閔敏 張雪靜 馬紅 許輝 李遇梅

人脂肪間充質(zhì)干細胞體外向黑素細胞分化的研究

閔敏 張雪靜 馬紅 許輝 李遇梅

目的建立體外誘導人脂肪間充質(zhì)干細胞(hADSC)向黑素細胞分化的方法。方法由人皮下脂肪分離培養(yǎng)獲得hADSC，流式細胞儀檢測細胞表型，成骨成脂分化證明分化潛能。將干細胞生長因子(SCF)、內(nèi)皮素3(EDN-3)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)等加到條件培養(yǎng)基中，促使第5代hADSC向黑素細胞方向誘導，誘導至第10周。未誘導組為正常對照組。使用實時熒光定量PCR檢測黑素相關基因小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子(MITF)，酪氨酸激酶受體c-Kit(KIT)，多巴色素異構酶(DCT)，酪氨酸酶(TYR)，酪氨酸酶相關蛋白1(TYRP1)，性別決定區(qū)域相關轉(zhuǎn)錄因子10(SOX10)mRNA的表達量，統(tǒng)計學分析采用單因素方差分析及LSD-t檢驗。誘導結束后，通過免疫細胞化學法、細胞免疫熒光法進行鑒定。結果流式細胞儀顯示分離培養(yǎng)獲得的hADSC 高表達 CD29、CD44、CD73、CD90、CD105、CD166，陽性率均在 95%以上；低表達或不表達 CD31、CD34、CD45，人白細胞DR抗原(HLA-DR)。成骨成脂分化結果顯示hADSC具有分化潛能。實時熒光定量PCR結果顯示，誘導 10 周后，MITF、KIT、DCT、TYR、TYRP1、SOX10 mRNA 的表達水平分別為 0.325±0.012，0.042±0.006，0.046±0.013，0.036±0.005，0.041±0.003，0.225±0.014，與誘導0周組相比，均有上調(diào)(P＜0.05)。誘導結束后，免疫細胞化學MITF、HMB45染色陽性，細胞免疫熒光TYRP1、S100陽性表達。結論由人脂肪間充質(zhì)干細胞誘導所得細胞具有一定的黑素細胞生物學特性。

人脂肪間充質(zhì)干細胞；分化；黑素細胞

人表皮黑素細胞在保護人皮膚免受紫外線損傷過程中起關鍵作用，同時與多種皮膚疾病相關[1]。它的損傷或破壞會導致一系列色素紊亂性疾病，如斑駁病、白癜風。其中，白癜風是常見疾病，全球發(fā)病率大約為0.1%～2%，然而其發(fā)病機制尚不明確[1]。近年來干細胞移植治療白癜風的研究日益受到重視。人脂肪間充質(zhì)干細胞(human adipose-derived mesenchymal stem cells，hADSC)由 zuk 等[2]首次從抽脂手術脂肪中分離獲得的一類具有多向分化能力的干細胞，具有易獲取、高產(chǎn)率、低免疫原性等優(yōu)點。研究顯示，hADSC在不同誘導條件下，可以分化為脂肪樣細胞、軟骨樣細胞、成骨樣細胞、神經(jīng)樣細胞、心肌樣細胞、胰島素分泌樣細胞、表皮樣細胞等[3-4]。本研究擬建立體外誘導hADSC向黑素細胞分化的方法，為黑素細胞的進一步研究打下基礎。

材料與方法

一、試劑和材料

人脂肪組織來源于產(chǎn)科15例剖宮產(chǎn)者腹部皮下脂肪，平均年齡30歲，體質(zhì)指數(shù)22～24，健康狀況良好，無系統(tǒng)性疾病。低糖改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)、胎牛血清(FBS)購自美國Gibco公司。鼠抗人CD29-異硫氰酸熒光素(FITC)、CD31-FITC、CD34- 藻 紅 蛋 白 (PE)、CD45-PE、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-FITC、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC及同型IgG對照購自美國eBiosciences公司。Ⅰ型膠原酶、MCDB201培養(yǎng)基、3-異丁基-1-甲基黃嘌吟(3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX)、干細胞生長因子(SCF)，內(nèi)皮素-3(EDN-3)、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，12-O-十四烷酰佛波醋酸酯-13(TPA)、霍亂毒素(CT)、4'，6-二脒-苯基吲哚(DAPI)等購自美國Sigma公司。反轉(zhuǎn)錄及實時熒光定量PCR全套試劑盒購自日本TaKaRa公司。兔抗人MITF、鼠抗人TYRP1、鼠抗人S100抗體購自美國Santa Cruz公司；鼠抗人HMB45多克隆抗體購于武漢博士德生物工程有限公司。S-P即用型試劑盒及二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒，二抗(辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、山羊抗小鼠IgG，F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠IgG)購自北京中杉金橋生物技術有限公司。

二、試驗方法

1.hADSC分離和培養(yǎng)：實驗步驟在Zuk等[2]的基礎上作部分調(diào)整。無菌條件下將無菌脂肪組織剪碎至約1 mm3細小顆粒，D-Hanks液漂洗3次。0.15%Ⅰ型膠原酶37℃搖床消化45 min。加入10%FBS低糖DMEM終止消化。200目篩網(wǎng)濾過，1500 r/min(離心半徑15 cm)離心10 min(水平離心半徑)，PBS洗2遍。用含10%FBS，100 U/ml青霉素，100 mg/L鏈霉素的低糖DMEM重懸，以2×104/cm2接種至6孔板中。

2.細胞表型流式細胞檢測：第5代hADSC胰酶消化后制成單細胞懸液。將細胞分裝于1.5 ml EP管中，每管 100 μl，細胞密度為 105/ml，加入熒光標記 抗 人 CD31-FITC、CD34-PE、CD45-PE、CD29-FITC、CD44-FITC、CD73-FITC、CD90-PE、CD105-PE、CD166-PE、HLA-DR-FITC、IgG2a-FITC、IgG1-PE作為同型陰性對照。4℃避光孵育30 min，流式細胞儀檢測。

3.體外誘導hADSC向脂肪細胞分化：取第3代hADSC，待細胞達80%融合后，改用成脂肪誘導培養(yǎng)基，含高糖 DMEM，10%FBS)，1 μmol/L 地塞米松，50 μmol/L 吲哚美辛，0.5 mmol/L IBMX，10 μmol/L胰島素。2周后油紅染色鑒定脂滴。

4.體外誘導hADSC向成骨細胞分化：取第3代hADSC，待細胞達80%融合后，改用成骨誘導培養(yǎng)基， 含高糖 DMEM，10%FBS，1 μmol/L 地塞米松，200 μmol/L 抗壞血酸，10 μmol/L β-甘油磷酸鈉。4周后行茜素紅S染色鑒定鈣結節(jié)。

5.L-Wnt3a細胞培養(yǎng)上清收集：L-Wnt3a細胞購自美國ATCC公司，使用含10%FBS的HDMEM培養(yǎng)。以1∶10進行傳代，接種至75 cm2培養(yǎng)瓶，每瓶含10 ml完全生長培養(yǎng)基，培養(yǎng)4 d細胞基本融合后，收集上清并無菌過濾，做為第一批上清。重新注入10 ml新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)3 d后收集上清并無菌過濾，此為第二批上清。按1∶1混合上述兩批上清，即為Wnt-3a條件培養(yǎng)基(L-Wnt3aconditioned medium，L-Wnt3a-CM)。4℃避光保存，其內(nèi)所含的Wnt3a蛋白，將被作為誘導因子添加到培養(yǎng)基中。

6.黑素細胞培養(yǎng)上清收集：人表皮黑素細胞購于美國ScienCell公司。取第5代人黑素細胞以5×103/ml密度接種于6孔板。待細胞生長穩(wěn)定后，予低劑量NB-UVB照射(強度0.5 J/cm2，時間30 s)，24 h后收集上清，即為黑素細胞條件培養(yǎng)基。過濾除菌，4℃避光保存。作為hADSC分化為黑素細胞的母液備用。

7.hADSC向黑素細胞誘導分化：取第5代hADSC，以5×104/ml密度接種于24孔板，用含10%FBS的L-DMEM培養(yǎng)至細胞80%融合后，更換為黑素細胞誘導培養(yǎng)基[5-6]，隔天換液，細胞達80%～90%融合時進行傳代。至第6周予NB-UVB照射，0.5 J/cm2，每周 1 次，時間 30 s[7]，繼續(xù)培養(yǎng)至第10周進行相關檢測。未誘導組設為正常對照組。

8.實時熒光定量PCR檢測誘導各時間組黑素細胞相關基因mRNA的表達：Trizol法提取誘導不同時間組細胞總RNA。紫外分光光度計檢測RNA濃度及純度。cDNA的合成操作嚴格按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。擴增基因引物序列見表1。擴增條件為：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，循環(huán) 40次。以β肌動蛋白為內(nèi)參照，結果用2-ΔCt法換算(ΔCt=Ct目的基因-Ct內(nèi)參基因)。

9.細胞免疫化學法鑒定細胞：4%多聚甲醛室溫固定20 min，3%過氧化氫去離子水室溫孵育10 min。TritonX-100 通透 20 min。室溫封閉 20 min，分別滴加一抗兔抗人MITF、鼠抗人HMB45蛋白單克隆抗體，4℃過夜，PBS洗滌3遍。分別滴加二抗山羊抗兔IgG及山羊抗小鼠IgG，室溫孵育30 min。DAB顯色，蒸餾水適時終止，蘇木素復染，脫水、透明、封片。

10.細胞免疫熒光法鑒定細胞：4%多聚甲醛室溫固定20 min，Triton-100室溫通透10 min，室溫封閉20 min，分別滴加一抗鼠抗人TYRP1、鼠抗人S100共同室溫避光孵育45 min，PBS洗滌3遍，分別滴加FITC標記的山羊抗小鼠IgG，室溫孵育15 min，DAPI室溫染10 min，熒光顯微鏡觀察，拍照。

表1 擴增基因引物序列

結 果

一、hADSC分離培養(yǎng)結果

原代hADSC接種后，48 h大部分已貼壁，換液去除非貼壁細胞；72 h后可見細胞形態(tài)改變，細胞生長有極性，融合后呈旋渦狀、河流狀。12代以內(nèi)細胞的形態(tài)無明顯變化。

二、細胞表面標志檢測

CD29 和 CD105，CD44 和 CD166，CD73 和 CD90均雙陽性表達，陽性率均在95%以上。造血系統(tǒng)、白細胞、內(nèi)皮標志物及組織相容性復合物CD31和CD34，CD45和HLA-DR低表達或陰性表達。

三、hADSC誘導分化潛能檢測結果

hADSC經(jīng)成脂誘導2周后，油紅O染色見脂滴呈紅色(圖1a)，正常對照組陰性(圖1b)。hADSC經(jīng)成骨誘導28 d后茜素紅S染色見鈣結節(jié)呈桔紅色，即茜素紅染色陽性(圖1c)，正常對照組陰性(圖1d)。

四、實時熒光定量PCR檢測結果

誘導不同時間各組間小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子(MITF)、酪氨酸激酶受體c-kit(KIT)、多巴色素異構酶(DCT)、酪氨酸酶(TYR)、酪氨酸酶相關蛋白1(TYRP1)、性別決定區(qū)域相關轉(zhuǎn)錄因子(SOX10)mRNA的表達行單因素方差分析發(fā)現(xiàn)，差異具有統(tǒng)計學意義(F=205.99，220.02，138.31，71.68，114.90，295.85，P＜0.05)。 再用 LSD-t檢驗發(fā)現(xiàn)，與誘 導 0 周 組 比 較 ，MITF、KIT、DCT、TYR、TYRP1、SOX10 mRNA 表達量分別自誘導第 5、7、6、4、5、3周開始增加(均P＜0.05)。

五、免疫細胞化學染色結果

光鏡下可見誘導組細胞形態(tài)呈雙極化及多極化，與黑素細胞典型樹突結構相似，抗體MITF及HMB45染色均見到誘導組細胞胞體及樹突被染成棕褐色，呈陽性(圖2a，2b)。正常對照組hADSC細胞形態(tài)為長梭形，與誘導組細胞形態(tài)有明顯差異，其中抗體MITF染色呈弱陽性，抗體HMB45染色呈陰性(圖 2c，2d)。

六、細胞免疫熒光結果

熒光顯微鏡觀察示帶有FITC 熒光標記的抗體TYRP1、S100在誘導后細胞胞質(zhì)中均顯示綠色熒光，呈陽性表達，細胞核由DAPI標記，呈藍色(圖3a，3b)，對照組陰性表達。

圖1 成脂成骨染色結果(×200) 1a：成脂誘導組，油紅O染色見細胞內(nèi)脂滴呈紅色；1b：成脂正常對照組，油紅O染色未見脂滴形成；1c：成骨誘導組，茜素紅S染色見鈣結節(jié)呈桔紅色；1d：成骨正常對照組，茜素紅S染色未見鈣結節(jié)形成

圖2 細胞免疫化學小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子抗體及人黑素瘤抗體染色結果(×100) 2a：誘導組小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子抗體表達陽性，胞體和樹突呈棕褐色；2b：誘導組人黑素瘤抗體表達陽性，胞體和樹突呈棕褐色；2c：正常對照組小眼畸形轉(zhuǎn)錄因子抗體表達弱陽性，胞體可見部分棕色顆粒；2d：正常對照組人黑素瘤抗體表達陰性

討 論

我們對傳統(tǒng)方法稍加改進獲得hADSC。細胞表型檢測發(fā)現(xiàn) hADSC 高表達 CD29，CD44，CD73，CD90，CD105，CD166，低表達 CD31、CD34 及 CD45。和骨髓間充質(zhì)干細胞一樣，hADSC低表達Ⅱ類抗原，僅有0.05%表達HLA-DR，與Kicic等[8]的報道一致。有研究報道，同種異體hADSC移植不會引起免疫反應，為hADSC移植奠定了基礎[9]。

黑素細胞的發(fā)育分化過程復雜，機制至今尚未完全明確。研究顯示，在人胚胎干細胞、人毛發(fā)濾泡起源的神經(jīng)嵴干細胞向黑素細胞分化過程中，SCF、bFGF、EDN3是必需的[7]。bFGF是成纖維細胞的一種有絲分裂原，主要作用在來源于中胚層和神經(jīng)外胚層的組織細胞，它能顯著提高黑素細胞的遷移能力和p125FAK在黑素細胞中的表達[10]。EDN3是促使神經(jīng)嵴細胞向成熟黑素細胞分化的關鍵因子[11]。

圖3 酪氨酸酶相關蛋白1、S100蛋白在誘導后細胞中的表達情況(×200) 3a：酪氨酸酶相關蛋白1在胞質(zhì)中呈綠色熒光；3b：S100蛋白在胞質(zhì)中呈綠色熒光

為了建立一個更好的誘導微環(huán)境，我們改進了體外誘導方法：對生長穩(wěn)定的人黑素細胞進行窄譜中波紫外線(NB-UVB)照射，受到照射的細胞會應激產(chǎn)生一些生長因子，分泌于培養(yǎng)液中，我們收集上清液作為母液，在此基礎上添加上述誘導因子進行誘導。本次研究中，通過在體外模擬誘導微環(huán)境，初步建立由hADSC向黑素細胞分化的體系。誘導分化至第10周，細胞形態(tài)已趨近黑素細胞的典型樹突形態(tài)，著色加深，黑素細胞標志物如MITF、KIT、DCT、TYR、TYRP1、SOX10 均有穩(wěn)定表達，細胞免疫化學及免疫熒光結果均顯示，所誘導細胞表達黑素細胞相關蛋白。

MITF是在色素細胞發(fā)育早期出現(xiàn)的一個標志，它是神經(jīng)嵴細胞定向分化發(fā)育成黑素細胞過程中最早發(fā)生的標志之一。MITF介導多種信號級聯(lián)過程，在色素細胞發(fā)育、分化和功能調(diào)節(jié)中起作用。MITF通過激活色素相關基因TYR、DCT來調(diào)節(jié)黑素細胞發(fā)生發(fā)展，同時通過上調(diào)抗凋亡基因如Bcl-2和BCL-XL來維持黑素細胞存活[12]。通過構建誘導微環(huán)境，將hADSC誘導分化為具有一定黑素細胞生物學特性的目的細胞。這為進一步體內(nèi)實驗和色素脫失性疾病的治療奠定了基礎。然而，我們所建立的黑素誘導分化體系包含不同影響因素，其中的必需與非必需影響因子有待進一步論證。同時，本實驗誘導周期長，細胞活性的維持以及相關腫瘤指標的監(jiān)測顯得十分必要，由此引出了另一個亟需解決的問題——如何更高效率地體外誘導黑素細胞，值得更加深入的研究。

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2013-01-04)

(本文編輯：尚淑賢)

In vitroinduction of differentiation of human adipose-derived mesenchymal stem cells into melanocytes：an experimental study

Min Min*，Zhang Xuejing，Ma Hong，Xu Hui，Li Yumei.*Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang 212000，Jiangsu，China

Li Yumei，Email:l.yumei@aliyun.com

ObjectiveTo establish a method for inducing human adipose-derived mesenchymal stem cells(hADSCs)to differentiate into melanocytesin vitro.MethodshADSCs were isolated from human subcutaneous fat tissue，and subjected to phenotypic analysis by flow cytometry.The differentiation potential of the hADSCs was evaluated by induction of osteogenic and adipogenic differentiation.Then，the fifth passage hADSCs were induced to differentiate into melanocytes by conditioned medium containing stem cell factor(SCF)，endothelin 3，basic fibroblast growth factor(bFGF)for ten weeks.Those hADSCs receiving no induction treatment served as the normal control.Subsequently，real-time fluorescence-based quantitative PCR(RT-PCR)was performed to determine the mRNA expressions of melanin-associated genes including microophthalmia-associated transcription factor(MITF)，ckit receptor tyrosine kinase(KIT)，dopachrome tautomerase(DCT)，tyrosinase，tyrosinase-related protein-1(TYRP1)，and sex determining region Y-box 10 (SOX10).Statistical analysis was done by one-factor analysis of variance and the least significant difference(LSD)test.Further more，the hADSC-derived melanocytes were identified by immunocytochemistry and immunofluorescence assay.ResultsAs flow cytometry revealed，the isolated hADSCs showed high expressions of CD29，CD44，CD73，CD90，CD105 and CD166 with the positivity rates being more than 95%，but low or absent expressions of CD31，CD34，CD45 and human leukocyte antigen(HLA)-DR.Additionally，the osteogenic and adipogenic differentiation of hADSCs was successfully induced.The relative mRNA expression levels of MITF，KIT，DCT，tyrosinase，TYRP1 and SOX10 were 0.325±0.012，0.042±0.006，0.046±0.013，0.036±0.005，0.041±0.003，and 0.225±0.014 respectively in hADSCs induced for 10 weeks，which were significantly upregulated compared with the normal control hADSCs(allP＜0.05).Moreover，the induced hADSCs showed positive immunocytochemical staining for MITF and HMB45，as well as positive cytoimmunofluorescence staining for TYRP1 and S100.ConclusionThe hADSCs have been successfully induced to differentiate into cells with the biological characteristics of melanocytes.

Human adipose-derived mesenchymal stem cells；Cell differentiation；Melanocytes

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.002

國家自然科學基金(30972663)；中華醫(yī)學會皮膚性病學分會-安斯泰來皮膚病學研究基金

212000江蘇鎮(zhèn)江，江蘇大學附屬醫(yī)院皮膚科(閔敏、馬紅、許輝、李遇梅)；鎮(zhèn)江市第二人民醫(yī)院(張雪靜)

李遇梅，Email：l.yumei@aliyun.com