董 梅，李亞輝，樊明濤，李愛霞，王盼雪

(西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西楊凌712100)

葡萄酒的釀造過程主要包括兩個(gè)階段:酵母主導(dǎo)的酒精發(fā)酵和乳酸菌主導(dǎo)的蘋果酸-乳酸發(fā)酵，蘋果酸-乳酸發(fā)酵對(duì)葡萄酒香氣物質(zhì)的形成具有重要作用［1-2］。

目前，酒類酒球菌是啟動(dòng)葡萄酒蘋果酸-乳酸發(fā)酵最重要、應(yīng)用最廣泛的乳酸菌。酒類酒球菌能夠適應(yīng)葡萄酒中苛刻環(huán)境，較專一地進(jìn)行蘋果酸-乳酸發(fā)酵，大大改善葡萄酒的品質(zhì)［3-4］，近年來對(duì)此類菌的研究有大量報(bào)道［5-6］。葡萄酒的香氣除了來自葡萄本身的果香外，很大一部分來自酒中結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)糖苷降解產(chǎn)生的游離態(tài)香氣物質(zhì)［7-8］。酶解具有高效、專一、條件溫和等特點(diǎn)，在實(shí)際生產(chǎn)中一般采用此方法來降解葡萄酒中結(jié)合態(tài)呈香物質(zhì)，產(chǎn)生揮發(fā)性香氣物質(zhì)，增加葡萄酒香氣、改善葡萄酒風(fēng)味。

β-D-葡萄糖苷酶是降解結(jié)合態(tài)香氣物質(zhì)的關(guān)鍵酶，它能催化水解芳基或烴基與糖基之間的糖苷鍵生成葡萄糖及揮發(fā)性物質(zhì)［9］。酒類酒球菌31MBR是國內(nèi)常用的一株釀酒乳酸菌，具有良好的蘋果酸乳酸發(fā)酵性能，已有研究表明，此菌產(chǎn)生的 β-D-葡萄糖苷酶酶活較高，且為胞內(nèi)可溶性酶［10］。對(duì)胞內(nèi)酶檢測(cè)需要進(jìn)行細(xì)胞破碎處理，目前報(bào)道的物理研磨法、化學(xué)溶解法等，效果不是十分理想，酶活不能精確測(cè)定［11］。超聲波破碎法對(duì)其他生物性材料酶提取的效果較好，本文系統(tǒng)地研究超聲波對(duì)酒類酒球菌細(xì)胞的破碎效果和對(duì)β-D-葡萄糖苷酶酶活的影響，對(duì)乳酸菌屬微生物葡萄糖苷酶的提取分離純化具有一定指導(dǎo)意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

酒類酒球菌31MBR為實(shí)驗(yàn)室保存菌株。

對(duì)-硝苯-β-葡萄糖苷(p-NPG) 美國Sigma公司;所用其他試劑均為分析純，西隴化學(xué)試劑。

ATB培養(yǎng)基:蛋白胨 10g/L，酵母浸粉 5g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，葡萄糖 10g/L，MnSO4·4H2O 0.05 g/L，鹽酸半胱氨酸0.5g/L，實(shí)驗(yàn)室自制番茄汁250mL/L，pH 調(diào)至 4.8，121℃滅菌20min。

HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司;HS-840μ型水平層流單人凈化工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;UV-3802H紫外可見分光光度儀 上海尤尼柯儀器有限公司;VC-130超聲波細(xì)胞破碎儀 美國Sonics＆Materials公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌體制備 酒類酒球菌31MBR于ATB固體培養(yǎng)基中25℃靜置培養(yǎng)，在ATB液體培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接2次，分別培養(yǎng)40h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)末期。取1mL菌液，離心收集菌體(4℃，5000×g，10min)。用 150mmol/L NaCl洗滌菌體，離心(4℃，5000 ×g，10min)棄上清液。重復(fù)洗滌三次，收集菌體備用。

1.2.2 葡萄糖苷酶提取方法

1.2.2.1 超聲波破碎法 用1mL PBS緩沖液(NaCl 140mmol/L;KCl2.7mmol/L;Na2HPO410mmol/L;KH2PO41.8mmol/L;pH7.4)重新懸浮菌體，混勻，將菌體置于冰上，進(jìn)行超聲波破碎，破碎后離心(4℃，12000×g，10min)，上清液即為粗酶液。

1.2.2.2 反復(fù)凍融法破碎細(xì)胞 菌體經(jīng)洗滌后加入1mL PBS緩沖液，在-20℃冰箱中凍存20min，取出置于20℃水浴中溶解10min，如此重復(fù)5次。離心后所得的上清即為粗酶液［11］。

1.2.2.3 玻璃珠法破碎細(xì)胞 菌體經(jīng)洗滌后加入1mL PBS破碎緩沖液，放入適量酸洗玻璃珠，冰浴。高速漩渦振蕩30s，停30s，如此重復(fù)30min。離心后所得的上清即為粗酶液［11］。

1.2.3 葡萄糖苷酶活性測(cè)定 葡萄糖苷酶活性測(cè)定參照Barbagallo等所采用的方法［12］，并略作修改。準(zhǔn)確吸取0.5mL粗酶液，加入 0.5mL底物緩沖液(pH5.0)，于30℃恒溫水浴1h，反應(yīng)結(jié)束后立即加入2mL 1mol/L Na2CO3終止反應(yīng)，于400nm處測(cè)定吸光度。酶活定義:30℃時(shí)，每分鐘每克干菌重生成對(duì)硝基苯酚的量(μmol)為1個(gè)酶活單位，即酶活單位為μmol/(min·g)。

1.2.4 蛋白含量測(cè)定 采用紫外吸收法測(cè)定蛋白含量。配制不同濃度的牛血清蛋白，并分別測(cè)定其在280nm處的吸光值。以牛血清蛋白濃度x為橫坐標(biāo)，吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，其回歸方程為A=0.7092x-0.0086，R2=0.9996，為高度顯著。測(cè)定粗酶液在280nm處的吸光值，對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得到粗酶液蛋白濃度。

1.2.5 超聲波破碎條件確定 實(shí)驗(yàn)分為單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面優(yōu)化兩部分，單因素實(shí)驗(yàn)時(shí)，分別考察破碎時(shí)間(5、10、15、20、25、30、35min)、破碎功率(90、100、110、120、130W)、菌體濃度 (OD 值分別為1.202、1.387、1.608、1.792、2.044)對(duì)葡糖糖苷酶的影響。以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，按照Box-Behnken原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，利用Design-Expert軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，采用響應(yīng)面優(yōu)化最終確定超聲波破碎提取酶的最佳工藝條件。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)中的水平及編碼表見表1。

表1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲波破碎條件單因素研究

2.1.1 破碎時(shí)間對(duì)提取葡萄糖苷酶的影響 超聲波破碎時(shí)間對(duì)酶提取效果的影響如圖1所示。當(dāng)破碎功率為130W，菌體密度OD600為2.0時(shí)，可以看出隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，總蛋白和總酶活力都呈上升趨勢(shì)，但是比活力在10min以后增加得不明顯，甚至有降低的趨勢(shì)。酶的純度可由比活力表示，破碎時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞內(nèi)總蛋白釋放量增加，目的蛋白也有所增加，但是比活力并沒有因此提高。破碎時(shí)間延長(zhǎng)，導(dǎo)致破碎體系內(nèi)熱量增多，可能是由于目的蛋白對(duì)熱敏感，使其催化活性部位受到損害，使酶的比活力下降［13］。所以選擇的破碎時(shí)間范圍為10、15、20min。

圖1 超聲波破碎時(shí)間對(duì)酶提取的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on extraction of glucosidase

2.1.2 破碎功率對(duì)提取葡萄糖苷酶的影響 破碎功率對(duì)酶提取效果的影響如圖2所示。當(dāng)破碎時(shí)間為15min，菌體密度OD600為2.0時(shí)，可以看出隨著功率的增加，總蛋白和總酶活都有增加，說明破碎功率增大有助于細(xì)胞的破碎，但是比活力在120W的輸出功率時(shí)達(dá)到最大，在最大功率130W有降低的趨勢(shì)，原因可能是破碎功率上升導(dǎo)致熱量增大，破壞了酶活。所以破碎功率為110～130W。

圖2 超聲波功率對(duì)酶提取的影響Fig.2 Effect of ultrasonic power on extraction of glucosidase

2.1.3 菌體密度對(duì)提取葡萄糖苷酶的影響 將不同濃度的菌體在超聲波功率為130W的條件下處理15min，結(jié)果如圖3所示。從圖中可以看出，雖然酶的總活力一直在升高，但是酶的比活力在OD600值大于1.6后基本不變。菌體濃度會(huì)影響超聲波的空化作用，當(dāng)菌濃度高的時(shí)候，超聲波破碎難以形成空化效應(yīng)，而能量大多被轉(zhuǎn)化為熱量，不但不能破碎，反而破壞了樣品中的酶活性。所以選擇的菌體濃度OD600為 1.6、1.8、2.0。

圖3 菌體密度對(duì)酶提取的影響Fig.3 Effect of cell concentration on extraction of glucosidase

2.2 葡萄糖苷酶提取條件的優(yōu)化

以破碎時(shí)間、破碎功率、菌體濃度為響應(yīng)變量，根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)確定上下水平后，按Box-Behnken原理設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行優(yōu)化分析。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見表2。利用Design-Expert軟件對(duì)表2實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到葡萄糖苷酶活力對(duì)破碎時(shí)間、破碎功率和菌體濃度三個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型為:

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Test design and results of Box-Behnken

對(duì)該模型的數(shù)學(xué)回歸分析結(jié)果見表3。其中回歸模型的p值＜0.0001，表明回歸模型極顯著;一次項(xiàng)均極顯著，二次項(xiàng)均極顯著;交互項(xiàng)AB、BC不顯著，AC顯著，這表明各種影響因素對(duì)葡萄糖苷酶的活性的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。失擬項(xiàng)p值為0.1901，大于0.05，不顯著，相關(guān)系數(shù) R2=0.9964，說明模型擬合程度良好，可用此模型來分析和預(yù)測(cè)葡萄糖苷酶的最佳提取條件。通過對(duì)三個(gè)因素F值的比較，可以得出三個(gè)因素對(duì)酶活力的影響:C＞A＞B，即菌體濃度＞破碎總時(shí)間＞破碎功率。

表3 回歸方程方差分析表Table 3 Analysis results of regression and variance

2.3 實(shí)驗(yàn)因素對(duì)酶活力的影響

破碎時(shí)間和破碎功率的交互作用對(duì)酶提取效果影響如圖4所示，由圖中可以看出這兩個(gè)因素交互作用對(duì)酶活的影響不顯著(p=0.3149)，酶活力隨著時(shí)間的延長(zhǎng)呈現(xiàn)增大的趨勢(shì)，也隨破碎功率的增大呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，而且破碎時(shí)間的響應(yīng)面曲線更陡一些，說明時(shí)間對(duì)酶活的影響更顯著。

圖4 Y=(A，B)響應(yīng)面立體圖Fig.4 Y=(A，B)response surface stereogram

破碎功率和菌體濃度交互作用對(duì)酶提取效果的影響如圖5所示?？梢钥闯?，這兩個(gè)因素交互作用對(duì)酶活的影響不顯著(p=0.2965)，酶活力隨著這兩個(gè)因素的各自增大都呈現(xiàn)增大趨勢(shì)，與破碎功率相比，菌體密度的響應(yīng)曲面更陡，說明對(duì)酶提取的影響更顯著。

圖5 Y=(B，C)響應(yīng)面立體圖Fig.5 Y=(B，C)response surface stereogram

破碎時(shí)間和菌體濃度交互作用對(duì)酶提取效果的影響如圖6所示。這兩個(gè)因素交互作用對(duì)酶活的影響顯著(p=0.0392)，酶活力受到這兩個(gè)因素共同作用的影響。且菌體密度的響應(yīng)曲線更陡，說明菌濃度對(duì)酶提取的影響更顯著。

圖6 Y=(A，C)響應(yīng)面立體圖Fig.6 Y=(A，C)response surface stereogram

根據(jù)回歸方程繪出響應(yīng)面分析圖，用軟件分析后，得到最適的葡萄糖苷酶提取條件為:A=0.94，B=1，C=1，經(jīng)轉(zhuǎn)換后，得出三因素的值分別為:破碎總時(shí)間19.7min，破碎功率130W，菌體濃度為OD600=2.0。在此條件下，預(yù)測(cè)值最大酶活為14.45U?？紤]到實(shí)際可操作性，選擇破碎總時(shí)間為20min，破碎功率為130W，菌體濃度OD600=2.0，實(shí)際測(cè)得的酶活為13.89U，與預(yù)測(cè)值相近。

2.4 超聲波破碎法與其他破碎方法的比較

利用優(yōu)化的超聲波破碎條件進(jìn)行糖苷酶提取，并比較了該方法與反復(fù)凍融法和玻璃珠法對(duì)酶提取效果的不同，結(jié)果如圖7所示?？梢钥闯鲇脙?yōu)化的方法得到的酶活顯著高于其他兩種方法。

圖7 三種破碎方法對(duì)酶活的影響Fig.7 Enzyme activity of β-Glucosidase by three methods

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與其他破碎方法相比，超聲波可以很好地破碎酒類酒球菌31MBR細(xì)胞壁，從而釋放β-D-葡萄糖苷酶。超聲波有強(qiáng)烈的生物學(xué)效應(yīng)，進(jìn)行超聲波處理時(shí)，超聲波的高頻振動(dòng)與微生物的振動(dòng)不協(xié)調(diào)，造成細(xì)胞周圍環(huán)境局部真空，使細(xì)胞膜產(chǎn)生空化作用，從而使之破碎［14-15］。

破碎時(shí)間和破碎功率主要會(huì)影響體系中的熱量，時(shí)間越長(zhǎng)，功率越大產(chǎn)生的熱量越多，可能會(huì)因此導(dǎo)致酶失活。菌體濃度主要會(huì)影響到超聲波破碎的空化效應(yīng)，菌體太多，難以形成足夠的水泡使細(xì)胞破裂，所以也會(huì)影響蛋白的釋放量，不能空化則會(huì)產(chǎn)生大量的熱，導(dǎo)致酶失活［15-16］。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)地研究了超聲波對(duì)酒類酒球菌的破碎效率，并比較了三種方法對(duì)酶活的影響，為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供了理論和技術(shù)支持。

3 結(jié)論

本研究所得超聲波破碎法提取酒類酒球菌31MBR胞內(nèi)β-D-葡萄糖苷酶的最佳條件為:破碎總時(shí)間20min，破碎功率130W，菌體濃度為OD600=2.0。按此方法得到粗酶液的總酶活為13.89U，與預(yù)測(cè)值相近。用優(yōu)化的方法得到的酶活顯著高于用反復(fù)凍融法和玻璃珠法得到的酶活。

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