張玉梅，王家曉

(廣西中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，南寧530023)

乳腺癌(breast cancer)是最常見的女性惡性腫瘤之一。多年來，乳腺癌發(fā)病率在發(fā)達國家一直占女性惡性腫瘤的首位。近年來中國的乳腺癌發(fā)病率在逐年上升且出現年輕化的趨勢。據統(tǒng)計，全球乳腺癌新發(fā)病例在過去30年間(1980年—2010年)逐年上升，年增長率達3.1%。2010年全世界乳腺癌患病人數更是高達164.3(142.1～178.2)萬人［1］。乳腺癌的發(fā)生發(fā)展是多基因參與、多階段的復雜過程，是細胞中多種基因表達改變累積的結果。在此過程中既有原癌基因的激活、抑癌基因的失活，也有細胞周期的調控和凋亡基因的改變以及細胞內調節(jié)環(huán)節(jié)的紊亂［2-3］。石榴皮是石榴科植物石榴的干燥果皮，性酸、味澀，具有澀腸、止血、殺蟲的功效。現代藥理學研究表明，石榴皮具有抗腫瘤、抗病毒、抗菌和抗氧化等作用，從其當中提取的鞣花酸具有很強的抗腫瘤活性［4］。本研究通過石榴皮鞣花酸對乳腺癌4T1細胞體外增殖和細胞凋亡的影響，并觀察其對乳腺癌4T1荷瘤小鼠的腫瘤抑制情況，以探討石榴皮鞣花酸可能的抗癌機制。

1 實驗材料與方法

1.1 主要儀器及試劑 純系BALB/C小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，購于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物部，小鼠4T1乳腺癌細胞株由廣西中醫(yī)藥大學免疫學實驗室惠贈。RPMI1640培養(yǎng)基，美國GIBCO公司生產。胎牛血清，美國HyClone公司生產。石榴皮鞣花酸購自上海譜振生物科技有限公司，純度為96%。SP試劑盒購自北京博奧森生物技術有限公司，CCK-8殺傷活性測定試劑盒購自Promega公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 小鼠4T1乳腺癌細胞以含10%胎牛血清的 RPMI1640在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液1次，0.25%胰酶消化傳代。取對數生長期細胞制備單細胞懸液進行不同的實驗。

1.3 CCK-8法檢測細胞增殖率

1.3.1 標準曲線制備 取處于指數增殖期的小鼠4T1乳腺癌細胞，按照不同的細胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后每孔加入10 μL的CCK-8，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，于酶標儀上450 nm比色測吸光度值，根據檢測結果繪制細胞增殖標準曲線，見圖1。

圖1 小鼠4T1乳腺癌細胞增殖標準曲線

1.3.2 細胞增殖抑制率檢測 取處于指數增殖期的腫瘤細胞按照5×104/mL接種于96孔培養(yǎng)板，設置對照組和實驗組，每個劑量和對照均設3復孔。實驗組加入不同濃度石榴皮鞣花酸(10、20、30 mg/mL)，設為高、中、低劑量組對照組設生理鹽水組和DDP組，分別加等量的生理鹽水和DDP，加藥共培養(yǎng)48 h后加入CCK-8，同上檢測細胞450 nm比色測吸光度值，細胞增殖抑制率=(1－實驗組OD值/陰性對照組)×100%。

1.4 細胞周期分析 取指數增殖期的小鼠4T1乳腺癌細胞種植于6孔板中，細胞種植密度為104/mL，每孔3 mL。設置對照組和實驗組，實驗組加入不同濃度石榴皮鞣花酸(10，20，30 mg/mL)，設為高、中、低濃度組，對照組加生理鹽水，共培養(yǎng)48 h后收集細胞，PBS洗2次，使用30%PBS乙醇重懸細胞沉淀，搖勻后向細胞懸液中加入5 mL的PI，閉光作用5 min后上機檢測細胞周期。

1.5 小鼠4T1乳腺癌荷瘤小鼠的建立 于6周齡BALB/C小鼠右側腋窩皮下接種小鼠4T1乳腺癌細胞0.1 mL(含5×105個小鼠4T1乳腺癌細胞)，12 d之后腫瘤直徑達0.5 cm大小時即成小鼠4T1乳腺癌荷瘤小鼠。

1.6 觀察石榴皮鞣花酸對乳腺癌荷瘤小鼠的保護作用將52只BALB/C乳腺癌荷瘤小鼠隨機分為4組，石榴皮鞣花酸高劑量組，石榴皮鞣花酸低劑量組，DDP組和生理鹽水組，每組13只。接種小鼠4T1乳腺癌細胞后第2天開始灌胃，連續(xù)灌胃給藥10 d，鞣花酸高劑量組每天1次灌注0.4 mL鞣花酸高濃度稀釋液(相當于鞣花酸30 mg/mL)，鞣花酸低劑量組每天1次灌注0.4mL鞣花酸低濃度稀釋液(相當于鞣花酸10 mg/mL)，DDP組每天1次灌注0.4 mL DDP稀釋液(相當于DDP 5 mg/mL)，生理鹽水組每天1次灌注0.4 mL生理鹽水。連續(xù)喂養(yǎng)3周。另外以13只正常小鼠每天1次灌注0.4 mL生理鹽水作為對照組。

1.7 胸腺系數、脾系數測定 上述各組小鼠在連續(xù)喂養(yǎng)3周后處死，處死前稱量小鼠質量，處死后先無菌取出小鼠胸腺和脾臟，并分別稱重。胸腺系數=(胸腺質量/小鼠質量)×100%。脾系數=(脾質量/小鼠質量)×100%。

1.8 抑瘤率及瘤體survivin表達情況 上述各組荷瘤小鼠在連續(xù)喂養(yǎng)3周后處死，取出荷瘤小鼠瘤體，分別稱重，各組荷瘤小鼠抑瘤率的計算參照文獻［5］進行。將所取瘤體組織的石蠟切片采用免疫組織化學SP法進行染色。Survivin結果判定標準參照Bames等［6］提出的基于3個參數的半定量計數方法判定。

1.9 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以均數±標準差(珋±s)表示，多組均數比較采用方差分析，等級資料比較采用秩和檢驗，計數資料比較采用χ2檢驗，兩兩比較采用Nemenyi法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 實驗結果

2.1 石榴皮鞣花酸對小鼠4T1乳腺癌細胞增殖的影響 石榴皮鞣花酸對小鼠4T1乳腺癌細胞具有明顯的增殖抑制作用。不同濃度的鞣花酸組對小鼠4T1乳腺癌細胞抑制增殖作用的時間曲線基本相同，都是在共培養(yǎng)48 h最明顯。鞣花酸中劑量組與高劑量組的抑制增殖作用比低劑量組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。但中劑量組與高劑量組的鞣花酸差異無統(tǒng)計學意義，提示鞣花酸對小鼠4T1乳腺癌細胞的增殖可能有飽合抑制作用。結果詳見表1。

2.2 石榴皮鞣花酸對小鼠4T1乳腺癌細胞的誘導凋亡作用 流式細胞儀細胞凋亡計數結果顯示，不同濃度石榴皮鞣花酸在一定時間范圍內，誘導腫瘤細胞凋亡的作用隨藥物濃度及作用時間的增加而增強，但當鞣花酸到達一定濃度(20 mg/mL)后凋亡誘導作用逐漸趨向穩(wěn)定，見圖2。

表1 石榴皮鞣花酸對小鼠4T1乳腺癌細胞的抑制作用(珋±s，n=13)

表1 石榴皮鞣花酸對小鼠4T1乳腺癌細胞的抑制作用(珋±s，n=13)

注:各組分別與對照組分別比較，#P＜0.05;與鞣花酸10 mg/mL組分別比較，▲P＜0.05

組別 質量濃度/(mg/mL)4T1乳腺癌細胞(OD值)抑制率/%對照組 0.367±0.251 31.3 DDP組 15 0.175±0.021 52.3石榴皮組 10 0.313±0.017# 14.7石榴皮組 20 0.259±0.015#▲ 29.4石榴皮組 30 0.252±0.016#▲

圖2 不同藥物濃度細胞凋亡情況

2.3 細胞周期分析 不同濃度鞣花酸與小鼠4T1乳腺癌細胞共培養(yǎng)后，細胞周期分布發(fā)生了明顯變化，G1期的細胞均增加明顯，G2/M期的細胞出現減少，并且可見到較明顯的凋亡峰形成。各濃度組G1期細胞與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);鞣花酸3個濃度組中，低劑量組分別與中劑量組和高劑量組進行比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，但中劑量組與高劑量組進行比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。結果詳見表2。

表2 石榴皮鞣花酸作用后小鼠4T1乳腺癌細胞周期分布比較(珋±s，n=13)

表2 石榴皮鞣花酸作用后小鼠4T1乳腺癌細胞周期分布比較(珋±s，n=13)

注:不同濃度石榴皮組與對照組比較，▲P＜0.05;10 mg/mL組與其余2個濃度組比較，△P＜0.05

組 別 質量濃度/(mg/mL)G1期 S期 G2/M期23.21±4.21 34.29±3.77鞣花酸 10 47.43±1.67▲ 33.31±2.79 15.02±1.67鞣花酸 20 55.61±1.63▲△ 16.91±3.53 27.52±3.31鞣花酸 30 57.02±1.92▲△對照組 35.40±1.43 17.85±5.25 23.46±4.53

2.4 石榴皮鞣花酸對荷瘤小鼠的保護作用 鞣花酸低劑量組(鞣花酸10 mg/mL)和高劑量組(鞣花酸30 mg/mL)可抑制小鼠4T1乳腺癌細胞的生長，抑瘤率分別為21.3%和27.8%，均低于DDP組的71%。4組瘤體質量、胸腺系數、脾系數比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。鞣花酸低劑量組、鞣花酸高劑量組瘤體質量小于生理鹽水組(P＜0.05)，但大于DDP組(P＜0.01)。鞣花酸低劑量組、高劑量組胸腺系數、脾系數分別與生理鹽水組比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，提示石榴皮對小鼠4T1乳腺癌細胞有一定的抑制作用，同時可防止胸腺和脾萎縮。DDP組胸腺系數、脾系數均低于生理鹽水組(P＜0.05)，提示DDP組胸腺和脾萎縮明顯，見表3。

表3 石榴皮鞣花酸對4T1乳腺癌BALB/C荷瘤小鼠的抑瘤作用(珋±s，n=13)

表3 石榴皮鞣花酸對4T1乳腺癌BALB/C荷瘤小鼠的抑瘤作用(珋±s，n=13)

注:與生理鹽水組比較，#P＜0.05

組 別 瘤體質量/g 胸腺系數/(g/10 g)脾系數/(g/10 g)生理鹽水組 1.69±0.34 0.010±0.003 0.064±0.016 DDP組 0.49±0.14# 0.006±0.002# 0.021±0.005#鞣花酸低劑量組 1.33±0.35# 0.011±0.002 0.065±0.013鞣花酸高劑量組 1.22±0.54# 0.009±0.003 0.063±0.014

2.5 各組瘤體survivin的表達情況 各組survivin的表達情況比較，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。DDP組、鞣花酸低劑量組、高劑量組survivin陽性率均低于生理鹽水組(P＜0.05)，但DDP組、鞣花酸低劑量組和高劑量組荷瘤小鼠瘤體survivin陽性率比較，差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)，見表4。

表4 各組荷瘤小鼠瘤體survivin的表達情況(n=13)

3 討論

惡性腫瘤是全世界較為常見的疾病，其發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，惡性腫瘤共同的生物學特征為失控性生長，其主要的分子機制可能由于多步驟、多階段、多基因參與使細胞增殖和分化失控從而引起細胞惡性轉化，導致腫瘤的發(fā)生［7-8］。因此抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞分化及凋亡已成為腫瘤治療的重要手段之一［9-10］。Survivin在胚胎時期廣泛分布于不同組織，在人類分化成熟的組織中一般不表達或低表達。Survivin表達則凋亡過程受阻導致細胞異常增殖［11］。在本研究中，石榴皮鞣花酸對乳腺癌4T1細胞具有明顯的增殖抑制作用，4T1細胞與石榴皮鞣花酸共培養(yǎng)后，4T1細胞生長明顯受到抑制;細胞周期分布發(fā)生了明顯變化，G1期的細胞均增加明顯，G2/M期的細胞出現減少，并且可見到較明顯的凋亡峰形成;荷瘤小鼠經胃灌注鞣花酸后，荷瘤小鼠腫瘤生長受到抑制，荷瘤小鼠瘤體組織survivin表達情況，陽性表達均低于生理鹽水組，表明腫瘤細胞凋亡增加，同時荷瘤小鼠胸腺系數、脾系數未出現明顯下降，表明鞣花酸在抑制4T1乳腺癌生長的同時可防止胸腺和脾萎縮，并進而提高機體免疫力。以上結果表明，石榴皮鞣花酸不僅對腫瘤細胞具有明顯的增殖抑制作用，鞣花酸可能主要通過對腫瘤細胞周期的改變引起腫瘤細胞凋亡。細胞凋亡受抑導致病變組織內腫瘤細胞存活時間延長，破壞細胞群體內存活與死亡的平衡，存活細胞數大于死亡細胞數，則腫瘤細胞數量凈增多［12-13］，而且鞣花酸可提高機體免疫力，從而進一步對腫瘤細胞產生作用。但是當鞣花酸濃度升到一定值后，對腫瘤細胞的抑制作用往往逐漸呈飽合狀態(tài)，鞣花酸在中劑量組與高劑量組的細胞抑制率差異無顯著性，鞣花酸與腫瘤共培養(yǎng)后檢測細胞周期后也發(fā)現，中劑量組與高劑量組石榴皮的G1期細胞差異也無統(tǒng)計學意義，這也提示鞣花酸對腫瘤細胞的抑制可能有飽合抑制，這也可能是提示石榴皮鞣花酸雖然有一定抗腫瘤作用，但療效仍有待提高的瓶頸原因。

本實驗證實石榴皮鞣花酸對4T1乳腺癌細胞的增殖和侵襲具有抑制作用，且效果顯著，本研究結果為石榴皮鞣花酸作為抗腫瘤藥物提供了一定的理論依據。

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