張家安 周炳榮 胡燕燕 吳維 尹慧彬 張倩 郭嫻菲 駱丹
沉默miRNA-23a對UVB誘導成纖維細胞慢性光損傷的影響
張家安 周炳榮 胡燕燕 吳維 尹慧彬 張倩 郭嫻菲 駱丹
目的探討沉默miRNA-23a對UVB照射所致成纖維細胞慢性光損傷的影響。方法將成纖維細胞分為空白對照組、UVB光損傷組、miRNA-23a沉默組、UVB光損傷+miRNA-23a沉默組。SA-β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)化學染色測定老化程度,流式細胞儀檢測細胞周期,實時PCR法檢測p53、p16、p21 mRNA的表達,免疫印跡法檢測p53、p16、p21的蛋白表達量。結果UVB光損傷組與UVB光損傷+miRNA-23a沉默組的SA-β-Gal細胞藍染陽性率分別為(94.60±2.58)%、(48.18±3.70)%,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。G1期阻滯率分別為(85.06±1.52)%、(57.48±2.01)%,兩組間差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。UVB光損傷+miRNA-23a沉默組的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表達量與UVB光損傷組相比,差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論沉默miRNA-23a對UVB誘導成纖維細胞衰老有抑制作用,而miRNA-23a對下游衰老相關信號分子的抑制可能是其機制之一。
紫外線;成纖維細胞;微RNAs;細胞衰老
細胞衰老是一種永久性的增殖抑制狀態(tài),中波紫外線照射等多種因素可誘導機體提前進入衰老狀態(tài),從而引起多種生物學指標異常[1-2]。微小RNA(miRNA)是一種非編碼單鏈小RNA分子,能夠通過與基因3'UTR區(qū)堿基不完全或完全配對而導致靶mRNA降解或抑制其翻譯,從而對基因進行轉錄后調控[3-4]。研究顯示,miRNA-23a在維持正常細胞組織功能中起著重要的作用[5]。我們前期[6]對中波紫外線(UVB)誘導成纖維細胞提前衰老差異性表達的miRNA進行了基因芯片篩選,發(fā)現(xiàn)成纖維細胞在接受劑量為50mJ/cm2的UVB照射24h后miRNA-23a的表達出現(xiàn)顯著上調。我們通過沉默miRNA-23a,觀察光損傷成纖維細胞的各項生物學指標,以了解其對光損傷進程的影響,并探討其機制。
成纖維細胞取自成年健康男性包皮組織。胰酶購于美國Amresco公司,DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司,小牛血清購于杭州四季清生物工程材料有限公司,細胞衰老β-半乳糖苷酶(SA-β-Gal)購于江蘇碧云天生物技術研究所,Trizol核酸提取液購于美國Invitrogen公司,miR-23a antagomir購于廣州銳博生物科技有限公司,實時熒光定量PCR試劑盒、p53、p16、p21抗體均購于南京凱基生物科技發(fā)展有限公司,UVB照射儀購于上海希格瑪高技術有限公司(ss-40,發(fā)射波長280~ 320 nm,波峰311 nm)。
1.細胞的分離、培養(yǎng)與傳代:包皮修剪去除皮下組織,剪成0.5 cm×0.5 cm皮塊,聚維酮碘浸泡,生理氯化鈉溶液沖洗3次,加入0.5%分散酶,4℃消化18~20 h后分離表、真皮。真皮部分以包皮消化液37℃消化5 min后,加入DMEM培養(yǎng)基,吹打、過濾,過濾后將細胞液離心,棄上清,加入含10%胎牛血清、雙抗的高糖DMEM培養(yǎng)基,混勻并轉移至培養(yǎng)皿中,于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)細胞,細胞接種于直徑10 cm的培養(yǎng)皿中,接種密度為1.0×106個/皿,取10~15代對數(shù)生長期細胞進行實驗。
2.細胞轉染:成纖維細胞接種于直徑6 cm的培養(yǎng)皿中,無血清培養(yǎng)基培養(yǎng),用0.5 ml不含血清培養(yǎng)基稀釋 12.5 μl(20 μmol/L)miR-23a antagomir儲存液,輕輕混勻,室溫孵育5 min,同時用0.5 ml不含血清培養(yǎng)基稀釋1 μl LipofectamineTM2000,輕輕混勻并室溫孵育5 min,將兩者輕輕混勻,室溫孵育20 min后,將其加入含有細胞的4 ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中,培養(yǎng)6 h后,移去miR-23a antagomir-LipofectamineTM2000混合液,更換為新鮮完全培養(yǎng)基,于72 h后使用qRT-PCR法檢測轉染效率。
3.UVB照射:實驗分為4組??瞻讓φ战M為未經處理的成纖維細胞;UVB光損傷組為UVB直接照射;miRNA-23a沉默組為單純 miRNA-23a antagomir轉染;UVB光損傷 +miRNA-23a沉默組為先轉染,再予UVB照射。UVB照射方法參考文獻[6],用UVB探測儀標定UVB照射儀的照射度,UVB劑量 =UVB照射度×時間(s),培養(yǎng)板距燈管距離15 cm,照射總劑量為50 mJ/cm2,分為5 d照射,每天 10 mJ/cm2。
4.細胞化學酶染色法檢測SA-β-Gal:末次照射后3 d,收集并檢測細胞。使用β半乳糖苷酶染色試劑盒,按照說明書進行操作及相關試劑配制:用PBS清洗各組細胞,加入適量SA-β-Gal染色固定液,用PBS清洗各組細胞3次,加入適量細胞染色工作液,在37℃孵育20 h,在光學顯微鏡下觀察藍染陽性細胞,隨機選取3~5個視野(×400)進行陽性細胞計數(shù),統(tǒng)計陽性細胞百分率。
5.流式細胞儀檢測細胞周期:末次UVB照射后3 d,用0.125%的胰蛋白酶消化,離心收集細胞,以75%乙醇固定,PBS清洗3次,去除乙醇。取出4℃保存的含50 mg/L Triton的碘化丙錠,于各試驗管中分別加入200 μl碘化丙錠,振蕩成單細胞懸液,避光室溫靜置30 min,流式細胞儀檢測細胞周期。
6.實時熒光定量PCR檢測成纖維細胞p53、p16、p21的mRNA表達:細胞培養(yǎng)及分組處理同前,用TRIzol法提取細胞總RNA,取RNA樣品用1×TE緩沖液稀釋樣品100倍。測定樣品在260 nm和280 nm的吸收值確定RNA的質量。計算RNA的濃度 =A260× 稀釋倍數(shù) × 0.04 μg/μl。取滅菌且無核酸酶的0.2 ml PCR管,依次加入實驗樣品RNA 1 μl,Oligo dT 2 μl,無核酸酶的雙蒸水至總體積 10 μl,70℃保溫10 min,然后冰浴5 min依次加入下列組分:RNase抑制劑(40 U/μl),0.5 μl 10 × AMV 反應緩沖液 2 μl dNTP 2 μl,MgCl24 μl,逆轉錄酶 1 μl,無核酸酶的雙蒸水0.5 μl。輕輕混勻后,然后200×g離心20 s;先在42℃保溫60 min,然后95℃保溫5 min;上述產物進行PCR反應,加入2×實時PCR Master Mix 10 μl,模板 1 μl,引物 MIX 2 μl,DEPC水7 μl,置于實時定量儀中并設置反應參數(shù)。95℃、5 min,95 ℃、15、s,60 ℃、20 s,72 ℃、40 s共 40 個循環(huán)。RT-PCR產物以Ct值作為分析依據。
7.Western 印跡檢測 p53、p16、p21 蛋白表達量:收集各實驗組細胞,蛋白提取液分別處理細胞,收集細胞總蛋白,BCA法定量后經聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉膜,5%牛白蛋白PBS溶液常溫封閉2 h后,加入抗p53、p16、p21的一抗4℃孵育過夜,再加入二抗辣根過氧化酶標記抗體,用封閉液稀釋(1∶5 000)室溫下?lián)u蕩孵育2 h。最后化學增強發(fā)光法顯帶,加入工作液1 min,直接上機,曝光3 min。用灰度分析軟件Image Tool3.00進行條帶分析。
8.統(tǒng)計方法:用SPSS13.0軟件進行分析,兩組間用成組t檢驗,多組間行單因素方差分析,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
miR-23a antagomir轉染成纖維細胞后,用qRT-PCR法檢測miR-23a的相對表達量。與空白對照組(1.026 8±0.274 9)相比,miR-23a沉默組(0.000 8±0.000 1)的miR-23a的相對表達量明顯降低,差異有統(tǒng)計學意義,P<0.01。
圖1 沉默miR-23a對UVB誘導成纖維細胞慢性光損傷指標β-Gal表達率的影響(倒置顯微鏡下×40) β半乳糖苷酶染色,藍綠色細胞代表衰老細胞。1a:空白對照組;1b:UVB光損傷組;1c:miRNA-23a沉默組;1d:UVB光損傷+miRNA-23a沉默組
空白對照組β半乳糖苷酶染色陰性。UVB照射后,大部分細胞染色陽性(胞質染為藍色),占(94.6±2.58)%。而UVB+miRNA-23a沉默組細胞藍染面積明顯減少,與UVB光損傷組相比,其SA-β-Gal細胞藍染陽性率有明顯降低(48.18±3.70)%,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05,n=3),與 UVB 光損傷組相比,UVB光損傷 +miRNA-23a沉默組陽性細胞少而淡染,見圖1。
單純沉默miR-23a對G1期細胞沒有影響,與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05);UVB光損傷組G1期細胞增加,與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05);與UVB光損傷組相比,UVB光損傷+miRNA-23a沉默組G1期細胞阻滯率明顯下降(P<0.05),見圖2。
圖2 沉默miR-23a對UVB誘導慢性光損傷成纖維細胞的細胞周期的影響2a:空白對照組;2b:UVB光損傷組;2c:miRNA-23a沉默組;2d:UVB光損傷 +miRNA-23a沉默組
經Western印跡及實時PCR檢測顯示:與空白對照組相比,單純沉默mir-23a對成纖維細胞的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表達沒有影響(均P>0.05),UVB 照射后 72 h 可見 p53、p16、p21 mRNA及蛋白表達量明顯增加(均P<0.05)。與UVB光損傷組比較,UVB光損傷 +miRNA-23a沉默組的p53、p16、p21 mRNA及蛋白表達量明顯降低(均P<0.05),見表 1,圖 3。
miRNA調控著超過三分之一的mRNAs,在基因表達中發(fā)揮著重要的作用[7]。為驗證miRNA-23a在光損傷進程中的作用,我們通過miRNA-23a antagomir轉染調節(jié)各組miRNA-23a的相對表達量,檢測多種與衰老相關的生物學指標。miRNA-23a antagomir是經過特殊化學修飾的miRNA拮抗劑,通過與體內的成熟miRNA強競爭性結合,阻止miRNA與其靶基因mRNA的互補配對,抑制miRNA發(fā)揮作用。其中,SA-β-Gal是在衰老過程中特異表達的酶,是最常用的鑒別衰老細胞的生物學標志;復制衰老的細胞生長停止于G1期。p53、p16、p21是衰老相關通路中3個重要的信號分子,p16可通過抑制細胞周期蛋白依賴激酶(cycline dependent kinase,CDK)活性,使pRb蛋白去磷酸化,抑制細胞增殖,使細胞周期停滯于G1期,p21同樣可通過抑制CDK的活性,使pRb去磷酸化后與轉錄因子E2F結合,導致細胞阻滯于G1期,p53的表達上調和活化可直接引起細胞衰老,亦可通過p21/Rb通路引起衰老[8-10]。沉默mir-23a表達后再予UVB照射的成纖維細胞,其SA-β-Gal陽性率、G1期阻滯率、p53、p16、p21的 mRNA 及蛋白表達量較單純UVB照射,均出現(xiàn)明顯降低。這些結果表明沉默mir-23a對信號分子p53、p16、p21的下調作用,可能是抑制慢性光損傷的機制之一。
一些研究表明,miRNA-23a能夠促進胃腺癌細胞的生長并降低IL-6R的表達量[11];在人胚腎細胞中,上調miRNA-23a~27a~24-2簇能夠促進依賴或非依賴半胱氨酸的凋亡[12];然而,在人角質形成細胞中,上調mir-23a卻有助于降低UVB照射引起的細胞凋亡,并有助于CPD的清除[13]。miRNA-23a在不同細胞中表現(xiàn)出的不同作用可能是因為在不同細胞中的生理功能不同。在我們前期的miRNA芯片結果中,mir-23a在光損傷模型中表達顯著增加。同時在經UVB照射的小鼠上皮中,miRNA-23a也是上調的[6],而沉默miRNA-23a對光損傷有著保護作用。
在UVB照射誘導的成纖維細胞慢性光損傷過程中,沉默miRNA-23a有著重要的保護作用。除miRNA-23a外,也存在著許多其他miRNAs,它們也對老化的進程發(fā)揮著調控作用。隨著研究的深入,我們期待更多老化相關的miRNAs及其作用的靶基因和下游調控途徑被發(fā)現(xiàn)和闡明,不僅使我們對miRNA與老化之間的具體作用機制更加明了,也對老化的治療和預防提供了新的線索。
表1 UVB輻射后72 h各組p53、p16、p21 mRNA的相對表達量
圖3 Western印跡檢測p53、p16、p21結果 1:空白對照組;2:UVB組; 3:miRNA-23a沉默組; 4:UVB+miRNA-23a沉默組
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2013-03-04)
(本文編輯:吳曉初)
Effect of miRNA-23a silencing on ultraviolet B-induced chronic photodamage to fibroblasts
Zhang Jiaan,Zhou Bingrong,Hu Yanyan,Wu Wei,Yin Huibin,Zhang Qian,Guo Xianfei,Luo Dan.Department of Dermatology and Venereology,F(xiàn)irst Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China
Luo Dan,Email:daniluo2011@gmail.com
ObjectiveTo evaluate the effect of miRNA-23a silencing on ultraviolet B(UVB)-induced chronic photodamage to fibroblasts.MethodsFibroblasts from human foreskin were divided into four groups:blank control group receiving untreated,UVB group receiving UVB irradiation only,miRNA-23a group transfected with a miRNA-23a antagomir,UVB+miRNA-23a group receiving transfection with miRNA-23a antagomir followed by UVB irradiation.UVB irradiation was carried out once a day for five consecutive days at a dose of 10 mJ/cm2.Three days after the last irradiation,SA-β-galactosidase staining was performed to detect senescent cells,flow cytometry to analyze cell cycle,and real-time PCR and Western blot to measure the mRNA and protein expressions of p53,p16 and p21,respectively.ResultsBoth the percentage of β-galactosidase-positive cells and proportion of G1-phase cells were significantly higher in the UVB group than in the UVB+miRNA-23a group((94.60±2.58)%vs.(48.18±3.70)%,(85.06±1.52)%vs.(57.48±2.01)%,bothP<0.05).Significant differences were observed in the mRNA and protein expressions of p53,p16 and p21 between the UVB group and UVB+miRNA-23a group(allP<0.05).ConclusionsThe silencing of miRNA-23a may suppress UVB-induced chronic photodamage,which is likely to be associated with the inhibition of senescence-associated downstream signaling molecules.
Ultraviolet rays;Fibroblasts;MicroRNAs;Cell aging
10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.006
國家自然科學基金(81000700、81171518);江蘇省自然科學基金(BK2012877)
210029南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院皮膚性病科
駱丹,Email:daniluo2011@gmail.com