張喬會，逄錦慧，楊 喆，董施彬，寧亞萍，王建中，*

(1．北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室，北京100083;2．北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林木生物質(zhì)化學(xué)北京市重點實驗室，北京100083)

杜香(Ledum palustre L．)為杜鵑花科杜香屬的常綠灌木［1］，是我國東北、內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)的主要森林組成樹種，其分布面積約占大興安嶺林地面積的70%［2］。大興安嶺杜香干葉年生產(chǎn)量達(dá) 536925t·a-1［3］，小興安嶺杜香的蘊(yùn)藏量可達(dá) 8776．7t·hm-2·a-1，其中允收量以鮮重計為 1843．2t·hm-2·a-1［3］。杜香枝葉含有多種揮發(fā)性成分、熊果酸、多糖等成分［4-7］。

熊果酸具有抗炎［8］、鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保肝［9-10］、抗癌、抗腫瘤［11-16］、美白、抗菌等藥理作用。能溶于醇，不溶于水、石油醚等，其提取采用乙醇熱提法、甲醇滲漉法、超臨界提取、回流提取法，并輔助超聲波、微波提取等。醇提一般輔以一定的溫度，雜質(zhì)較多;超聲波產(chǎn)生的振動作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解;微波輔助提取是利用微波能來提高萃取率的新發(fā)展起來的技術(shù);閃式提取是在高剪切力的作用下破壞物料的物理結(jié)構(gòu)從而溶出其中物質(zhì)。各種方法各有優(yōu)點也各有不足，同時閃式提取杜香熊果酸鮮有報道，杜香資源大，開發(fā)利用杜香熊果酸價值高，研究不同方法提取杜香熊果酸對其利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜香 由內(nèi)蒙古金河林業(yè)局2013年7月中旬采集提供，由北京林業(yè)大學(xué)植物專家堅定為杜香;無水乙醇(AR)、石油醚(AR)、香草醛(AR)、冰醋酸(AR)、高氯酸(AR)、去離子水、活性碳、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC≥98%，中國食品藥品檢定研究所。

HHS4型恒溫水浴鍋 上海浦東躍新科學(xué)儀器廠;KQ-500E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;QI-901渦旋混合器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司;臺式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠;RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠;METTLER TOLEDO電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;冷凍干燥機(jī)FD-1 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;JHBE-50S閃式提取控制器 鄭州金星科技有限公司;T6紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Tensor27型FT-IR紅外光譜儀 德國Bruker公司;S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;E-1010濺射鍍膜機(jī) 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1．2．1 試樣的制備 將杜香枝葉切分成2～3cm的小段后于40℃烘箱中烘干，然后用BL-05粉碎機(jī)粉碎，80目過篩，將過篩后的粉末按1∶5加入石油醚脫脂脫色12h，過濾除去石油醚并將粉末放入40℃烘箱中烘干，然后存于室內(nèi)陰涼干燥處備用。

1．2．2 杜香中熊果酸的提取工藝 采用90%的乙醇液提取，回收溶劑并用石油醚和水除雜，用活性碳脫色，并置于冷凍干機(jī)中干燥。

1．2．3 杜香熊果酸的定性檢測 準(zhǔn)確稱取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg及提取樣品置容量瓶中，用無水乙醇溶解并定容到100mL，以乙醇作為對照液。利用紫外光譜對杜香醇提熊果酸及熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外可見光譜掃描，掃描范圍為200～800nm，掃描速度快，掃描次數(shù)為3。利用Tensor27型FT-IR紅外光譜儀對杜香醇提熊果酸及熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紅外測定，紅外測定范圍為400～4000cm-1，分辨率為2cm-1。并對標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的光譜結(jié)果進(jìn)行比對鑒定。

1．2．4 熊果酸粗提物得率計算 按以下公式計算提取得率:

式中:P-熊果酸粗提物提取得率;m-提取得到的杜香熊果酸的干重;W-杜香粉末的重量。

1．2．5 粗提物中熊果酸含量的測定 樣品中含量的測定采用分光光度法，參考溫媛媛方法進(jìn)行測定［17］。

1．2．5．1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取105℃干燥至恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用無水乙醇定容至100mL的容量瓶中，即得0．1mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0．5、0．6、0．7、0．8、0．9、1．0mL 置試管中，加熱揮去溶劑，加 5% 香草醛- 冰醋酸 0．2mL，高氯酸 0．8mL，60℃ 水浴加熱15min，取出冷卻后移至10mL容量瓶中，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻后在548nm處測定吸光度，同時以試劑空白作為參比。

1．2．5．2 樣品中熊果酸含量的測定 準(zhǔn)確稱取不同方法提取所得樣品10mg，用無水乙醇定容至100mL的容量瓶中，即得0．1mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取0．8mL置試管中，加熱揮去溶劑，加5%香草醛-冰醋酸 0．2mL，高氯酸 0．8mL，60℃ 水浴加熱 15min，取出冷卻后移至10mL容量瓶中，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻后以試劑空白作為參比在548nm處測定吸光度，并計算出熊果酸含量。

1．2．6 杜香中熊果酸提取工藝的實驗設(shè)計 設(shè)計不同的提取方法，具體為超聲波提取30min、室溫浸提24h、閃式提取1min、閃式提取2min、閃式提取3min、閃式提取4min，考察不同方法對杜香中熊果酸提取得率的影響。

1．2．6．1 超聲波提取 設(shè)定料液比 1∶20，提取溫度為室溫，提取時間30min，物料粒度分別為80目，用超聲波輔助提取，超聲波功率為440W。

1．2．6．2 室溫浸提 設(shè)定料液比 1∶20，提取溫度為室溫，提取時間24h，物料粒度分別為80目，輔以輕微的震蕩。

1．2．6．3 閃式提取 設(shè)定料液比 1∶20，提取溫度為室溫，物料粒度分別為80目，提取時間分別為1、2、3、4min，使用閃式提取器進(jìn)行輔助提取。

1．2．7 提取后料渣的電鏡掃描 在掃描電子顯微鏡(SEM)設(shè)備下觀察提取后的料渣的表面形態(tài)，掃描電鏡采用10千伏的加速電壓，檢測前，使用濺射鍍膜機(jī)對材料表面進(jìn)行噴金。

1．2．8 數(shù)據(jù)處理 實驗數(shù)據(jù)均采用 Microsoft excel 2007進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜香熊果酸的紫外及紅外檢測結(jié)果

從熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品及杜香熊果酸提取樣品的紫外波長掃描譜圖來看，兩者都在204nm處有最大吸收峰，且整個紫外-可見波長范圍內(nèi)只有204nm處的一個峰，符合熊果酸的紫外特征吸收，證明提取物中含有熊果酸。

圖1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外掃描譜圖Fig．1 UV scanning spectrum of Ursolic Acid standard

圖2 熊果酸樣品的紫外掃描譜圖Fig．2 UV scanning spectrum of Ursolic Acid sample

從圖 3可以看出，熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在 3526．78、2959．40、1717．94、1454．61、1385．57、1244．77cm-1等處都有明顯有吸收峰，為熊果酸中-OH、-C=O、-C-H、-CH3等基團(tuán)的振動。從圖4可以看出，從杜香中提取的熊果酸樣品的紅外譜圖在 3522．78、2951．39、1721．86、1446．43、1385．34、1244．36cm-1等處也均有峰，與熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰基本一致，說明提取物中含有熊果酸。

圖3 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖Fig．3 IR spectrum of Ursolic Acid standard

圖4 熊果酸樣品的紅外光譜圖Fig．4 IR spectrum of Ursolic Acid sample

2.2 不同方法提取杜香中熊果酸實驗結(jié)果

2．2．1 提取得率 從圖5可以看出，3min內(nèi)，隨著閃式提取時間的增加，提取得率增大，之后隨時間的增加提取得率不再變化。超聲波輔助提取的得率高于室溫浸提24h，但低于閃式提取2min以上的提取得率。總體來說，閃式提取得率(提取2min以上)＞超聲波輔助提取30min＞室溫浸提24h。

圖5 不同提取方法的提取得率Fig．5 Extraction rate of different extraction technologies

2．2．2 提取過程中溫度的變化 從表1可以看出，超聲波輔助提和閃式提取器輔助提取都會明顯導(dǎo)致提取溫度的變化，且在1～3min內(nèi)，隨著閃式提取時間增加，溫度呈線性上升。超聲波在傳播過程中，聲能可以不斷被介質(zhì)所吸收，吸收的能量幾乎全部轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，從而?dǎo)致介質(zhì)本身和待萃取成分溫度升高，增大了有效成分的溶解度這種吸收聲能引起植物組織內(nèi)部溫度的升高是瞬時的，因此可使被提取成分的生物活性保持不變;而閃式提取產(chǎn)生的溫度變化可能是由于閃式提取刀頭的高速轉(zhuǎn)動和物料的摩擦產(chǎn)生機(jī)械摩擦，從而將機(jī)械能轉(zhuǎn)化為熱能，所以隨著閃式提取時間的增加，溫度也隨著增加，但當(dāng)溫度達(dá)到一定水平后，由于產(chǎn)生的熱量和周圍空氣產(chǎn)生熱交換，使提取溫度不再上升。

表1 不同方法提取后物料的溫度變化Table 1 Change of the material’s temperture after extract by different methods

2．2．3 提取粗產(chǎn)物的比較結(jié)果 從表2可以看出，超聲波輔助提取及室溫提取的粗產(chǎn)物顏色明顯要淺，且呈粉末狀態(tài);用閃式提取器輔助提取的粗產(chǎn)物顏色深，呈膠黏狀。因而可以推斷出用閃式提取器輔助提取可能因為提取液含有15%的水，且閃式提取刀頭摩擦產(chǎn)熱導(dǎo)致局部溫度快速升高，從而導(dǎo)致杜香粉末中的多糖及其他組分溶出，使得粗產(chǎn)物黏性增加、顏色加深。超聲波輔助提取的粗產(chǎn)物由于受超聲的影響，也溶出一些其他組分，但瞬時升溫對多糖的溶出影響不大。

表2 不同提取方法粗提物的顏色及狀態(tài)Table 2 Color and form of the impure extracting by different extraction technologies

2．2．4 不同方法得到樣品中熊果酸含量測定結(jié)果 從圖6可知，熊果酸濃度在5～10μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，回歸方程為 y=0．0732x-0．1264，相關(guān)系數(shù) R2=0．9991。

圖6 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig．6 The standard curve of ursolic acid

從表3可以看出，不同方法提取得到的熊果酸樣品中熊果酸的含量略有差異，但差異不大。其中含量最高的是用超聲波輔助提取得到的樣品，其次是室溫提取得到的樣品。閃式提取得到的樣品中熊果酸的含量隨著閃式提取時間的增加而逐漸降低，這與閃式提取得到的樣品顏色較深、雜質(zhì)較多相匹配。但含量降低的程度很小，可能是增加的熊果酸的提取率，但也增加雜質(zhì)的提取率，使得樣品中熊果酸的含量有一定的降低。

表3 不同提取方法粗提物的中熊果酸含量Table 3 The content of ursolic acid by different extraction technologies

2.3 提取后杜香粉末的掃描電鏡結(jié)果

圖7 原料的掃描電鏡圖(500×)Fig．7 Scanning picture of original medicinal meterials by SEM(500×)

2．3．1 500倍放大結(jié)果 從圖7～圖13可以看出，放大500倍時，24h浸泡、超聲波提取30min與未處理的幾個樣品沒有明顯的區(qū)別。但閃式提取后的樣品就能看出明顯的差別，與前幾個樣品比較，經(jīng)過閃式提取后的樣品顆粒度明顯比其他處理的要細(xì)，且隨著閃式提取時間的加長，顆粒度變細(xì)的程度也逐漸增大。

圖8 室溫提取24h料渣的掃描電鏡圖(500×)Fig．8 Scanning picture of extraction in room temperature for 24 h by SEM(500×)

圖9 超聲波輔助提取30min的掃描電鏡圖(500×)Fig．9 Scanning picture of extraction for 30 minutes by ultrasonic assisted by SEM(500×)

圖10 閃式提取1min的掃描電鏡圖(500×)Fig．10 Scanning picture of flash extraction for 1 minutes by SEM(500×)

2．3．2 3000倍放大結(jié)果 從圖14～圖20可以看出，沒有經(jīng)過處理的粉末表面比較光滑，沒有碎裂，也沒有過多的孔洞。而室溫浸泡24h的粉末及閃式提取1min的物料表面出現(xiàn)了很多的孔洞，可能是由于粉末中的物質(zhì)溶解后留下的空隙;電鏡圖片顯示杜香原料表面可見很多粒狀附著物，可能是淀粉、蔗糖等。超聲波處理的粉末放大后可明顯看到結(jié)構(gòu)受到破壞，其中很大部分都碎裂并分離。而經(jīng)過閃式提取處理的樣品則主要表現(xiàn)在表面結(jié)構(gòu)被機(jī)械破碎，粉末的表面一層受到了很大的機(jī)械破壞，且隨著閃式時間的加長，破碎的程度加大。

圖11 閃式提取2 min的掃描電鏡圖(500×)Fig．11 Scanning picture of flash extractionfor 2 minutes by SEM(500×)

2.4 電鏡與提取得率綜合分析結(jié)果

結(jié)合提取后物料的電鏡掃描照片及不同方法提取的得率進(jìn)行分析，可以看出，就提取熊果酸得率而言，幾種方法中最優(yōu)的是閃式提取，其次是微波輔助提取，最后是室溫提取24h，而閃式提取的時間設(shè)3min即可。但從粗提物的顏色及狀態(tài)來判斷，閃式提取的雜質(zhì)最多，室溫長時間提取次之，超聲波輔助提取雜質(zhì)最少。可能是因為閃式提取除擠壓和剪切作用外，還產(chǎn)生許多次級效應(yīng)，如渦旋擴(kuò)散、粉碎、化學(xué)效應(yīng)等也都有利于使植物中有效成分向溶劑轉(zhuǎn)移，并充分和溶劑混合，促進(jìn)提取的進(jìn)行;閃提時間在3min內(nèi)對提取呈正相關(guān)，但超過3min后，由于物料已經(jīng)被擠壓破碎得很細(xì)，加上升高溫度及二級作用使得物質(zhì)已經(jīng)全部溶解到溶劑中而使提取得率不再上升。室溫長時間提取可能是因為物質(zhì)在溶劑中經(jīng)過長時間的擴(kuò)散，逐步轉(zhuǎn)移到溶劑中;而超聲法，空化產(chǎn)生的極大壓力造成被破碎物細(xì)胞壁及整個生物體破裂，而且整個破裂過程在瞬間完成。同時超聲波產(chǎn)生的振動作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解，加速植物中的有效成分進(jìn)入溶劑［18］。

圖14 原料的掃描電鏡圖(3000×)Fig．14 Scanning picture of original medicinal meterials by SEM(3000×)

圖15 室溫提取24h的掃描電鏡圖(3000×)Fig．15 Scanning picture of extractionin room temperature for 24 h by SEM(3000×)

圖16 超聲波提取30 min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．16 Scanning picture of extraction for 30 minutes by ultrasonic assisted by SEM(3000×)

圖17 閃式提取1min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．17 Scanning picture of flash extraction for 1minutes by SEM(3000×)

圖18 閃式提取2 min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．18 Scanning picture of flash extraction for 2 minutes by SEM(3000×)

圖19 閃式提取3 min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．19 Scanning picture of flash extraction for 3 minutes by SEM(3000×)

圖20 閃式提取4 min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．20 Scanning picture of flash extraction for 4 minutes by SEM(3000×)

3 結(jié)論

綜合以上分析可知，閃式提取及超聲波輔助提取都對物料造成較大的機(jī)械破壞使得提取得率增加，閃式提取法以機(jī)械擠壓摩擦造成機(jī)械破碎，而超聲波以機(jī)械空化及振動使物料造成機(jī)械破碎。物料機(jī)械破碎的程度越大，提取得率越高，同時雜質(zhì)越多。為追求熊果酸最大提取得率，較優(yōu)方法為閃式提取3min，提取得率為1．18%，但閃式提取雜質(zhì)較多，超聲波輔助提取雜質(zhì)相對較少，如考慮簡化純化步驟，較優(yōu)方法為超聲波輔助提取，提取得率為0．83%。結(jié)合資源、能源及提取得率等分析，較優(yōu)提取方法為閃式提取3min。當(dāng)然，具體提取參數(shù)還有待進(jìn)一步研究分析。

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