劉 坤，李登超，陳 輝

(淮陰師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，江蘇淮安223300)

長(zhǎng)魚(yú)，又名黃鱔，是一種重要的特種水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，其肉味鮮美，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是滋補(bǔ)佳品。長(zhǎng)魚(yú)作為一種水產(chǎn)品，資源相當(dāng)豐富，尤其在我國(guó)的中部及南方，但長(zhǎng)魚(yú)食用的下腳料常被丟棄，不僅造成資源浪費(fèi)，而且造成污染環(huán)境。蛋白酶是一類重要的水解酶類，主要催化蛋白質(zhì)水解為多肽或氨基酸。蛋白酶作為一種生物催化劑在食品、醫(yī)藥、化工和皮革制造等多方面有廣泛應(yīng)用，如洗滌劑、制革、毛皮、明膠以及紡織、醫(yī)藥品、化學(xué)品等的生產(chǎn)［1］。近年來(lái)，蛋白酶在啤酒、果酒等的澄清方面也顯示出良好的應(yīng)用前景［2］。該酶來(lái)源有限，急需開(kāi)發(fā)新的蛋白酶源。以長(zhǎng)魚(yú)下腳料為研究對(duì)象，研究開(kāi)發(fā)新的蛋白酶，來(lái)源豐富，價(jià)格低廉，前景廣闊。近年來(lái)對(duì)長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶類的研究開(kāi)發(fā)逐漸引起許多學(xué)者關(guān)注，如江信紅等人，對(duì)長(zhǎng)魚(yú)腸道蛋白酶進(jìn)行了分離純化，得到了蛋白酶純品并對(duì)該酶的性質(zhì)進(jìn)行了初步研究，結(jié)果表明長(zhǎng)魚(yú)腸道蛋白酶屬于絲氨酸蛋白酶類，且屬于金屬酶，等電點(diǎn)為 6．2，分子量約為 26ku［3-4］。目前提取蛋白酶的方法很多，包括鹽析法，酸浸提法，等電點(diǎn)沉淀法和有機(jī)溶劑沉淀法等;這些方法往往存在生產(chǎn)周期長(zhǎng)，工藝參數(shù)不確定，容易導(dǎo)致酶失活等一系列問(wèn)題。雙水相萃取技術(shù)，是近年來(lái)興起的一種新型的萃取技術(shù)，和一般的分離技術(shù)相比，雙水相萃取具有分離條件溫和、耗能耗時(shí)低、安全環(huán)保，而且易連續(xù)化批量操作生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)［5-6］。雙水相萃取技術(shù)同時(shí)保護(hù)酶的活性，很適合萃取分離有生物活性的大分子物質(zhì)［7］。本項(xiàng)目以長(zhǎng)魚(yú)下腳料中的腸道為研究對(duì)象，采用雙水相萃取技術(shù)，通過(guò)研究不同PEG分子量、不同的鹽種類、鹽濃度、不同pH等因素對(duì)長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶萃取效率的影響，確定最佳的萃取工藝條件，為綜合利用開(kāi)發(fā)長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶提供重要的理論依據(jù)，同時(shí)變廢為寶，保護(hù)環(huán)境。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

長(zhǎng)魚(yú)下腳料 購(gòu)于淮安市淮陰區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng);PEG1000進(jìn)口分裝 廣東光華化學(xué)廠有限公司;硫酸銨、硫酸鎂 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;考馬斯亮藍(lán)-G250美國(guó)Amresco進(jìn)口分裝 南京匯百侍生物科技有限公司;其余試劑均為市售分析純或生化試劑。

BS224S、TE612-L電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司;自動(dòng)可調(diào)移液器 Eppendorf;TDL-60B離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器;5810R臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Beckman Culter;PHS-3D pH計(jì) 上海三信儀表廠;WH-3微型漩渦混合儀 上海滬西分析儀器廠有限公司;HH-S恒溫水浴鍋 金壇市億通電子有限公司;UV757CRT紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 雙水相體系建立 把(NH4)2SO4和 PEG400、PEG1000、PEG2000分別配制成四種適當(dāng)已知高濃度的母液。用移液器準(zhǔn)確吸取適當(dāng)量的(NH4)2SO4加入50mL離心管中，再滴加適當(dāng)?shù)腜EG溶液，混合，靜置，直至開(kāi)始出現(xiàn)渾濁為止，記錄加入PEG的量和此時(shí)總體積;然后滴加適當(dāng)量的H2O，直到恰好體系澄清為止，記下H2O的量，再滴加適當(dāng)量的PEG，直至體系再次出現(xiàn)渾濁，重復(fù)以上操作。得到數(shù)據(jù)后計(jì)算每步的(NH4)2SO4和PEG的百分含量，以PEG的百分含量為縱坐標(biāo)，(NH4)2SO4的百分含量為橫坐標(biāo)繪制相圖;根據(jù)相圖選擇最理想的萃取配比數(shù)據(jù)。

1．2．2 長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶粗提取物的制備 在長(zhǎng)魚(yú)下腳料中挑取腸道，用清水沖洗干凈。然后與預(yù)冷50mmol/L Tris-HCl(pH7．5)按照 1∶2 的配比混合，用高速組織搗碎機(jī)，將其制成組織勻漿;均勻分裝到離心管中，進(jìn)行4℃，8000r/min離心30min，棄沉淀，留上清液;加入總體積(上清液體積+正丁醇體積)的25%的預(yù)冷正丁醇，邊緩慢滴加邊攪拌，充分混勻后4℃下低溫萃取4h;用分液漏斗分液得上層丁醇酯相和下層長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶水相。最后將長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶水相分裝到離心管中進(jìn)行離心(4℃，4000r/min，30min)，再除去離心管內(nèi)長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶水相中沉淀物和上層少量丁醇相油脂，得到下層水相長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶粗提物。-20℃分批冷凍保藏水相長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶粗提物，待用。

1．2．3 酶活力測(cè)定和蛋白質(zhì)濃度測(cè)定

1．2．3．1 各種條件下的酶活均采用紫外分光光度法［8］具體步驟為:取 50mmol/L Tris-HCl、2%酪蛋白、稀釋適當(dāng)倍數(shù)的酶液、10%TCA(三氯乙酸)37℃下水浴5min，按以上順序分別加入前三種物質(zhì)1mL，繼續(xù)置于37℃水浴5min后加入TCA溶液1mL終止反應(yīng)。空白組加入1mL Tris-HCl緩沖液。3000r/min離心15min，用紫外分光光度計(jì)測(cè)多組A280值(裝入離心上清液后，靜置1min)，求平均值。定義1min內(nèi)水解酪蛋白釋放出的可溶于三氯乙酸的物質(zhì)讓A280值變化0．001個(gè)吸光度值為一個(gè)酶活單位(U)。

式中:EA0(U/mL)樣液中長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶活力;A樣液平均A280;A0空白組平均A280;EA(U)樣液中長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶總活力;V(mL)樣液體積;SA(U/mg)樣液中長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶比活力;M(mg)樣液總蛋白;n稀釋倍數(shù);5表示5min。

1．2．3．2 各種條件下的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 均采用考馬斯亮藍(lán)G-250法［9］稱取適量牛血清白蛋白，配制成1mg/mL的BSA溶液。考馬斯亮藍(lán)G-250溶液:精確稱取50mg的考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于25mL 95%的CH3CH2OH中，然后加入85%的磷酸50mL，加純水定容至500mL，邊加邊攪拌，4℃靜置一夜，減壓抽濾除雜質(zhì)，最后4℃保存?zhèn)溆谩?mL的待測(cè)液體和3mL的考馬斯亮藍(lán)G-250均勻混合，在595nm波長(zhǎng)處5～40min內(nèi)測(cè)定各組A595值，求平均值A(chǔ)。

式中:Y為A595值;X為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)含量，μg/mL。

1．2．4 雙水相萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶 根據(jù)相圖和各個(gè)物質(zhì)物理性質(zhì)選擇合適配比，準(zhǔn)確稱取PEG于帶刻度的試管中，加入已計(jì)算得到的母液體積(NH4)2SO4于試管中，然后加水定容至10mL，制成穩(wěn)定的雙水相體系。6℃左右環(huán)境下，向體系中加入適量長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶提取液，充分振蕩，混合均勻，靜置。于37℃水浴反應(yīng)后，2h內(nèi)完成酶活力和蛋白質(zhì)含量測(cè)定，并計(jì)算相比(VR)、酶比活力(SA)、純化倍數(shù)(PF)、酶活回收率(η，%)。

2 結(jié)果與討論

2.1 PEG/(NH4)2SO4成相關(guān)系圖

圖1顯示，隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸增大，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)逐漸減小;擬合曲線稱為雙節(jié)線，雙節(jié)線以上的區(qū)域?yàn)閮上鄥^(qū)，以下的區(qū)域?yàn)榫鄥^(qū)。在雙節(jié)線的上方易形成雙水相，靠近臨界點(diǎn)的系統(tǒng)形成兩相較難，遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)以上的區(qū)域比較容易，但是高聚物使雙水相體系粘度增大，兩相分離時(shí)間延長(zhǎng)，PEG和(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)適中，使相分離時(shí)間盡可能短，為工業(yè)生產(chǎn)節(jié)約時(shí)間。制備相圖時(shí)發(fā)現(xiàn)在PEG/(NH4)2SO4體系中，盡管在雙節(jié)線上方可以形成兩相，但是其成相過(guò)程只在一個(gè)較小的范圍內(nèi)才比較穩(wěn)定。(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)15%～22%，PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%～30%的雙水相體系兩相間有穩(wěn)定的電位差，適合建立萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶的雙水相體系［10］。故選擇20%(NH4)2SO4和25%不同分子量PEG建立萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶的雙水相體系，進(jìn)而通過(guò)數(shù)據(jù)比對(duì)篩選出合適分子量PEG。

圖1 不同分子量的PEG和(NH4)2SO4體系相圖Fig．1 The phase diagrams of PEG/(NH4)2SO4aqueous two phase extraction

表1 長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶的粗分離純化結(jié)果Tabel 1 The results of crude separation and purification protease from Monopterus albus

2.2 長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶二次分離純化

長(zhǎng)魚(yú)下腳料經(jīng)離心除沉淀物和正丁醇抽提除酯后，對(duì)兩次分離純化得到的蛋白酶液分別測(cè)總蛋白含量、總體積、總活力、比活力、酶活回收率和純化倍數(shù)，計(jì)算得表1。由表1可知，正丁醇抽提液(輕相)除去約10．2%的脂蛋白，長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶總活力回收率3．6%，幾乎沒(méi)有酶活回收率;二次酶液(重相)中總活力高達(dá)30381U，酶活回收率93．1%，故長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶主要富集在重相，為后期雙水相分離純化長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

2.3 不同分子量PEG對(duì)萃取效率的影響

根據(jù)相圖規(guī)律及PEG400、PEG1000、PEG2000的物理性質(zhì)，選擇質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的PEG和20%的(NH4)2SO4建立雙水相體系。并用這些體系萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶，然后測(cè)出相比(VR)，酶比活力(SA)，純化倍數(shù)(PF)，酶活回收率(η，%)。表2數(shù)據(jù)顯示，隨著PEG分子量的增加，相比逐漸減小，說(shuō)明分子內(nèi)親水性減弱，疏水性增強(qiáng)。PEG1000和(NH4)2SO4建立的雙水相上相酶比活力和酶活回收率最佳，分別為921．5U/mg和 89．9%，故選擇 PEG1000 適合萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶。

表2 不同PEG分子量萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶的影響Tabel 2 Effect of PEG molecular on extraction of protease from Monopterus albus

2.4 無(wú)機(jī)鹽種類及其濃度對(duì)萃取效率的影響

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%的PEG1000和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的無(wú)機(jī)鹽建立雙水相體系。表3數(shù)據(jù)顯示，隨著鹽濃度的增加，相比在減小。主要是由于鹽析作用，使得水有從上相轉(zhuǎn)移下相的趨勢(shì)。PEG1000/MgSO4體系上相酶活回收率相對(duì)20%(NH4)2SO4較低，且MgSO4的溶解度沒(méi)有(NH4)2SO4的溶解度大(6℃左右)，低溫成相易有結(jié)晶析出，相比不穩(wěn)定。25%的PEG1000和20%(NH4)2SO4建立的雙水相上相酶比活力和酶活回收率最佳;故選擇20%(NH4)2SO4萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶較佳。

2.5 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG1000對(duì)萃取效率的影響

用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的(NH4)2SO4和不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG1000建立雙水相體系。表4數(shù)據(jù)顯示，隨著PEG1000質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，相比逐漸增大、純化倍數(shù)和酶活回收率先增大后減小。PEG1000濃度增大，分子內(nèi)親水性增強(qiáng)，疏水性減弱，分子表面張力減弱，長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶趨于向上相分配，所以相比增大。另一方面，PEG1000濃度增大，體系粘度增大，分子間阻力增大，阻礙蛋白酶向上相分配，所以純化倍數(shù)和酶活回收率先增大后減小。20%(NH4)2SO4和25%PEG1000建立的雙水相上相酶比活力和酶活回收率最佳，故選擇25%PEG1000比較適合萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶。

表3 無(wú)機(jī)鹽種類及其濃度萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶的影響Tabel 3 Effect of different kinds of inorganic salts and their concentrations on extraction of protease from Monopterus albus

表4 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PEG1000萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶的影響Tabel 4 Effect of PEG1000 concentrations on extraction of protease from Monopterus albus

2.6 不同pH對(duì)萃取效率的影響

綜合上述所得結(jié)果，選用25%PEG1000和20%(NH4)2SO4建立的雙水相體系萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶，并改變體系的pH。表5數(shù)據(jù)顯示，隨著pH的增大，相比、純化倍數(shù)和酶活回收率先增大后減小。體系pH的變化會(huì)改變蛋白酶表面的電荷數(shù)，因而改變分配系 數(shù)。pH 為 7．0 的 25% PEG1000 和 20%(NH4)2SO4建立的雙水相體系上相純化倍數(shù)為4．40和酶活回收率為90．5%，故選擇體系pH7．0時(shí)比較適合萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶。

表5 不同pH對(duì)萃取長(zhǎng)魚(yú)蛋白酶的影響Tabel 5 Effect of pH on extraction of protease from Monopterus albus

3 結(jié)論

通過(guò)考察影響PEG/鹽雙水相系統(tǒng)分離純化長(zhǎng)魚(yú)腸道蛋白酶的因素，確定了適宜的雙水相體系為25%PEG1000、20%(NH4)2SO4和 pH7．0。長(zhǎng)魚(yú)腸道蛋白酶主要富集在上相中，在最佳的雙水相體系中，酶活回收率90．5%，上相純化倍數(shù)為4．40。

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