張玉婷，高家榮，劉 健，韓燕全，姜 輝，吳 健，劉 娟，羅 歡

(1.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，國家中醫(yī)藥管理局中藥制劑三級實驗室;2.安徽中醫(yī)藥大學，安徽合肥 230031)

五味溫通除痹膠囊是安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院風濕科劉健教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗研制的驗方，處方由淫羊藿、茯苓、黃芩、片姜黃、桂枝等5味中藥組成;具有溫陽通脈，散寒止痛的功效，主要治療類風濕性關(guān)節(jié)炎、強直性脊柱炎、骨關(guān)節(jié)炎、寒濕痹阻型所致的關(guān)節(jié)疼痛、腫脹，畏寒怕冷等病癥［1－2］。為優(yōu)化其制備工藝，本試驗采用 L9(34)正交設(shè)計試驗方法，通過對水提工藝影響較大的因素如提取次數(shù)、提取時間、加水量等因素進行考察。由于淫羊藿是方中的君藥，故以淫羊藿苷提取率、浸膏得率為評價指標進行綜合評定，優(yōu)選出該制劑的最佳水提工藝，為優(yōu)化其制備工藝提供實驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色譜儀(美國Waters公司)，包括四元高壓梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測器以及Empower2數(shù)據(jù)處理工作站;BP211D電子天平(德國塞多利斯公司);PTHW型調(diào)溫電熱套(鞏義市予華儀器有限責任公司);HH－S型水浴鍋(鄭州長城科工貿(mào)有限公司);真空干燥箱(上海博遠實業(yè)有限公司);KQ3200DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥 淫羊藿苷對照品(含量測定用，批號110737－200312)，購自中國藥品生物制品檢定所;處方藥材飲片均由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供，經(jīng)李立華主任中藥師鑒定均符合《中國藥典》(2010版)一部規(guī)定;甲醇、乙腈均為色譜純(美國Tedia公司);水為屈臣氏蒸餾水;其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 正交試驗設(shè)計 根據(jù)本處方中君藥的主要有效成分的化學性質(zhì)及預實驗結(jié)果，采用L9(34)正交表安排試驗方案，考察主要因素加水量(A)、提取時間(B)、提取次數(shù)(C)，以淫羊藿苷提取率、浸膏得率為評價指標進行綜合評分(權(quán)重系數(shù)分別為0.6、0.4)，優(yōu)選最佳水提工藝。正交試驗因素水平設(shè)計見表1。

表1 正交試驗因素水平表

按處方配比稱取各藥材9份，根據(jù)正交試驗設(shè)計的條件進行加熱回流，合并提取液、濾過，減壓濃縮，備用。

2.2 淫羊藿苷含量的測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱:Acquity BEH C18柱(100 mm × 2.1 mm，1.7 μm);流動相:乙腈 － 水(27∶73);柱溫:22℃;流速:0.2 mL·min－1;檢測波長:270 nm;進樣量:1.0 μL。見圖1。

2.2.2 對照品溶液制備 精密稱取淫羊藿苷對照品適量，精密加入甲醇制成含淫羊藿苷0.16 g·L－1的對照品溶液母液，備用。

2.2.3 供試品溶液的制備 將干浸膏研成粉末，過60目篩，稱定1 g置錐形瓶中，加入稀乙醇20 mL，稱定重量，超聲處理(功率100 W，頻率40 Hz)1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補足減失的重量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.2.4 陰性對照品溶液及原藥材溶液的制備按處方比例，取除淫羊藿外的其他藥材，按照制劑工藝制成干浸膏，再按“2.2.3”項下方法制備陰性對照品溶液。另取淫羊藿粉末0.5 g，按“2.2.3”項下配制原藥材溶液，備用。

圖1 UPLC色譜圖

2.2.5 系統(tǒng)適用性試驗 將淫羊藿苷對照品溶液、供試品溶液及陰性對照品溶液按“2.2.1”色譜條件進樣分析，由圖1可知，淫羊藿苷保留時間約在5.40 min，其色譜峰與其相鄰峰達到完全基線分離，對照品溶液與供試品溶液在相同位置有對應(yīng)的色譜峰，陰性對照溶液在相應(yīng)位置無干擾。

2.2.6 線性關(guān)系考察 分別將母液用甲醇稀釋成0.016、0.032、0.064、0.096、0.128、0.160 g·L－1濃度的對照品溶液，按上述色譜條件測定，以峰面積(Y)為縱坐標，以濃度(X)為橫坐標，繪制標準曲線，得回歸方程Y=30 108 528.08X －94 023.65，r=0.999 9。結(jié)果表明，淫羊藿苷在 0.016 ～0.160 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.2.7 精密度試驗 取淫羊藿苷對照品溶液重復進樣6次，按上述色譜條件測定峰面積，RSD為1.82%(n=6)，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗 取正交試驗第5組供試品溶液，分別在第0、2、4、8、12、24 h 測定峰面積，RSD 值為4.09%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.9 重復性試驗 取正交試驗第5組樣品浸膏，平行制備6份供試品溶液，按上述色譜條件測定峰面積，RSD值為1.89%(n=6)，表明該方法重復性良好。

2.2.10 加樣回收率試驗 取6份已知含量的樣品，加入淫羊藿苷對照品溶液，按“2.2.3”項下方法制成溶液，按“2.2.1”項下色譜條件測定，計算加樣回收率。結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果(n=6)

2.3 浸膏得率的測定 將“2.1”項下9份稠浸膏置干燥箱中，70℃減壓干燥至恒重，移至干燥器中冷卻30 min，迅速稱重。計算浸膏得率，浸膏得率(%)=浸膏重量/原藥材的重量×100%。

2.4 正交試驗結(jié)果及分析 以淫羊藿苷提取率及浸膏得率為指標，考察水提工藝，正交試驗安排及結(jié)果見表3，對實驗結(jié)果進行方差分析，結(jié)果見表4。

表3 正交試驗安排L9(34)及結(jié)果考察

表4 方差分析結(jié)果

2.5 最佳工藝確定 以以淫羊藿苷提取率和浸膏得率為指標，綜合評分結(jié)果顯示，由各因素水平直觀分析的K值高低可以得出影響水提效果的因素主次為C＞A＞B，最優(yōu)水平組合為A3B3C3。方差分析結(jié)果表明，因素C(提取次數(shù))對試驗結(jié)果影響有顯著性意義(P＜0.05)，而因素 A(加水量)、B(提取時間)對試驗結(jié)果影響無顯著性意義。由于在實際生產(chǎn)中，從節(jié)約時間及能源，提高生產(chǎn)效率，以及生產(chǎn)的可行性等角度綜合考慮，制定最佳提取工藝為加10倍水，提取3次，每次1.0 h。

2.6 驗證試驗 按處方配比，取與正交試驗同批次的藥材共3份，分別加10倍水，提取3次，每次1.0 h。平行測定3次，經(jīng)計算淫羊藿苷的提取率為(74.59 ±2.32)%，浸膏得率為(15.87 ±0.27)%。由驗證試驗結(jié)果表明優(yōu)選的條件穩(wěn)定、可靠、有效成分提取率較高。

3 討論

淫羊藿作為方中的君藥，其主要活性成分為淫羊藿苷，可溶于水，甲醇，乙醇等溶劑，故可以用水提法，乙醇回流法等方法提取［3－11］。本試驗為了降低成本，便于制劑大批量生產(chǎn)，故采用具有應(yīng)用廣泛、裝置簡單的傳統(tǒng)水提法。

查閱相關(guān)文獻，大都采用HPLC法測含量［12－14］，本實驗首次建立了UPLC法測定淫羊藿苷提取率的方法，采用乙腈 － 水(27∶73)為流動相，較藥典［15］的梯度洗脫更節(jié)約溶劑，此方法所用時間為16 min，較藥典的55 min，大大的節(jié)省了測定時間。在保持較高的準確度和精密度的同時，提高了分離效率，減少了溶劑的損耗，縮短了測定時間，為該制劑的質(zhì)量控制提供了一種更為快速準確的測定方法。

本試驗采用正交試驗，通過綜合評分法，優(yōu)選出的提取工藝更具有科學性和合理性，對提取工藝的研究有著積極的指導意義，也是進行工藝篩選評價的一個可行模式。該水提工藝設(shè)計合理，可為五味溫通除痹膠囊的研制提供理論依據(jù)和試驗基礎(chǔ)。

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