張 凱，管振鋒，丁 晨，朱建寧，杜依青，王新陽，賀大林，范晉海

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，陜西西安 710061）

據(jù)估計(jì)，2008年全球膀胱癌新增病例386 300例，死亡150 200例，且在世界范圍內(nèi)發(fā)病率差別較大，不同地區(qū)膀胱癌的發(fā)病率可相差14倍［1］。在美國，根據(jù)1975～2010年的統(tǒng)計(jì)，男性膀胱癌的發(fā)病率和死亡率分別位于惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率的第4和第7位，膀胱癌嚴(yán)重威脅著人類的健康［2］。

趨化因子是一種重要的小分子細(xì)胞因子，到目前為止，近50種趨化因子得以發(fā)現(xiàn)，成為最大的細(xì)胞因子亞家族。根據(jù)蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)進(jìn)行分類：CXC（α）；CC（β）；C（γ）；CX3C（δ）［3］。趨化因子及其受體在腫瘤發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移等方面具有重要作用，趨化因子相關(guān)產(chǎn)品已經(jīng)進(jìn)入臨床研究，成為新的生物治療熱點(diǎn)［4］。

在本研究中，我們用免疫組化法研究136例膀胱癌標(biāo)本和30例正常膀胱組織標(biāo)本中CXCL5表達(dá)水平，探討CXCL5的表達(dá)與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后的關(guān)系。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科2006年1月至2009年1月間確診為膀胱癌住院手術(shù)（包括膀胱腫瘤電切和膀胱全切）、并有完整臨床和隨訪資料的膀胱癌患者136例，其中男105例，女31例；年齡27～84歲，平均（54.0±0.24）歲。病理診斷均為膀胱移行細(xì)胞癌。患者術(shù)前均未經(jīng)過放療及化療等。正常膀胱組織取自30例膀胱癌全切標(biāo)本，距離癌灶5cm 以上的癌旁膀胱組織視為正常膀胱組織。該研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，詳細(xì)實(shí)驗(yàn)情況告知患者并簽署知情同意書。

1.2 腫瘤分級、分期及隨訪有關(guān)情況 病理分級按WHO 1973分級系統(tǒng)。腫瘤分期依據(jù)國際抗癌聯(lián)盟（Union for International Cancer Control，UICC）2003版分期標(biāo)準(zhǔn)，生存時(shí)間的計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)按從手術(shù)日到因復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移而死亡的日期或隨訪日期（2014年2月）為止。

1.3 主要試劑及儀器 兔抗人CXCL5多克隆抗體（sc－292642），工作濃度1∶200，購自Santa Cruz公司。免疫組化檢測試劑盒，含山羊抗兔辣根過氧化物酶生物素化二抗，購自基因科技（上海）有限公司。

1.4 免疫組織化學(xué)方法 先將切片置于60 ℃烤箱內(nèi)烘烤2h，然后二甲苯脫蠟，乙醇梯度水化，再將切片放入數(shù)控?zé)峥乖迯?fù)儀，121℃維持5min 進(jìn)行抗原修復(fù)，之后阻斷內(nèi)源性過氧化物，用抗體稀釋液按1∶200稀釋兔抗人CXCL5多克隆抗體，每張切片設(shè)置一個(gè)陰性對照，用PBS 代替一抗。將加好一抗的切片放到濕盒內(nèi)，置于4℃冰箱過夜，再用二抗在室溫下孵育30min，然后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸分化，氨水返藍(lán)，最后用乙醇梯度脫水，二甲苯透明，用中性樹膠封片。

1.5 結(jié)果判斷 評分標(biāo)準(zhǔn)參考BEGLEY等［5］的方法，染色強(qiáng)度分級如下：無著色為0，淡棕黃色為1，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽性細(xì)胞數(shù)分級為：陽性細(xì)胞數(shù)＜5%為0，5%～24%為1，25%～49%為2分，≥50%為3分。染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞比例評定陽性表達(dá)：隨機(jī)選取一個(gè)視野后計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞中陽性細(xì)胞數(shù)，再在每張切片中選取8個(gè)400倍視野，然后計(jì)算陽性細(xì)胞率。目前多采用積分綜合計(jì)量：兩個(gè)得分相乘得到0～9分的總得分，將總得分0～3分組織視為CXCL5表達(dá)陰性，4～6分的組織視為CXCL5表達(dá)弱陽性，7～9 分的組織視為CXCL5 表達(dá)強(qiáng)陽性。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。計(jì)數(shù)資料分析用χ2檢驗(yàn)，膀胱癌相關(guān)生存期生存分析采用Kaplan－Meier分析法，生存分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果用Log－Rank檢驗(yàn)判斷差異性。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 CXCL5 在膀胱癌組織中的表達(dá)明顯高于正常膀胱組織 免疫組化染色結(jié)果顯示CXCL5在膀胱癌組織和正常膀胱組織的表達(dá)情況（圖1A～1E）。圖1A 為正常膀胱組織樣本，可見有個(gè)別細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有淡黃色顆粒；圖1B為G1級膀胱癌組織，可見有少量細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有淡黃色顆粒；圖1C 為G2級膀胱癌組織，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有明顯的棕色顆粒；圖1D 為G3級膀胱癌組織，細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有很明顯的棕褐色顆粒；圖1E為陰性對照切片。對趨化因子CXCL5的表達(dá)部位分析，CXCL5主要位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)中，提示CXCL5可能分泌至細(xì)胞外發(fā)揮作用。

圖1 CXCL5在正常膀胱組織和膀胱癌組織中的表達(dá)（左下角局部放大圖）

在136例膀胱癌組織和30例正常膀胱組織中，趨化因子CXCL5染色陽性率在膀胱癌組織的表達(dá)率高于正常膀胱組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

2.2 膀胱癌組織中CXCL5的表達(dá)與病理分級、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān) 在男、女性中，CXCL5陽性表達(dá)率在性別、年齡分組方面差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；在病理分級、腫瘤分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分組中，病理分級、分期高及有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者，CXCL5陽性表達(dá)率較高，差異有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05，表2）。

表1 CXCL5的表達(dá)陽性率在正常膀胱組織與膀胱癌組織中的比較 ［例（%）］

表2 CXCL5的陽性表達(dá)率在膀胱癌各分組間的差異 ［例（%）］

2.3 膀胱癌組織中CXCL5的表達(dá)與預(yù)后呈負(fù)相關(guān)截止2014年2月，隨訪患者中最長隨訪時(shí)間為59個(gè)月，死亡39例，無瘤存活97例，失訪病例已排除。根據(jù)隨訪資料，Kaplan－Meier生存曲線統(tǒng)計(jì)分析示：CXCL5強(qiáng)陽性表達(dá)組、弱陽性表達(dá)組和陰性組的中位生存期分別為36.0月、51.4月和56.0月；CXCL5強(qiáng)陽性表達(dá)組、弱陽性表達(dá)組和陰性組的5年生存率分別為43.4%、84.5%和100%。CXCL5的陽性表達(dá)與患者的5年生存率呈負(fù)相關(guān)。其中變量組間的差異分析使用Log－Rank檢驗(yàn)分析，三者之間的生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2＝12.34，P＜0.05，圖2）。

圖2 CXCL5的表達(dá)與膀胱癌5年生存率的關(guān)系

3 討論

CXC趨化因子是一組和腫瘤血管生成密切相關(guān)的細(xì)胞因子，根據(jù)第一個(gè)半胱氨酸前是否有ELR（谷氨酸－亮氨酸－精氨酸）功能區(qū)分為ELR 趨化因子和非ELR 趨化因子，其中ELR＋趨化因子可使腫瘤血管新生，但非ELR 趨化因子可抑制腫瘤血管生成，而CXCL5屬于ELR 趨化因子［6］。CXCL5可促進(jìn)血管生成，具有很強(qiáng)的粒細(xì)胞趨化作用，由上皮細(xì)胞、中性粒細(xì)胞／內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等產(chǎn)生。研究顯示CXCL5可識別并結(jié)合G 蛋白偶聯(lián)受體CXCR2，對腫瘤的形成和進(jìn)展發(fā)揮重要作用［7－8］。

血管生長在腫瘤發(fā)展、浸潤和轉(zhuǎn)移中起著非常重要的作用，是腫瘤生長的基礎(chǔ)［9］。實(shí)驗(yàn)研究表明抑制腫瘤血管生成可明顯影響腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移及進(jìn)展［10］。白細(xì)胞介素－17 可明顯增強(qiáng)趨化因子CXCL1、5、8在腫瘤血管生成的活力，通過增加腫瘤的微血管密度來促進(jìn)腫瘤的生長［11］。腫瘤細(xì)胞可與宿主的特異性趨化因子受體結(jié)合進(jìn)而獲得生長優(yōu)勢，研究發(fā)現(xiàn)肝、肺等靶器官的特異性轉(zhuǎn)移與淋巴轉(zhuǎn)移機(jī)制有關(guān)，可能通過分泌IL－8等趨化因子從而募集嗜中性白細(xì)胞，進(jìn)而上調(diào)蛋白酶活性，從而降解細(xì)胞外基質(zhì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移等［3］。CXCL5屬于（ELR＋）CXC趨化因子，推斷其通過促進(jìn)血管形成和募集炎癥細(xì)胞進(jìn)而在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)CXCL5在非小細(xì)胞肺癌［12］、胰腺惡性腫瘤［6］、腎癌［13］、大腸癌［14］、膽管上皮癌［15］和前列腺癌［5］中表達(dá)明顯增高，表達(dá)水平與疾病的晚期狀態(tài)、局部浸潤和轉(zhuǎn)移潛能相關(guān)。近來，有學(xué)者用PCR和Western blot檢測CXCL5 在膀胱癌組織和細(xì)胞中的表達(dá)，并用shRNA 下調(diào)膀胱癌細(xì)胞T24中CXCL5的水平，可降低T24 細(xì)胞增殖、遷移能力，并通過PI3K－AKT 和ERK1／2信號途徑在體外誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡［16］。

本研究中，免疫組化結(jié)果提示膀胱癌組織中的CXCL5 陽性率明顯高于正常膀胱組織的陽性率。CXCL5的表達(dá)水平與膀胱癌病理分級、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。而且CXCL5 的表達(dá)水平與膀胱癌的預(yù)后有關(guān)，CXCL5表達(dá)越高，預(yù)后也越差。我們推斷CXCL5在膀胱癌的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中可能扮演了較為重要角色，參與的機(jī)制可能有：①CXCL5 激活癌細(xì)胞的PI3K－AKT 和ERK1／2 信號通路，促進(jìn)腫瘤增殖、遷移和侵襲。此外，在體外研究中，CXCL5對中性粒細(xì)胞有直接趨化作用。在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，癌細(xì)胞中CXCL5的上調(diào)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長以及肺轉(zhuǎn)移，瘤內(nèi)中性粒細(xì)胞浸潤數(shù)目也增加［17］。②CXCL5 與CXCR2受體結(jié)合使腫瘤細(xì)胞易于移動(dòng)，腫瘤細(xì)胞骨架重建；CXCL5促進(jìn)腫瘤形成的新生血管或作為腫瘤轉(zhuǎn)移的重要通道；CXCL5與受體結(jié)合釋放MMP－9，使基質(zhì)屏障破壞，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移［18］。③CXCL5與受體結(jié)合后通過PI3K－AKT 和MAPK 信號通路，激活轉(zhuǎn)錄因子ELKl，從而激活下游一些與腫瘤發(fā)生、生長及轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因，進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長及轉(zhuǎn)移［19］。CXCL5與受體結(jié)合后，可作用于酪氨酸激酶受體（RPTKs），從而引起趨化運(yùn)動(dòng)、血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及抑制內(nèi)皮細(xì)胞凋亡等生物學(xué)效應(yīng)［20－21］。本研究結(jié)果與前人研究類似，據(jù)此推測CXCL5可能通過促進(jìn)膀胱癌血管形成、降解癌細(xì)胞外基質(zhì)、抑制癌細(xì)胞凋亡來影響膀胱癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移等。

綜上，CXCL5可能通過PI3K－AKT 和ERK1／2信號通路抑制膀胱癌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而影響膀胱癌的進(jìn)展和預(yù)后。趨化因子基因治療和基因疫苗有望成為膀胱癌治療的新方法。

［1］JEMAL A，BRAY F，CENTER M M，et al.Global cancer statistics［J］.CA Cancer J Clin，2011，61（2）：69－90.

［2］SIEGEL R，MA J，ZOU Z，et al.Cancer statistics，2014［J］.CA Cancer J Clin，2014，64（1）：9－29.

［3］ZLOTNIK A.Chemokines and cancer［J］.Int J Cancer，2006，119（9）：2026－2029.

［4］SARVAIYA P J，GUO D，ULASOV I，et al.Chemokines in tumor progression and metastasis［J］.Oncotarget，2013，4（12）：2171－2185.

［5］BEGLEY L A，KASINA S，MEHRA R，et al.CXCL5promotes prostate cancer progression［J］.Neoplasia，2008，10（3）：244－254.

［6］LI A，KING J，MORO A，et al.Overexpression of CXCL5is associated with poor survival in patients with pancreatic cancer［J］.Am J Pathol，2011，178（3）：1340－1349.

［7］KOCH A E，KUNKEL S L，HARLOW L A，et al.Epithelial neutrophil activating peptide－78：a novel chemotactic cytokine for neutrophils in arthritis［J］.J Clin Invest，1994，94（3）：1012－1018.

［8］WALZ A，BURGENER R，CAR B，et al.Structure and neutrophil－activating properties of a novel inflammatory peptide（ENA－78）with homology to interleukin 8［J］.J Exp Med，1991，174（6）：1355－1362.

［9］KEANE M P，STRIETER R M.The role of CXC chemokines in the regulation of angiogenesis［J］.Chem Immunol，1999，72：86－101.

［10］FOLKMAN J.Fighting cancer by attacking its blood supply［J］.Sci Am，1996，275（3）：150－154.

［11］ZEITLIN B D，JOO E，DONG Z，et al.Antiangiogenic effect of TW37，a small－molecule inhibitor of Bcl－2［J］.Cancer Res，2006，66（17）：8698－8706.

［12］YANAGAWA J，WALSER T C，ZHU L X，et al.Snail promotes CXCR2ligand－dependent tumor progression in non－small cell lung carcinoma［J］.Clin Cancer Res，2009，15（22）：6820－6829.

［13］HLAVKOVA D，KOPECKY O，LUKESOVA S，et al.Monitoring of serum levels of angiogenin，ENA－78and GRO chemokines in patients with renal cell carcinoma（RCC）in the course of the treatment［J］.Acta Medica（Hradec Kralove），2008，51（3）：185－190.

［14］KAWAMURA M，TOIYAMA Y，TANAKA K，et al.CXCL5，apromoter of cell proliferation，migration and invasion，is a novel serum prognostic marker in patients with colorectal cancer［J］.Eur J Cancer，2012，48（14）：2244－2251.

［15］ZHOU S L，DAI Z，ZHOU Z J，et al.CXCL5contributes to tumor metastasis and recurrence of intrahepatic cholangiocarcinoma by recruiting infiltrative intratumoral neutrophils［J］.Carcinogenesis，2014，35（3）：597－605.

［16］ZHENG J，ZHU X，ZHANG J.CXCL5knockdown expression inhibits human bladder cancer T24cells proliferation and migra－tion［J］.Biochem Biophys Res Commun，2014，446（1）：18－24.

［17］ZHOU S L，DAI Z，ZHOU Z J，et al.Overexpression of CXCL5mediates neutrophil infiltration and indicates poor prognosis for hepatocellular carcinoma［J］.Hepatology，2012，56（6）：2242－2254.

［18］TACKE F，ZIMMERMANN H W，TRAUTWEIN C，et al.CXCL5plasma levels decrease in patients with chronic liver disease［J］.J Gastroenterol Hepatol，2011，26（3）：523－529.

［19］MURPHY C，MCGURK M，PETTIGREW J，et al.Nonapical and cytoplasmic expression of interleukin－8，CXCR1，and CXCR2correlates with cell proliferation and microvessel density in prostate cancer［J］.Clin Cancer Res，2005，11（11）：4117－4127.

［20］SHYAMALA V，KHOJA H.Interleukin－8receptors R1and R2 activate mitogen－activated protein kinases and induce c－fos，independent of Ras and Raf－1in Chinese hamster ovary cells［J］.Biochemistry，1998，37（45）：15918－15924.

［21］WU J L，ABE T，INOUE R，et al.IkappaBalphaM suppresses angiogenesis and tumorigenesis promoted by a constitutively active mutant EGFR in human glioma cells［J］.Neurol Res，2004，26（7）：785－791.