倪春雅 高露娟 陳連軍 竇俠

塵螨變應原rDer p1誘導HaCaT細胞表達胸腺基質(zhì)淋巴生成素的研究

倪春雅 高露娟 陳連軍 竇俠

目的探討塵螨變應原rDer p1在體外對角質(zhì)形成細胞表達胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)的影響。方法體外培養(yǎng)人角質(zhì)形成細胞株HaCaT細胞，予以0.1、1和10 mg/L塵螨變應原rDer p1與蛋白酶活化受體2(PAR2)特異性激動劑SLGIKV(500 μmol/L)和拮抗劑VKGILS(500 μmol/L)共培養(yǎng)，以無血清培養(yǎng)基為空白對照。用ELISA法和熒光定量PCR法檢測各實驗組和對照組TSLP蛋白及mRNA表達水平；通過激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內(nèi)鈣流變化分析rDer p1誘導HaCaT細胞產(chǎn)生TSLP和PAR2受體活化的關(guān)系。結(jié)果1 mg/L和10 mg/L rDer p1組培養(yǎng)12 h上清中TSLP水平分別為(155.5±5.9)ng/L和(228.8±28.7)ng/L，顯著高于空白對照組(54.3±13.9 ng/L，P＜0.01)，TSLP表達水平隨rDer p1濃度增加而升高。SLGIKV組TSLP表達[(166.2±8.8)ng/L]也顯著高于空白對照組(P＜0.01)。10 mg/L rDer p1組和SLGIKV組TSLP mRNA相對表達量在8 h最高，分別為(3.28±0.27)倍和(2.15±0.26)倍，與4 h和24 h相比差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。SLGIKV可引起HaCaT細胞鈣內(nèi)流增加；10 mg/L rDer p1也可引起HaCaT細胞鈣內(nèi)流增加，經(jīng)過PAR2受體特異性阻斷劑VKGILS(500 μmol/L)處理后再給予rDer p1刺激，細胞內(nèi)鈣內(nèi)流峰值明顯降低。結(jié)論塵螨變應原rDer p1能夠通過部分活化HaCaT細胞表面的PAR2受體誘導產(chǎn)生促炎細胞因子TSLP。

皮炎，特應性；屋塵螨；角蛋白細胞；胸腺基質(zhì)淋巴生成素

特應性皮炎(atopic dermatitis，AD)是一種慢性炎癥性皮膚病。研究已證實大分子蛋白類過敏原能夠誘發(fā)AD患者皮損復發(fā)或加重[1]，其中室內(nèi)過敏原塵螨是最常檢出的過敏原。AD患者進行塵螨變應原斑貼試驗可誘發(fā)出濕疹樣皮損，進一步免疫組化研究提示，塵螨變應原能夠通過結(jié)合表皮內(nèi)特異性IgE介導Th2細胞活化，可能是其誘發(fā)AD皮炎加重的主要機制之一[2]。近年研究發(fā)現(xiàn)，上皮/表皮來源的促炎細胞因子胸腺基質(zhì)淋巴生成素(thymic stromal lymphopoietin，TSLP) 在促進Th2細胞分化并啟動過敏性炎癥反應中具有關(guān)鍵作用[3]。在AD患者皮損中可觀察到TSLP表達明顯上調(diào)，而AD患者非皮損處皮膚則幾乎不表達TSLP，提示TSLP和AD患者炎癥反應的調(diào)節(jié)有關(guān)[4]。本研究探討塵螨變應原是否能夠通過直接活化角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生T SLP從而誘發(fā)皮炎。

材料與方法

一、材料

1.主要材料：人角質(zhì)形成細胞系HaCaT細胞來自武漢大學中國典型培養(yǎng)物保藏中心，DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司，胎牛血清、Trizol、Fluo-4 NW鈣檢測試劑盒購于美國Invitrogen公司，屋塵螨變應原rDerp1購于美國Abcam公司，蛋白酶激活受體2購于PAR2特異性激動劑SLIGKV和拮抗劑VKGILS購于美國Tcoris公司，TSLP ELISA試劑盒購于美國RD公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購于日本Takara公司，TSLP Taqman?探針(Hs00263639_m1)和GAPDH Taqman?探針(Hs99999905_m1)購于美國ABI公司。

2.儀器：CO2細胞培養(yǎng)箱購于美國Thermo Scientific公司，超凈工作臺購于日本Airtech公司，ABI PRISM?7500熒光定量PCR購于美國ABI公司，Leica TCS SP5激光共聚焦顯微鏡購于德國Leica公司，ELX800酶標儀購于德國Biokit公司。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)及處理：HaCaT細胞在37℃、5%CO2條件下用含10%胎牛血清和雙抗(青霉素和鏈霉素)的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，以每孔105個細胞接種于無菌有蓋24孔板。細胞生長達70%融合時給予無血清DMEM培養(yǎng)基同步化24 h，然后加入相應抗原共培養(yǎng)，以無血清培養(yǎng)基為空白對照。rDer p1共培養(yǎng)終濃度分別為 0.1、1、10 mg/L；PAR2受體激動劑SLIGKV終濃度為500 μmol/L。分別在培養(yǎng)12 h和24 h收集培養(yǎng)上清用于TSLP蛋白水平檢測；分別在培養(yǎng)4、8、24 h收集細胞用于提取RNA進行TSLP mRNA表達水平定量。實驗重復3次。

2.ELISA法測定培養(yǎng)上清TSLP水平：按照人TSLP ELISA檢測試劑盒說明書操作。簡述如下：稀釋標準品，按復孔加樣(濃度梯度的標準品、空白對照和待測上清)、生物素標記二抗和酶標試劑，37℃孵育60 min，重復洗滌5次，拍干后加入顯色劑37℃避光顯色10 min，加入終止液，酶標儀450 nm波長依序測量各孔的吸光度(A值)。根據(jù)標準品的濃度及對應A值計算出標準曲線的直線回歸方程，再根據(jù)樣品的A值在回歸方程上計算出對應樣品的濃度。重復實驗至少3次。

3.熒光實時定量PCR測定TSLP表達：Trizol法提取各組細胞總RNA，分光光度儀測定A260/A280比值判斷RNA純度并定量。依據(jù)Takara?逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用MGBTaqman?探針法在ABI PRISM?7500熒光定量PCR儀上進行實時定量PCR檢測，并比較不同時間和不同濃度塵螨變應原刺激組TSLP(TSLP Taqman?探針：Hs00263639_m1；ABI) 表達水平， 以 GAPDH(GAPDH Taqman?探針：Hs99999905_m1；ABI)為內(nèi)參進行相對定量，PCR反應體系如下：Taqman?Gene Expression Master Mix 12.5 μl， 目 的 基 因Taqman?探針引物 Mix 1.25 μl，cDNA 1.25 μl，H2O補足至 25 μl。反應條件為 95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60℃1 min，40個循環(huán)。重復實驗至少3次。

4.激光共聚焦顯微鏡檢測活細胞鈣離子內(nèi)流：用Fluo-4 NW鈣檢測試劑盒檢測鈣內(nèi)流。培養(yǎng)HaCaT細胞于Lab-Tek?腔室玻片系統(tǒng)，生長融合達50%時，無血清培養(yǎng)基同步化24 h。棄去培養(yǎng)基，用Fluo-4試劑盒中不含Ca2+的緩沖液洗2遍；每孔加入1 ml含F(xiàn)luo-4的染液，避光，依次37℃孵育30 min，室溫孵育30 min。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，選擇488 nm氬激光為激發(fā)波長，設(shè)定各項參數(shù)，記錄背景熒光；分別加入用緩沖液新鮮配制終濃度 10 mg/L的 rDer p1、 終濃度 500 μmol/L SLIGKV和空白緩沖液以及500 μmol/L VKGILS預處理30 min后再加入10 mg/L rDer p1，激光掃描共聚焦顯微鏡下動態(tài)掃描細胞內(nèi)熒光強度變化，每3秒掃描記錄1次，連續(xù)測量90 s。LAS AF Lite-2.2.1分析軟件記錄和分析細胞的熒光強度圖像及曲線。

結(jié) 果

一、rDer p1誘導HaCaT細胞表達TSLP

各濃度塵螨變應原rDer p1與HaCaT細胞共培養(yǎng)12 h，上清液中TSLP表達高于空白對照組，并且隨rDer p1濃度增加TSLP水平顯著升高(表1)，以rDer p1 10 mg/L組最高(P＜0.01)；SLIGKV刺激組TSLP水平也高于空白對照組(P＜0.01)。延長塵螨變應原rDer p1共培養(yǎng)時間至24 h，TSLP表達與12 h的表達水平差異無統(tǒng)計學意義(表1)。實時定量PCR結(jié)果顯示，10 mg/L rDer p1和SLIGKV與HaCaT細胞共培養(yǎng)，TSLP mRNA相對表達量都在8 h最高，顯著高于4 h和24 h(P＜0.01)，見表2。

表1 HaCaT細胞與屋塵螨變應原rDer p1及蛋白酶激活受體2特異性激動劑SLIGKV共培養(yǎng)上清中胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)表達水平(±s)

表1 HaCaT細胞與屋塵螨變應原rDer p1及蛋白酶激活受體2特異性激動劑SLIGKV共培養(yǎng)上清中胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)表達水平(±s)

注：a：各刺激組與空白對照比較t檢驗，自由度為6

組別 12 h 24 h TSLP(ng/L) t值aP值 TSLP(ng/L) t值aP值空白對照組 54.3±13.9 - - 80.4±28.7 - -SLIGKV組 166.2±8.8 11.23＜0.01 135.2±33.8 2.47＜0.05 0.1 mg/L rDer p1組 59.4±15.4 0.44 ＞0.05 50.6±4.4 2.05 ＞0.05 1 mg/L rDer p1組 155.5±5.9 10.76＜0.01 142.2±26.0 3.19＜0.05 10 mg/L rDer p1組 228.8±28.7 10.31＜0.01 252.2±9.6 11.35＜0.01

表2 HaCaT細胞與屋塵螨變應原rDer p1及蛋白酶激活受體2特異性激動劑SLIGKV共培養(yǎng)不同時間胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)mRNA相對表達量(±s)

表2 HaCaT細胞與屋塵螨變應原rDer p1及蛋白酶激活受體2特異性激動劑SLIGKV共培養(yǎng)不同時間胸腺基質(zhì)淋巴生成素(TSLP)mRNA相對表達量(±s)

注：各組不同刺激時間之間的比較采用單因素方差分析，自由度為2

組別 4 h 8 h 24 h F值 P值SLIGKV組 0.69±0.21 2.15±0.26 0.50±0.16 52.30＜0.01 1 mg/L rDer p1組 0.69±0.22 1.15±0.07 0.78±0.39 2.59 ＞0.05 10 mg/L rDer p1組 0.58±0.08 3.28±0.27 1.48±0.44 60.60＜0.01

二、rDer p1部分活化HaCaT細胞表面蛋白酶活化受體2產(chǎn)生鈣離子內(nèi)流

HaCaT細胞與10 mg/L rDer p1共培養(yǎng)，應用鈣離子熒光指示劑在激光共聚焦顯微鏡下觀察，可觀察到細胞內(nèi)鈣離子升高，出現(xiàn)鈣內(nèi)流增加，達峰時間約為20～25 s；SLIGVK也可引起細胞內(nèi)鈣離子內(nèi)流，達峰時間約為15～20 s，并且峰值平均吸光度高于Der p1組；HaCaT細胞經(jīng)過VKGILS處理后再加入塵螨變應原rDer p1共培養(yǎng)，細胞內(nèi)鈣內(nèi)流峰值明顯降低(圖1，2)。

討 論

TSLP是一種IL-7樣細胞因子，F(xiàn)riend等[5]首次從小鼠胸腺基質(zhì)細胞中鑒定。近年來隨著人類TSLP及其受體(TSLPR)的成功克隆和測序，對其功能有了較全面的了解。TSLP是一種上皮源性細胞因子，呼吸道上皮細胞和表皮角質(zhì)形成細胞均可合成TSLP。研究發(fā)現(xiàn)，TSLP與呼吸道過敏性炎癥的發(fā)生密切相關(guān)：哮喘患者支氣管黏膜上皮、過敏性鼻炎/鼻息肉患者鼻黏膜上皮TSLP表達均顯著升高[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者皮損中TSLP表達也明顯上調(diào)，而AD患者非皮損處皮膚則幾乎不表達TSLP[4]；表皮高表達TSLP的轉(zhuǎn)基因小鼠皮膚呈現(xiàn)AD樣皮損表現(xiàn)，皮損中浸潤細胞以炎癥性Th2細胞為主并伴有外周血IgE顯著升高[3]。由此可知，在以Th2細胞為主的過敏性炎癥(包括AD、哮喘及過敏性鼻炎)中TSLP均顯著升高。

圖1 HaCaT細胞經(jīng)PAR2受體特異性激動劑SLIGKV、屋塵螨變應原rDer p1(10 mg/L)刺激后鈣內(nèi)流一過性升高(以測定細胞內(nèi)平均熒光吸光度值所示)，經(jīng)PAR2受體特異性阻斷劑VKGILS預處理后rDer p1引起鈣內(nèi)流明顯下降

圖2 HaCaT細胞經(jīng)PAR2受體特異性激動劑SLIGKV刺激后細胞內(nèi)熒光隨時間的變化，12 s時細胞內(nèi)開始出現(xiàn)明顯的綠色熒光，并持續(xù)至30 s

體外研究進一步證實，TSLP能夠促進CD11c+樹突細胞及皮膚內(nèi)朗格漢斯細胞成熟、活化，并合成促使Th2細胞遷移的趨化因子TARC和MDC；同時經(jīng)TSLP活化的樹突細胞及朗格漢斯細胞能夠啟動CD4+前體T細胞向Th2細胞分化，并產(chǎn)生與過敏性炎癥反應相關(guān)的細胞因子如白介素4、白介素5和白介素13等[4，8-9]。因此可以說TSLP是一個啟動Th2型過敏性炎癥反應的重要“開關(guān)”。

塵螨變應原rDer p1除了具有免疫原性(誘導機體產(chǎn)生IgE型抗體)外，還具有半胱氨酸蛋白酶活性。研究證實，半胱氨酸蛋白酶可以與PAR2結(jié)合產(chǎn)生活化信號，并可進一步動員細胞內(nèi)Ca2+介導細胞內(nèi)信號傳導[10]。PAR2受體在皮膚多種細胞，特別是角質(zhì)形成細胞表面表達，參與多種生理和病理過程，如，PAR2在調(diào)節(jié)表皮通透性屏障、參與皮炎和病理性瘙癢過程中均發(fā)揮作用[11]。體外研究發(fā)現(xiàn)，塵螨變應原Der p1能夠通過PAR2受體活化誘導支氣管上皮細胞產(chǎn)生促炎因子白介素6和白介素8[12]，塵螨來源的絲氨酸蛋白酶在體外也可通過PAR2受體活化誘導角質(zhì)形成細胞產(chǎn)生白介素8[13]。因此我們推測，具有半胱氨酸蛋白酶活性的rDer p1也可通過PAR2受體依賴的途徑活化角質(zhì)形成細胞。本研究以PAR2受體特異性激動劑SLIGKV與HaCaT細胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示，HaCaT細胞表面PAR2受體活化能夠產(chǎn)生TSLP，并顯著高于空白對照組。進一步通過激光共聚焦顯微鏡觀察HaCaT細胞鈣內(nèi)流的變化來反映PAR2受體的活化，發(fā)現(xiàn)PAR2受體特異性激動劑SLIGKV可引起HaCaT細胞顯著的鈣內(nèi)流，rDer p1也可引起HaCaT細胞中等程度的鈣內(nèi)流增加，如果HaCaT細胞給予PAR2受體特異性拮抗劑預處理以封閉受體，rDer p1引起的鈣內(nèi)流降低約50%。這一結(jié)果提示，塵螨變應原rDer p1能夠部分通過結(jié)合并激活角質(zhì)形成細胞表面PAR2受體產(chǎn)生TSLP。本研究通過體外研究證實，塵螨變應原rDer p1能夠部分與HaCaT細胞表面PAR2受體結(jié)合，產(chǎn)生活化信號，從而誘導HaCaT細胞產(chǎn)生具有調(diào)節(jié)Th2分化的促炎因子TSLP。

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2013-04-02)

(本文編輯：顏艷)

Effect of the house dust mite allergen rDer p1 on the production of thymic stromal lymphopoietin by human keratinocytes

Ni Chunya，Gao Lujuan，Chen Lianjun，Dou Xia.Department of Dermatology，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China

Dou Xia，Email:douxia@medmail.com.cn

ObjectiveTo evaluate thein vitroeffect of the house dust mite allergen rDer p1 on the production of thymic stromal lymphopoietin(TSLP)by human keratinocytes.MethodsHuman HaCaT keratinocytes were cultured in the presence of different concentrations(0.1，1 and 10 mg/L)of rDer p1，SLGIKV(a specific agonist of protease-activated receptor-2，500 μmol/L)and VKGILS(a specific antagonist of protease-activated receptor-2，500 μmol/L)alone or in combination for different durations.Subsequently，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)and fluorescence-based quantitative PCR were performed to detect the expression levels of TSLP protein in the culture supernatant of and TSLP mRNA in these cells respectively，confocal laser scanning microscopy was used to visualize intracellular calcium influx which reflected the activation of protease-activated receptor-2(PAR2).Those HaCaT cells cultured in serum-free medium served as the blank control group.Statistical analysis was done byttest and one-way analysis of variance.ResultsThe level of TSLP protein was(155.5±5.9)ng/L，(228.8±28.7)ng/L，and(166.2±8.8)ng/L in the culture supernatant of keratinocytes after 12-hour treatment with rDer p1 of 1 mg/L and 10 mg/L as well as SLGIKV respectively，significantly higher than that in the blank control group((54.3±13.9)ng/L，allP＜0.01).The TSLP mRNA expression in keratinocytes peaked at 8 hours after the stimulation with rDer p1 of 10 mg/L and SLGIKV separately，with the relative expression levels being(3.28±0.27)folds and(2.15±0.26)folds，respectively，which were significantly different from those at 4 and 24 hours(allP＜0.01).Both SLGIKV and rDer p1 of 10 mg/L promoted intracellular calcium influx in keratinocytes，while the pretreatment with VKGILS obviously inhibited the rDer p1-induced increase in intracellular calcium influx.ConclusionsThe house dust mite allergen rDer p1 may induce the production of the pro-inflammatory cytokine TSLP by human keratinocytes partly via activating PAR2 receptors.

Dermatitis，atopic；Dermatophagoides pteronyssinus；Keratinocytes；Thymic stromal lymphopoietin

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.003

國家自然科學基金(30901289)

200040上海，復旦大學附屬華山醫(yī)院皮膚科

竇俠，Email：douxia@medmail.com.cn