張 騰，田建軍，李梓媛，賈原博，賀銀鳳

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特010018)

群體感應(yīng)即微生物群體感應(yīng)(quorum sensing，簡(jiǎn)稱QS)即細(xì)菌隨著菌體密度的增大和生長(zhǎng)周期的變化分泌出一種或幾種化學(xué)信號(hào)分子，通過(guò)這些信號(hào)分子進(jìn)行種內(nèi)或種間交流，協(xié)調(diào)群體行為［1］。目前發(fā)現(xiàn)的群體感應(yīng)信號(hào)分子大致有三類，其中第二類信號(hào)分子AI-2(Autoinducer-2)作為普遍存在于革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌中的一種信號(hào)分子在微生物群體感應(yīng)現(xiàn)象的研究領(lǐng)域備受人們的關(guān)注。

1993 年，Bassler［1］等最初在哈維氏弧菌(Vibro harveyi)中發(fā)現(xiàn)AI-2作為信號(hào)分子調(diào)控V.harveyi的生物發(fā)光現(xiàn)象，這是AI-2首次被人們所知。luxS基因作為細(xì)胞內(nèi)合成AI-2信號(hào)分子的關(guān)鍵基因，經(jīng)常被用作證明AI-2信號(hào)分子的存在。在發(fā)現(xiàn)信號(hào)分子AI-2之后的十幾年里，陸續(xù)在大約70多個(gè)種屬的微生物基因組中發(fā)現(xiàn)luxS基因的同源序列并檢測(cè)到信號(hào)分子 AI-2［2］。

近幾年的研究發(fā)現(xiàn)，AI-2/LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)在很多種屬微生物的生物膜形成過(guò)程中均起到至關(guān)重要的作用。在嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)中l(wèi)uxS的突變菌株由于不產(chǎn)生AI-2信號(hào)分子，其生物膜的合成受到了影響，與野生型相比對(duì)腸上皮細(xì)胞的粘附性下降了58%［3］。糞腸球菌V583(Enterococcus faecalis V583)在外源添加AI-2信號(hào)分子之后，其生物膜的合成量增加了23%［4］。變形鏈球菌UA159(Streptococcus mutans UA159)的 luxS基因突變株與野生型相比包括與生物膜形成相關(guān)的大量基因表達(dá)量均有所下調(diào)［5］。

植物乳桿菌HE-1分離自內(nèi)蒙古錫盟地區(qū)的酸馬奶酒，本實(shí)驗(yàn)室前期的研究發(fā)現(xiàn)該菌種具有產(chǎn)抑菌物質(zhì)、發(fā)酵大量產(chǎn)酸和產(chǎn)游離氨基酸能力強(qiáng)等優(yōu)秀的特性，具有作為益生菌開發(fā)腸道益生產(chǎn)品的潛質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)對(duì)植物乳桿菌HE-1生物膜形成與AI-2/LuxS群體感應(yīng)相關(guān)關(guān)系進(jìn)行研究，以期找到其生物膜形成與AI-2信號(hào)分子產(chǎn)生二者之間的規(guī)律，為利用AI-2/LuxS群體感應(yīng)調(diào)控生物膜大量生成打下理論基礎(chǔ)，進(jìn)而為植物乳桿菌HE-1日后被開發(fā)利用為腸道益生菌做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

VICTOR X3 Multilabel Plate Reader 美國(guó)Perkin Elmer儀器有限公司;Thermo Scientific Multiskan FC酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo公司;96孔酶標(biāo)板 美國(guó)Corning公司;MRS培養(yǎng)基 廣東環(huán)凱公司。

2216海生菌培養(yǎng)基 青島海博公司;細(xì)菌基因組提取試劑盒 北京天根公司;rTaq酶 Takara公司;氨芐抗性pMD19-T質(zhì)粒 北京全式金公司;引物合成與測(cè)序服務(wù) 北京中美泰和公司。

1.2 菌種的保藏和活化

將植物乳桿菌HE-1接種于MRS培養(yǎng)基中活化三代，在第三代生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的發(fā)酵液中加入甘油至終濃度為20%，分裝入1.5mL離心管置于-20℃冰箱進(jìn)行保藏。每次使用按1%的接種量接種于新鮮MRS培養(yǎng)基中，連續(xù)活化三代可用于實(shí)驗(yàn)。Vibro harveyi BB170使用2216海生菌培養(yǎng)基活化三代，在第三代生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)期的發(fā)酵液中加入甘油至濃度為20%，分裝入1.5mL離心管置于-80℃冰箱進(jìn)行保藏。每次使用按1%的接種量接種于新鮮AB培養(yǎng)基［6］中，過(guò)夜培養(yǎng)后可用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 AI-2信號(hào)分子的檢測(cè)

活化三代后的植物乳桿菌HE-1按1%接種量接種于新鮮MRS培養(yǎng)基中。從3h至30h，每隔3h取5mL發(fā)酵上清液，600r/min離心5min后使用0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩Ｅc此同時(shí)每隔兩小時(shí)測(cè)定一次OD600nm吸光度值并繪制生長(zhǎng)曲線。

發(fā)光檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法據(jù)文獻(xiàn)［6］得到。30℃條件下，將Vibro harveyi BB170接種于AB培養(yǎng)基中有氧過(guò)夜培養(yǎng)。當(dāng)培養(yǎng)基OD600nm吸光度值為1左右時(shí)，按照1∶5000比例稀釋到新鮮AB培養(yǎng)基中，混勻備用。將上述制備好的菌株HE-1各時(shí)間點(diǎn)發(fā)酵上清液與稀釋后含有Vibro harveyi BB170的 AB培養(yǎng)基按照1∶100的比例混勻。在AB培養(yǎng)基陰性對(duì)照熒光強(qiáng)度最低點(diǎn)時(shí)(大約混勻后3.5h)使用多功能酶標(biāo)儀的化學(xué)發(fā)光模式對(duì)各樣品熒光強(qiáng)度進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品3個(gè)平行，每個(gè)平行均取復(fù)孔。得到各樣品熒光強(qiáng)度后計(jì)算其相對(duì)熒光強(qiáng)度(相對(duì)熒光強(qiáng)度=樣品熒光強(qiáng)度/AB陰性對(duì)照)。

1.4 生物膜形成的檢測(cè)

生物膜檢測(cè)實(shí)驗(yàn)方法參見文獻(xiàn)［5］。簡(jiǎn)而言之，生物膜形成裝置為96孔酶標(biāo)板，每孔加入200μL新鮮MRS培養(yǎng)基，按照1%比例接種菌株HE-1至每個(gè)孔中，37℃靜置培養(yǎng)。分別于 6、12、18、24、30h 將對(duì)應(yīng)孔中發(fā)酵液倒出，使用生理鹽水小心沖洗微孔，重復(fù)3次。待酶標(biāo)板晾干之后使用濃度為1%的結(jié)晶紫染液對(duì)微孔染色15min，之后再使用生理鹽水小心沖洗3次。再次晾干之后使用200μL乙醇和丙酮體積比為4∶1的脫色劑對(duì)附著于生物膜上的結(jié)晶紫染液進(jìn)行脫色后，酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀OD595nm下測(cè)定吸光度值，記錄數(shù)值，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)三個(gè)平行。

1.5 DNA的提取與luxS基因的擴(kuò)增

使用細(xì)菌基因組提取試劑盒對(duì)植物乳桿菌HE-1的基因組DNA進(jìn)行提取，提取方法詳見試劑盒說(shuō)明書。上述提取出的DNA作為模板，luxS基因擴(kuò)增使用引物為luxS-F(5'-ATGGCTAAAGTAGAAAGTT-3')和 luxS-R(5'-CTATTCAACGACTTTGCGT-3')。PCR反應(yīng)體系為:0.25μL Taq;5μL 10×PCR Buffer;4μL dNTP Mixture(各 2.5mmol/L);1μL 模板(約50ng/μL);正反向引物各加 0.5μL(20μmol/L);加去離子水補(bǔ)齊體系至50μL。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3min;每個(gè)循環(huán)中在94℃下變性30min，55℃下退火30min，72℃延伸1min;30個(gè)循環(huán);最后72℃補(bǔ)充延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，目的條帶在500bp左右。使用膠回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收，膠回收產(chǎn)物與pMD19-T質(zhì)粒連接后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)藍(lán)白斑和卡那抗性篩選后，選出陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR鑒定，將鑒定結(jié)果正確的單克隆菌株送測(cè)序。植物乳桿菌HE-1的luxS基因片段已在Genbank上注冊(cè)，登錄號(hào)為KC914585。

1.6 同源性分析與系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

利用 BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)，將所測(cè)定菌株的 luxS基因序列，與GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中已知細(xì)菌的luxS序列進(jìn)行比較鑒定，尋找與目的基因序列同源性最高的已知分類地位的菌種。后從GenBank/EMBL/DDBJ數(shù)據(jù)庫(kù)中選取不同標(biāo)準(zhǔn)菌種luxS基因序列。將參比序列與測(cè)定菌株的 luxS序列，分別用Clustal1.8進(jìn)行校準(zhǔn)排齊，使用MEGA5.1的最大似然法(maximum likelihood，ML)繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 AI-2信號(hào)分子檢測(cè)及與生物膜形成之間的相關(guān)關(guān)系

從圖1的折線趨勢(shì)可以看出，AI-2信號(hào)分子從菌株HE-1培養(yǎng)到9h時(shí)開始產(chǎn)生，在18h處的生成量達(dá)到最大值，相對(duì)熒光強(qiáng)度達(dá)到62.7。之后由AI-2信號(hào)分子誘導(dǎo)的熒光強(qiáng)度開始較為迅速的減弱，在培養(yǎng)至30h的發(fā)酵上清液中則基本沒有AI-2信號(hào)分子存在。

圖1中柱狀圖即為不同培養(yǎng)時(shí)間菌株HE-1生物膜的生成量。從12h處可以較為顯著的檢測(cè)出生物膜已經(jīng)開始生成，在12h到18h之間生物膜的合成活動(dòng)最為旺盛，18h處由生物膜結(jié)合而釋放出來(lái)的結(jié)晶紫染液的OD595nm吸光度值達(dá)到1.337。從18h到30h，生物膜的合成活動(dòng)基本停止，生物膜的總量也趨于穩(wěn)定。

圖1 菌株HE-1生物膜合成與AI-2信號(hào)分子生成二者之間的關(guān)系Fig.1 The relationship between the production of AI-2 and the biofilm formation

結(jié)合菌株HE-1的AI-2信號(hào)分子產(chǎn)生規(guī)律和生物膜合成的趨勢(shì)可以看出，AI-2信號(hào)分子在12h到18h達(dá)到生成的高峰期，巧合的是與此同時(shí)生物膜也進(jìn)入合成的高峰期，二者的生成量在時(shí)間點(diǎn)上非常相似與吻合。結(jié)合圖2可以看出，二者均為培養(yǎng)至穩(wěn)定期初期約12h處開始大量產(chǎn)生，到18h時(shí)生成量基本達(dá)到最大值。不同的是，AI-2在達(dá)到最大生成量之后在發(fā)酵上清液中的數(shù)量開始迅速減少，而生物膜的存在量較為穩(wěn)定。在鼠李乳桿菌GG(Lactobacillus rhamnosus)中，luxS突變株的生物膜合成量不到野生型菌株的20%，當(dāng)往luxS缺陷株轉(zhuǎn)化帶有啟動(dòng)子的luxS序列之后，生物膜的形成得到很好的回補(bǔ)，證明luxS基因在Lactobacillus rhamnosus GG生物膜的形成中起到關(guān)鍵的作用［7］。故從前人研究成果和以上結(jié)果可以看出，在菌株HE-1中AI-2生成的時(shí)間趨勢(shì)與生物膜合成的趨勢(shì)有較大的相關(guān)性，并且產(chǎn)生時(shí)間基本都在穩(wěn)定期初期，可以推測(cè)生物膜的合成與AI-2的調(diào)控作用有較為密切的關(guān)系。

圖2 菌株HE-1不同培養(yǎng)時(shí)間OD600nm吸光度值Fig.2 The OD600nmabs of HE-1 in different incubation time

2.2 luxS基因的擴(kuò)增及同源性和系統(tǒng)發(fā)育分析

以植物乳桿菌HE-1基因組DNA作為模板，使用引物luxS-F和luxS-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，在500bp左右有目的條帶，與NCBI公布的植物乳桿菌luxS基因大小一致。

圖3 luxS基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.3 PCR amplication of the luxS gene

如圖4可知，植物乳桿菌HE-1的luxS序列與金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、Enterococcus faecalis V583和大腸桿菌 O103∶H2(Escherichia coli O103∶H2)等菌株的luxS序列同源性均小于60%。而與其他乳桿菌屬的luxS基因序列同源性均大于66%，其中與 Lactobacillusplantarum WCFS1和Lactobacillus plantarum ZJ316菌株luxS基因的同源性分別為99.4%和99%。由圖5可以看出，不同菌種的luxS基因序列的同源性進(jìn)化距離較遠(yuǎn)，進(jìn)化樹中有3個(gè)大類群，乳桿菌屬所有l(wèi)uxS基因均在第一類群中，其中菌株HE-1、Lactobacillus plantarum WCFS1和Lactobacillus plantarum ZJ316均在最上端小分支中，進(jìn)化距離很相近。故可知植物乳桿菌HE-1的luxS基因是從乳桿菌屬親緣關(guān)系較近的菌種進(jìn)化而來(lái)，并與植物乳桿菌同源性最高。

圖4 菌株HE-1 luxS基因同源性分析Fig.4 luxS gene homologous analysis of HE-1

圖5 菌株HE-1 luxS基因系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建Fig.5 Phylogenetic tree of HE-1 constructed based on luxS sequence analysis

luxS基因是原核微生物的獨(dú)有基因，它翻譯出的蛋白LuxS作用于S-腺苷甲硫氨酸(SAM)代謝途徑的下游，LuxS蛋白普遍被人們認(rèn)為用來(lái)合成AI-2信號(hào)分子。故對(duì)luxS基因進(jìn)行擴(kuò)增并分析其同源性，可以從分子生物學(xué)的角度進(jìn)一步驗(yàn)證AI-2信號(hào)分子的產(chǎn)生。

3 結(jié)論

3.1 實(shí)驗(yàn)首次驗(yàn)證了在Lactobacillus plantarum中，生物膜的形成與AI-2的生成二者之間有著密切的關(guān)系。通過(guò)檢測(cè)菌株HE-1在培養(yǎng)不同時(shí)間點(diǎn)AI-2信號(hào)分子的產(chǎn)生量和不同時(shí)間點(diǎn)生物膜的形成量，發(fā)現(xiàn)二者之間在開始產(chǎn)生的時(shí)間和數(shù)量上都非常相似和吻合，故推測(cè)菌株HE-1生物膜的形成與AI-2/LuxS群體感應(yīng)系統(tǒng)有較為密切的關(guān)系。

3.2 成功擴(kuò)增出植物乳桿菌HE-1的luxS基因，同源性及系統(tǒng)發(fā)育分析顯示其與已知植物乳桿菌luxS基因同源性高達(dá)99%以上，從分子生物學(xué)角度驗(yàn)證了植物乳桿菌HE-1可以產(chǎn)生AI-2信號(hào)分子。

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