張舒娜，邵 財(cái)，張 浩，潘曉曦，馬 琳，曲正義，劉繼勇，張志東，王英平*

(1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春130112;2.康美新開河藥業(yè)有限公司，吉林集安134200)

種質(zhì)資源遺傳多樣性研究，是收集、保存、評價(jià)和利用資源的依據(jù)，是當(dāng)今種質(zhì)資源研究的熱點(diǎn)［1］。對于任何一個(gè)物種來說，其擁有的遺傳多樣性越豐富，對環(huán)境變化的適應(yīng)能力就越強(qiáng)。正如Meffe所說，一個(gè)群體中遺傳多樣性的下降意味著其適應(yīng)環(huán)境能力的下降。遺傳多樣性的丟失可能會(huì)導(dǎo)致有機(jī)體對環(huán)境變化的適應(yīng)能力降低，同時(shí)也使人類喪失了具有潛在應(yīng)用價(jià)值的信息和資源。通過檢測了解藥用植物的遺傳多樣性之后，洞悉植物的遺傳多樣性在居群內(nèi)與居群間的分布情況，有助于評估特定居群的保護(hù)價(jià)值［2］，及對藥用植物制定具體的保護(hù)措施。因此，藥用植物種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究對藥用植物保護(hù)及開發(fā)具有十分重要的意義。物質(zhì)的遺傳多樣性可以從形態(tài)、細(xì)胞、生理、DNA序列等不同方面來體現(xiàn)。形態(tài)性狀是指物種在生長發(fā)育過程中，表現(xiàn)出的可觀察到的形態(tài)特征、特性，如株高、莖粗等，其表現(xiàn)直觀，易于識別，無須借助精密儀器，人們對它的應(yīng)用遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于其他標(biāo)記。如利用形態(tài)學(xué)性狀葉長、葉寬對稀有種B homblei和廣布種B obovatum研究發(fā)現(xiàn)，廣布種的遺傳變異程度明顯大于稀有種。物種的野外調(diào)查收集主要是以形態(tài)特征為依據(jù)的，因此，以形態(tài)學(xué)為依據(jù)建立合理的取樣策略及其多樣性研究具有現(xiàn)實(shí)的意義。但是，藥用植物資源取樣策略在形態(tài)學(xué)方面的研究罕見報(bào)道。因此，本研究選取黃花敗醬(patrinia scabiosaefolia fisch)作為研究對象。黃花敗醬是敗醬草的正品之一，主產(chǎn)于遼寧、吉林、黑龍江、內(nèi)蒙古、河北、山東、江西、河南、湖南及云南。其性微寒，味苦、辛，歸肺、大腸、肝經(jīng)。具有清熱解毒、破瘀排膿的功效，主治腸癰、肺癰、痢疾、帶下、產(chǎn)后瘀滯腹痛、熱毒癰腫［3］?，F(xiàn)代研究證明其具有鎮(zhèn)靜、抗菌、抗病毒、抗腫瘤、保肝利膽等作用，臨床上用于治療流行性腮腺炎、鼻竇炎、慢性盆腔炎及闌尾膿腫和結(jié)腸炎等［4］。通過對2個(gè)黃花敗醬居群2個(gè)分類學(xué)形態(tài)性狀的多樣性分析，試圖建立黃花敗醬的野外調(diào)查、收集取樣策略。

1 材料與方法

1.1 材料 黃花敗醬由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所于2013年從吉林省磐石市采集，2個(gè)居群原采集地地形均為路邊，其具體的地理位置和生態(tài)環(huán)境見表1。在同一個(gè)居群內(nèi)采取混合取樣策略，至少采集50～100個(gè)單株，以盡量保證包含不同的基因型［5］。

表1 供試材料

1.2 方法

1.2.1 取樣梯度研究 以居群B2為代表，從中隨機(jī)抽取6、10、14、18、22、26、30 個(gè)單株組成7 個(gè)梯度抽樣群體，對各個(gè)抽樣群體進(jìn)行形態(tài)學(xué)性狀調(diào)查統(tǒng)計(jì)和遺傳多樣性分析［5］。對2個(gè)黃花敗醬居群每個(gè)居群隨機(jī)采取30個(gè)單株進(jìn)行形態(tài)學(xué)性狀遺傳多樣性分析。

1.2.2 形態(tài)學(xué)性狀觀測 每個(gè)居群以單株為單位，參考形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)，選取株高、莖粗2個(gè)數(shù)量性狀在成熟期調(diào)查。

1.2.3 統(tǒng)計(jì)分析 農(nóng)藝性狀數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法以單株為單位，統(tǒng)計(jì)農(nóng)藝性狀的最大值(max)、最小值(min)、平均值(mean)、標(biāo)準(zhǔn)差(σ)、變異系數(shù)(cv)均由Microsoft Excel軟件處理完成。9項(xiàng)農(nóng)藝性狀不同保存群體間差異性比較分析通過SAS軟件ANOVA程序完成。利用 Shannon-Weiner index(H')［6］衡量群體遺傳多樣性大小。具體方法如下:根據(jù)總體平均值(mean)和標(biāo)準(zhǔn)差(σ)，將數(shù)據(jù)劃分為10級，從第1級［;＜(-2σ)］到第10 級［;＞(+2σ)］，每0.5σ 為一級，計(jì)算每一級的相對頻率Pi;(即某一性狀第i級別內(nèi)材料份數(shù)占總份數(shù)的百分比)然后計(jì)算各個(gè)性狀在每個(gè)群體中的遺傳多樣性指數(shù)，計(jì)算公式為:

其中，Pi指某性狀第i級別內(nèi)材料份數(shù)占總份數(shù)的百分比，Ln為自然對數(shù)。

差異顯著性分析采用SAS軟件ANOVA程序完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同取樣梯度下遺傳多樣性指數(shù)比較 對居群B2的7個(gè)梯度抽樣群體的2個(gè)形態(tài)性狀進(jìn)行觀測并作遺傳多樣性分析，見表2。結(jié)果表明，不同取樣梯度下，各個(gè)性狀的遺傳多樣性指數(shù)均隨單株取樣數(shù)目的增加呈現(xiàn)增大趨勢，總體上來看，當(dāng)取樣數(shù)目達(dá)到22株時(shí)，平均遺傳多樣性指數(shù)最高，為2.007，見圖1。

表2 居群B2不同取樣梯度下2個(gè)形態(tài)性狀遺傳多樣性指數(shù)

圖1 居群B2在8個(gè)取樣梯度下2個(gè)形態(tài)性狀平均遺傳多樣性指數(shù)的變化

由表2可以看到，株高、莖粗2個(gè)性狀均在取樣量達(dá)到22株時(shí)遺傳多樣性指數(shù)最高。將2個(gè)形態(tài)性狀綜合看，見圖1。當(dāng)取樣量為6株時(shí)，2個(gè)形態(tài)性狀的平均遺傳多樣性指數(shù)最低，為1.561;當(dāng)取樣量由6株增至30株時(shí)，遺傳多樣性指數(shù)隨著取樣個(gè)數(shù)的增多呈增大趨勢，并且增幅速度很快;當(dāng)取樣量為22株時(shí)，平均遺傳多樣性指數(shù)最高，為2.007;當(dāng)取樣量高于22株時(shí)，平均遺傳多樣性指數(shù)不再增大，而是在1.953～2.005之間波動(dòng)。因此，在對黃花敗醬居群進(jìn)行野外考察、收集、保護(hù)及多樣性研究過程中，每個(gè)居群至少要隨機(jī)選取22個(gè)單株才能代表和反映一個(gè)居群的整體遺傳特性［5］。

2.2 遺傳多樣性分析

2.2.1 總遺傳多樣性分析 對2個(gè)黃花敗醬居群各30個(gè)單株2個(gè)形態(tài)性狀數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，見表3。結(jié)果表明，不同居群和各性狀均表現(xiàn)出豐富的遺傳多樣性和較高的遺傳變異。由表3可見，2個(gè)黃花敗醬居群總的遺傳多樣性指數(shù)(HT)為2.022，各居群平均遺傳多樣性指數(shù)(Hs)為1.950，占總遺傳多樣性指數(shù)的96.44%;而居群間遺傳多樣性指數(shù)為0.072，只占總遺傳多樣性指數(shù)的3.56%。因此，黃花敗醬的遺傳多樣性主要集中在居群內(nèi)。

表3 黃花敗醬各居群2個(gè)形態(tài)性狀的遺傳多樣性指數(shù)

2.2.2 居群間遺傳多樣性比較 各居群的遺傳多樣性分析結(jié)果表明，2個(gè)居群B1、B2的遺傳多樣性指數(shù)都很高，分別為1.961、1.940。其中居群B1遺傳多樣性指數(shù)最高，表明居群B1具有更大的遺傳變異。居群 B1、B2在莖粗上的遺傳多樣性指數(shù)2.012、1.990均高于株高的遺傳多樣性指數(shù)1.910、1.889，表明莖粗具有更大的遺傳變異。

2.2.3 居群內(nèi)個(gè)體間的遺傳多樣性分析 以單株為單位對2個(gè)黃花敗醬居群進(jìn)行形態(tài)性狀的調(diào)查統(tǒng)計(jì)，結(jié)果表明，居群內(nèi)個(gè)體間在兩個(gè)形態(tài)學(xué)性狀上均存在一定差異。在2個(gè)居群中，B1的遺傳多樣性表現(xiàn)最為豐富，該居群2個(gè)性狀株高、莖粗的遺傳多樣性指數(shù)分別為1.910、2.012，其中莖粗的遺傳多樣性指數(shù)是所有形態(tài)性狀中最高的，其平均值為5.09 mm，變異在3.07～8.61 mm之間，變異幅度達(dá)5.54 mm，變異系數(shù)達(dá)23.93%;大的變異幅度和高的變異系數(shù)說明，在居群B1內(nèi)不同的個(gè)體間存在差異，見表4。

表4 黃花敗醬居群2個(gè)形態(tài)性狀表現(xiàn)

2.2.4 2個(gè)形態(tài)性狀的遺傳多樣性比較 將2個(gè)居群全部個(gè)體的2個(gè)形態(tài)性狀的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，2個(gè)形態(tài)學(xué)性狀的遺傳變異均主要存在于居群內(nèi)個(gè)體間，不同形態(tài)性狀的遺傳多樣性表現(xiàn)不同。不同性狀的居群平均遺傳多樣性指數(shù)占該性狀總遺傳多樣性指數(shù)的比率(Hs/HT)在94.29% ～98.67%之間。莖粗的居群平均遺傳多樣性指數(shù)(2.001)占總遺傳多樣性指數(shù)(2.028)的比例達(dá)到了98.67%，是居群平均遺傳多樣性指數(shù)最高的。

3 結(jié)論

遺傳多樣性的取樣策略是指對一定地理分布范圍內(nèi)的生物個(gè)體取樣時(shí)，使樣本具有代表性和包含盡可能多的遺傳變異的最佳取樣方法，包括取樣數(shù)目(一個(gè)給定區(qū)域的居群數(shù)和一個(gè)居群的個(gè)體數(shù))以及取樣方式［7］。不同類型植物的取樣策略不同，在不同采樣方法對細(xì)距堇菜遺傳估測研究表明，每群體取30株時(shí)有較充分的代表性，小于20個(gè)個(gè)體的取樣可能引起遺傳多樣性估測出現(xiàn)大的偏差［8］。史冀偉等［5］對小麥族中間鵝觀草居群的形態(tài)多樣性分析表明，對于小麥族自花授粉植物野外調(diào)查、收集時(shí)，應(yīng)以居群為單位，而且每一居群至少應(yīng)調(diào)查、收集18個(gè)單株，才能代表居群的遺傳多樣性。Marshall等［9］認(rèn)為在不知道物種生物學(xué)特性和遺傳背景的情況下，對一個(gè)居群進(jìn)行資源保護(hù)的隨機(jī)取樣數(shù)目可以確定在30個(gè)左右。本文針對黃花敗醬居群2個(gè)形態(tài)性狀進(jìn)行了取樣策略研究，結(jié)果表明，不同取樣梯度下的遺傳多樣性指數(shù)隨單株取樣數(shù)目的增加呈現(xiàn)增大趨勢，當(dāng)取樣量為22株時(shí)，平均遺傳多樣性指數(shù)最高(2.007)，當(dāng)取樣量為22～30株時(shí)，平均遺傳多樣性指數(shù)在1.953～2.005之間波動(dòng)。因此，建議在進(jìn)行黃花敗醬居群形態(tài)學(xué)多樣性研究中，單個(gè)居群要至少保證22株作為分析單位。這為黃花敗醬物種以居群為單位的遺傳多樣性研究提供了取樣策略的依據(jù)。

黃花敗醬形態(tài)變異的豐富性，不僅體現(xiàn)在不同的居群間和不同的性狀上，還表現(xiàn)在居群內(nèi)個(gè)體間的差異上，不同個(gè)體間存在豐富的變異。比如株高變異在130.45～228.84 mm之間，變異幅度達(dá)98.39 mm。如此大的變異范圍，要求在野外調(diào)查、收集和研究以及種質(zhì)資源的利用中以居群為單位、以個(gè)體取樣是非常有必要的［10］。

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