師云才，蔣曙光，周建平，袁 靜，周湘穎

(1.中國藥科大學(xué)，江蘇 南京 211198;2.University of Liverpool，UK)

厄貝沙坦是一種血管緊張素Ⅱ受體的拮抗劑，主要用于治療輕中度的高血壓，其不良反應(yīng)較少、耐受性較高，療效好。厄貝沙坦不僅能有效的降低血壓［1－3］，還有保護(hù)患者器官、防止器官損傷的作用［4－7］。本研究參考有關(guān)文獻(xiàn)［8－11］，應(yīng)用大鼠在體腸灌流模型考察厄貝沙坦在大鼠各腸段的吸收情況，及濃度和溶液pH值對(duì)藥物吸收的影響，為進(jìn)一步研究其藥代動(dòng)力學(xué)、藥效學(xué)及厄貝沙坦相關(guān)制劑的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與儀器

1.1 藥品與試劑 Krebs-Ringer緩沖液(自行配制，1 000 mL 內(nèi)含有 NaCl 7.80 g、KCl 0.35 g、CaCl20.37 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO4·2H2O 0.416 g、MgCl2·6H2O 42.7 mg、葡萄糖 1.40 g)，烏拉坦(20%)，樂氏生理鹽水(自行配制，1 000 mL中有NaCl 9.0 g，NaHCO30.2 g，KCl 0.42 g，CaCl20.24 g)，酚紅，厄貝沙坦原料藥，甲醇，乙腈，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器 依利特P1201型高效液相色譜儀(依利特 P1201二元泵，UV1201紫外-可見檢測器，EC2006色譜數(shù)據(jù)處理工作站)，HL-2恒流泵(上海滬西分析儀器廠有限公司)，752型紫外可見分光光度計(jì)(上海舜宇恒平)，恒溫水浴鍋HH-2(上海特成機(jī)械設(shè)備有限公司)，雷磁PHS-25數(shù)顯型 pH計(jì)(上海精科)，ACCULAB型電子天平(北京賽多利斯)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性 SD大鼠，(250±20)g，江蘇大學(xué)scxk(蘇)2013－0011。

2 實(shí)驗(yàn)方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備 含酚紅的Krebs-Ringer液:精密稱量 CaCl20.37 g，葡萄糖 1.4 g，加少量蒸餾水使其完全溶解，再精密稱取 NaCl 7.8 g、KCl 0.35 g、NaHCO31.37 g、NaH2PO4·2H2O 0.416 g、MgCl2·6H2O 0.0427 g，加蒸餾水使其完全溶解，加酚紅20 mg溶解，稀釋后與上述溶液混合并定容至1 000 mL。

藥物灌流液:分別精密稱取50、100、150 mg厄貝沙坦原料藥，含酚紅的Krebs-Ringer液溶解并稀釋至 1 000 mL，即得 50、100、150 mg·L－1的藥物灌流液。

空白腸灌流液:取含酚紅的Krebs-Ringer液，按照“2.2”節(jié)大鼠在體腸灌流實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得空白腸灌流液。

2.2 大鼠在體腸灌流實(shí)驗(yàn)方法 取體重為(250±20)g的大鼠，禁食12 h，不禁水。腹腔注射20%烏拉坦進(jìn)行麻醉(1 g·kg－1)，將大鼠固定在手術(shù)臺(tái)上，紅外燈保溫。手術(shù)剪沿腹中白線打開腹腔，依次小心的分離出十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸。十二指腸為幽門下約2 cm處開始向下數(shù)約10 cm;空腸為幽門下約15 cm處，向下數(shù)約10 cm;回腸為盲腸上約2 cm處向上數(shù)約10 cm;結(jié)腸為盲腸后端緊鄰盲腸開始向下量取，盡可能多取。分別于腸段兩端切口插管，小心縫合結(jié)扎，用37°C樂氏生理鹽水沖洗，排出腸段內(nèi)容物，然后泵入空氣排去生理鹽水。取37°C的供試藥液先以1.0 mL·min－1的流速灌流，使藥液充滿腸段，保持10 min。再以0.2 mL·min－1的速度灌流，平衡30 min后開始接受灌流液，以15 min作為一個(gè)時(shí)間段，共收集4個(gè)時(shí)間段的灌流液。實(shí)驗(yàn)過程中用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋傷口處，并不時(shí)滴加生理鹽水保濕。移液管精密移取0.5 mL接受液，檢測酚紅濃度，剩余的接受液用0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，進(jìn)樣檢測藥物濃度。

2.3 厄貝沙坦的含量測定

2.3.1 色譜條件 色譜柱:Hedera ODS-2色譜柱(5 μm，4.6 mm ×150 mm)，流動(dòng)相:pH 3.2 磷酸鹽緩沖液—乙腈(55∶45)，流速 1.0 mL·min－1，進(jìn)樣量25 μL，檢測波長245 nm，柱溫30℃。

2.3.2 方法專屬性考察 分別取空白腸灌流液、厄貝沙坦標(biāo)準(zhǔn)溶液，含藥灌流液分別進(jìn)樣測定，考察方法專屬性。色譜圖見圖1，由圖1可知，空白灌流液對(duì)藥物的測定沒有干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.3 藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密配制濃度分別為 20、40、60、80、100、120、140 mg·L－1的厄貝沙坦K-R溶液，0.45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣25 μL，得峰面積。以藥物濃度C對(duì)峰面積A進(jìn)行線性回歸，得藥物標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=38.324X －124.86，R2=0.998(n=7)，線性范圍為 20 ～140 mg·L－1，最低定量 10 mg·L－1。

分別精確配制 40、80、120 mg·L－1的藥物 K-R溶液，考察標(biāo)曲回收率及精密度(n=5)。結(jié)果回收率均在98.5%到101%之間，日內(nèi)RSD和日間RSD均在4%以內(nèi)，說明本方法回收率較高，精密度較好。

2.3.4 藥物在K-R溶液及空白腸灌流液中的穩(wěn)定性 分別用K-R液和空白腸灌流液配制50、100、150 mg·L－1的厄貝沙坦原料藥溶液，37℃水浴中放置，分別于0、2、4 h取樣，檢測藥物含量。結(jié)果3個(gè)藥物濃度的溶液在各時(shí)間點(diǎn)測得的峰面積基本相同，RSD均在3%以內(nèi)，表明厄貝沙坦在K-R液及空白腸灌流液中較為穩(wěn)定。

2.4 酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密配制濃度為5、10、15、20、30、40、60 mg·L－1的酚紅 K-R 溶液，各精密移取1 mL置于10 mL容量瓶，加NaOH溶液(1 mol·L－1)2 mL，K-R 液稀釋至刻度，搖勻后在558 nm可見光下測定各濃度溶液的吸光度，以酚紅濃度C對(duì)溶液吸光度A線性回歸，得酚紅標(biāo)準(zhǔn)曲線:Y=0.0151X+0.0436，R2=0.999 8(n=8)，線性范圍為5 ～60 mg·L－1。

分別精確配制10、10、60 mg·L－1的酚紅 K-R 溶液，考察標(biāo)曲回收率及精密度(n=5)。結(jié)果回收率均在98%到100.5%之間，日內(nèi)RSD和日間RSD均在5%以內(nèi)，說明本方法回收率較高，精密度較好。

2.5 數(shù)據(jù)處理方法 酚紅法校正灌流液體積變化，校正公式為:

Cout(corrected)為流出液校正后的藥物濃度，Cout為實(shí)際測得的藥物濃度，PRout為流出液中酚紅的濃度，PRin為灌流液入口處酚紅的濃度。

藥物有效滲透系數(shù)(Peff)和吸收速率常數(shù)(Ka)分別用公式(2)、(3)計(jì)算得到:

Cin為灌流液入口處藥物濃度，Q為灌流液流速，本實(shí)驗(yàn)為 0.02 mL·min－1，r為在體實(shí)驗(yàn)?zāi)c段的腸道半徑，L為在體實(shí)驗(yàn)?zāi)c段的長度。

經(jīng)公式(1)、(2)和(3)計(jì)算得到不同濃度、不同pH值以及不同腸段Ka和Peff，使用SPSS19.0軟件LSD檢驗(yàn)法進(jìn)行單因素方差分析，以P＜0.05時(shí)認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.6 厄貝沙坦腸吸收影響因素的考察

2.6.1 腸段及濃度對(duì)厄貝沙坦腸吸收的影響 取50、100、150 mg·L－1的藥物灌流液，按照“2.2”節(jié)的試驗(yàn)方法對(duì)大鼠的十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸同時(shí)進(jìn)行單腸灌流實(shí)驗(yàn)，按照“2.4”節(jié)數(shù)據(jù)處理方法對(duì)測定的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，結(jié)果見表1和圖2，結(jié)果顯示厄貝沙坦在各腸段吸收較好，為全腸道吸收藥物。

表1 不同濃度的厄貝沙坦溶液在不同腸段的吸收速率常數(shù)

經(jīng)方差分析，當(dāng)灌流液中藥物濃度為50、100 mg·L－1時(shí)，十二指腸的吸收速率常數(shù)Ka與空腸、回腸以及結(jié)腸的Ka差異有顯著性，空腸、回腸和結(jié)腸之間的Ka差異無顯著性;當(dāng)灌流液中藥物濃度為150 mg·L－1時(shí)四腸段的Ka均差異無顯著性。十二指腸50 和 100 mg·L－1的 Ka都與 150 mg·L－1的 Ka差異有顯著性，空腸、回腸和結(jié)腸三個(gè)濃度間均差異無顯著性。方差分析結(jié)果顯示厄貝沙坦在空腸、回腸和結(jié)腸的吸收以被動(dòng)擴(kuò)散為主，而在十二指腸中的吸收是以被動(dòng)擴(kuò)散和主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)相結(jié)合的方式進(jìn)行。

圖2 不同濃度的厄貝沙坦溶液在不同腸段的有效滲透系數(shù)

2.6.2 灌流液pH值對(duì)藥物吸收的影響 按照本節(jié)“2.1”藥物灌流液配制方法制備 100 mg·L－1的厄貝沙坦腸灌流液，用NaOH、HCl分別調(diào)節(jié)pH值，得 pH 值分別為6.0、6.8、7.4 的藥物灌流液，分別按照“2.2”大鼠在體單向腸灌流的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，考察不同pH值的灌流液中藥物的吸收情況。結(jié)果見表2和圖3，經(jīng)方差分析，各腸段中，不同pH值灌流液之間的Ka和Peff差異無顯著性，表明灌流液pH值對(duì)藥物的吸收沒有影響。

表2 不同pH值灌流液的藥物吸收速率常數(shù)

圖3 不同pH值灌流液的藥物有效滲透系數(shù)

3 討論

本研究采用在體單向腸灌流法考察藥物厄貝沙坦在大鼠十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸四個(gè)腸段的吸收速率常數(shù)Ka和有效滲透系數(shù)Peff，以及濃度和pH值對(duì)藥物吸收的影響，在體單向腸灌流法與離體法相比能夠更加真實(shí)地反映出藥物在大鼠腸道的吸收情況，與循環(huán)腸灌流法相比，其吸收速率穩(wěn)定，實(shí)驗(yàn)對(duì)大鼠腸壁造成損傷較小，與人體相關(guān)性較好。本研究的結(jié)果顯示厄貝沙坦為全腸道吸收的藥物，且以十二指腸為主要吸收腸段，腸道pH對(duì)藥物的吸收沒有影響。

考慮到厄貝沙坦為生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)Ⅱ類藥物［12］，本研究也證明了厄貝沙坦在腸道有較好的吸收，因此在制備厄貝沙坦藥物制劑時(shí)，可以通過提高厄貝沙坦的溶解度來提高藥物的生物利用度，增強(qiáng)藥物的治療效果。

［1］ 呂留強(qiáng)，趙 立，李曉波，等.厄貝沙坦氫氯噻嗪對(duì)原發(fā)性高血壓伴早期腎損害尿微量白蛋白和N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的影響［J］.實(shí)用心腦肺血管病雜志，2012，20(1):34 －36.

［2］ 盧金萍，陳 玲，李 夏，等.厄貝沙坦在老年肥胖高血壓患者中的療效［J］.臨床心血管病雜志，2012，27(11):841 －843.

［3］ 潘宏華，邊平達(dá).厄貝沙坦聯(lián)合氨氯地平或氫氯噻嗪在老年高血壓患者中的療效［J］.中國臨床藥理學(xué)雜志，2013，29(4):246－248.

［4］ Substudy TM.Irbesartan in patients with atrial fibrillation［J］.N Engl J Med，2011，364(10):928 －938.

［5］ Ros-Ruiz S，Aranda-Lara P，F(xiàn)ernández JC，et al.High doses of irbesartan offer long-term kidney protection in cases of established diabetic nephropathy［J］.Nefrologia，2012，32(2):132.

［6］ 王 用，邢玉龍.胺碘酮聯(lián)合厄貝沙坦治療陣發(fā)性房顫療效觀察［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(3):492 －493.

［7］ Hadi NR，Alamran FG，Mohammad BI，et al.Irbesartan Ameliorates Myocardial Ischaemia/Reperfusion Injury in Rats Via Down Regulation of Apoptosis and the Inflammatory Pathways［J］.Journal of the American College of Cardiology，2013，62(18):C58 － C59.

［8］ 沈 杰，杜望春，宋鐘娟.替米沙坦的大鼠腸吸收特性及聯(lián)用藥物對(duì)其吸收的影響［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32(22):1805－1808.

［9］ 王亞男，甄毅嵐，李曉亮，等.牡荊素與牡荊素鼠李糖苷大鼠在體腸吸收對(duì)比研究［J］.安徽醫(yī)藥，2013，17(10):1660 －1663.

［10］ Luo Z，Liu Y，Zhao B，et al.Ex vivo and in situ approaches used to study intestinal absorption［J］.Journal of pharmacological and toxicological methods，2013，68(2):208 －216.

［11］ 彭俊杰，藺聰聰，李 江，等.氟比洛芬的大鼠在體腸吸收動(dòng)力學(xué)研究［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2013，48(3):423 －427.

［12］ Ganapuram BR，Alle M，Dadigala R，et al.Development，evaluation and characterization of surface solid dispersion for solubility and dispersion enhancement of irbesartan［J］.Journal of Pharmacy Research，2013，7(6):472 －477.