

酵母細(xì)胞的酸化力越大活性越高，健康強(qiáng)壯的酵母酸化力值一般不小于2.5［15］。優(yōu)選菌株MR0-8和MR1-2的酸化力值都高于2.5，相比原菌株Y-1分別提高了19%和34%。

2.3 關(guān)鍵基因的RT-PCR分析

2.3.1 優(yōu)選菌與原菌在正常條件下的基因表達(dá)

如圖5所示，相比于出發(fā)菌株 Y-1，優(yōu)選菌株MR1-2在壓力基因以及細(xì)胞壁基因的表達(dá)都有不同程度的提升，尤其以FKS2，RLM1和MNN9的表達(dá)量提升最為突出。優(yōu)選菌株MR1-2的篩選是基于其米卡芬凈抗性篩選的，而米卡芬凈正是抑制FKS1基因的表達(dá)產(chǎn)物，所以也許正是FKS1的表達(dá)量下降賦予了菌株的米卡芬凈抗性同時(shí)誘導(dǎo)了細(xì)胞壁完整性基因的表達(dá)。推測(cè)這些細(xì)胞壁完整性基因和壓力應(yīng)對(duì)基因MSN2，MSN4的高表達(dá)提高了菌株MR1-2的壓力耐受性。

圖5 優(yōu)選菌株MR1-2對(duì)比原菌株Y-1在正常條件下細(xì)胞壁完整性基因及壓力基因的表達(dá)Fig.5 Relative expressions of the yeast genes involved in the cell wall integrity pathway and in the general stress response

2.3.2 優(yōu)選菌與原菌在10%乙醇?jí)毫ο碌幕虮磉_(dá)

圖6表示菌株Y-1和MR1-2相關(guān)基因在高乙醇濃度壓力下相對(duì)于原菌株的正常條件下的表達(dá)情況。由圖6可以看出2株菌株應(yīng)對(duì)乙醇?jí)毫?，相關(guān)基因的表達(dá)情況表現(xiàn)出很大差異。在應(yīng)對(duì)乙醇?jí)毫r(shí)，Y-1的相關(guān)基因表達(dá)模式與MR1-2在正常條件下的表達(dá)模式相似。與Y-1不同的是，在MR1-2中除了FKS2的表達(dá)有明顯上調(diào)之外，其他基因則表現(xiàn)出不變化甚至下調(diào)的趨勢(shì)。由于本文未對(duì)壓力應(yīng)答網(wǎng)絡(luò)及細(xì)胞壁完整性網(wǎng)絡(luò)的所有基因進(jìn)行分析，所以有待進(jìn)一步探索。

圖6 優(yōu)選菌株MR1-2與原菌株Y-1在乙醇?jí)毫ο聦?duì)比正常條件下細(xì)胞壁完整性基因及壓力基因的表達(dá)Fig.5 Relative expressions of the yeast genes involved in the cell wall integrity pathway and in the general stress response under ethanol stress

2.3.3 優(yōu)選菌與原菌在1 mol/L NaCl壓力下的基因表達(dá)

圖7表示菌株Y-1和MR1-2相關(guān)基因在高滲透壓壓力下相對(duì)于原菌株的正常條件下的表達(dá)情況。

圖7 優(yōu)選菌株MR1-2與原菌株Y-1在1M NaCl壓力下對(duì)比正常條件下細(xì)胞壁完整性基因及壓力基因的表達(dá)Fig.7 Relative expressions of the yeast genes involved in the cell wall integrity pathway and in the general stress response under hyperosmolarity stress

由圖7可以觀察到菌株MR1-2在應(yīng)對(duì)高滲透壓壓力時(shí)，應(yīng)答基因MSN2和MSN4表達(dá)量急劇增加。同時(shí)細(xì)胞壁完整性相關(guān)基因的表達(dá)量都大幅升高。推測(cè)，菌株MR1-2對(duì)滲透壓壓力相比較乙醇?jí)毫Ω鼮槊舾?，因此通過(guò)增加基因表達(dá)量進(jìn)而加強(qiáng)相關(guān)蛋白質(zhì)的合成進(jìn)而應(yīng)對(duì)壓力。在高滲透壓壓力下，出發(fā)菌株Y-1的壓力應(yīng)答基因MSN2和MSN4的表達(dá)量也明顯增加。除去基因FKS1、FKS2和RHO1的表達(dá)量降低，其他細(xì)胞壁完整性基因則表達(dá)增加。聯(lián)系乙醇?jí)毫透邼B透壓壓力，出發(fā)菌株Y-1的相關(guān)基因量表達(dá)整體上調(diào)，而優(yōu)選菌MR1-2的基因表達(dá)則表現(xiàn)出更復(fù)雜的情況。優(yōu)選菌株壓力耐受性的來(lái)源需要進(jìn)一步的基因芯片分析。

3 結(jié)論

啤酒酵母Y-1在紫外線處理后在米卡芬凈平板上篩選出米卡芬凈抗性菌株。抗性菌株進(jìn)一步在乙醇，高滲透壓，高溫，營(yíng)養(yǎng)缺陷壓力條件下培養(yǎng)。生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)明顯的MR0-8和MR1-2被篩出為壓力耐受菌株。

對(duì)2株篩選菌株MR0-8，MR1-2和原菌株Y-1的發(fā)酵效率進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)優(yōu)選菌株比原菌株發(fā)酵效率有提高，尤其以MR1-2更為明顯。發(fā)酵結(jié)束后，收集酵母細(xì)胞測(cè)定細(xì)胞活力及蛋白酶A釋放含量。結(jié)果表明:與出發(fā)菌株 Y-1相比，突變菌株 MR0-8和MR1-2發(fā)酵結(jié)束細(xì)胞活力分別提高了19%和34%。進(jìn)一步對(duì)原菌株Y-1和突變株MR1-2進(jìn)行了RTPCR分析。結(jié)果顯示:正常條件下，MR1-2的壓力應(yīng)答及細(xì)胞壁完整性相關(guān)基因表達(dá)比出發(fā)菌株Y-1大部分都有不同程度的提高，尤其以FKS2，RLM1和MNN9的表達(dá)量提升最為突出。在應(yīng)對(duì)乙醇?jí)毫透邼B透壓壓力時(shí)，在Y-1中引起了絕大部分基因的不同程度的上調(diào)，而優(yōu)選菌株MR1-2的基因則表現(xiàn)了復(fù)雜的應(yīng)答反應(yīng)，有待進(jìn)一步探索。

［1］ Ekberg J，Rautio J，Mattinen L，et al.Adaptive evolution of the lager brewing yeast Saccharomyces pastorianus for improved growth under hyperosmotic conditions and its influence on fermentation performance［J］.FEMS Yeast Res 2013，13(3):335-349.

［2］ Powell C D，Van Zandycke S M，Quain D E，et al.Replicative ageing and senescence in Saccharomyces cerevisiae and the impact on brewing fermentations［J］.Microbiology 2000，146(5):1 023-1 034.

［3］ Stewart G G.High-gravity brewing and distilling—past experiences and future prospects［J］.Journal of the American Society of Brewing Chemists 2010，68(7):2-10.

［4］ Gibson B R，Lawrence S J，Leclaire J P，et al.Yeast responses to stresses associated with industrial brewery handling［J］.FEMS Microbiol Rev 2007，31(5):535-69.

［5］ Fierro-Risco J，Rincón A M，Benítez T，et al.Overex-pression of stress-related genes enhances cell viability and velum formation in Sherry wine yeasts［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2013，97(15):6 867-6 881.

［6］ Saerens S M，Duong C T，Nevoigt E.Genetic improvement of brewer's yeast:current state，perspectives and limits［J］.Appl Microbiol Biotechnol，2010，86(5):1195-212.

［7］ Levin D E.Cell wall integrity signaling in Saccharomyces cerevisiae［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2005，69(2):262-91.

［8］ Lesage G，Bussey H.Cell wall assembly in Saccharomyces cerevisiae［J］.Microbiol Mol Biol Rev，2006，70(2):317-43.

［9］ Ogawa Y，Nitta A，Uchiyama H，et al.Tolerance mechanism of the ethanol-tolerant mutant of sake yeast［J］.J Biosci Bioeng，2000，90(3):313-20.

［10］ Nitta A，Uchiyama H，Imamura T.Breeding of ethanoltolerant sake yeasts from K1 killer-resistant mutants［J］.J Biosci Bioeng，2000，89(3):294.

［11］ Wiederhold N P，Lewis J S.The echinocandin micafungin:a review of the pharmacology，spectrum of activity，clinical efficacy and safety［J］.Expert opin Pharmacother，2007，8(8):1 155-1 166.

［12］ Wiederhold NP，Kontoyiannis DP，Prince RA，Lewis RE.Attenuation of the activity of caspofungin at high concentrations against Candida albicans:possible role of cell wall integrity and calcineurin pathways［J］.Antimicrobial Agents and Chemotherapy，2005，49(12):5 146-5 148.

［13］ Miller C D，Lomaestro B W，Park S，et al.Progressive esophagitis caused by Candida albicans with reduced susceptibility to caspofungin［J］.Pharmacotherapy:The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy，2006，26(6):877-880.

［14］ 李崎.啤酒風(fēng)味及風(fēng)味穩(wěn)定性的研究［D］.無(wú)錫:無(wú)錫輕工大學(xué)，1998.

［15］ 徐鳳，顧國(guó)賢，李崎，等.啤酒連續(xù)發(fā)酵中酵母生理狀態(tài)的初步研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2002，28(5):28-31.