焦婷 韓長元 張力 馮燕娜 王金燕

反常性痤瘡一家系臨床表型及基因突變研究

焦婷 韓長元 張力 馮燕娜 王金燕

目的研究1個反常性痤瘡患者家系的基因突變。方法對一確診的反常性痤瘡先證者家系進行現(xiàn)場調(diào)查，并采集外周血標(biāo)本。PCR擴增早老素1（PSEN1）、單過性跨膜蛋白（NCSTN）和早老素增強子2（PSENEN）的所有外顯子，PCR產(chǎn)物進行序列分析。結(jié)果該家系共有5代67人，其中25人患?。?3例，女12例），符合常染色體顯性遺傳。家系中患者皮損主要分布于頸背部、胸部和臀部，腋下很少或未被累及。家系中11例患者NCSTN基因第11號外顯子存在c.1258C＞T錯義突變，導(dǎo)致第420位由氨基酸谷氨酰胺變?yōu)榻K止密碼子。同時檢測家系中6例無反常性痤瘡的正常人及與該家系無關(guān)的100名健康對照者，未發(fā)現(xiàn)該突變。檢索美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)該突變。結(jié)論該反常性痤瘡家系存在一個新的錯義突變，即NCSTN基因11號外顯子c.1258C＞T，這可能是該家系患者發(fā)病的分子基礎(chǔ)。

反常性痤瘡；表型；突變

反常性痤瘡（acne inversa，AI）是一種以反復(fù)發(fā)生皮膚膿腫、竇道及瘢痕形成為特征的慢性化膿性皮膚炎癥，皮損多發(fā)生在大汗腺分布的皮膚皺褶部位，如腋窩、腹股溝、會陰部等［1-3］。家族性 AI屬于常染色體顯性遺傳?。∣MIM142690）。近年來，多個研究小組對該癥進行了系列遺傳學(xué)研究，確定其發(fā)病與編碼γ-分泌酶的基因突變有關(guān)［4-10］。本研究在此基礎(chǔ)上，對一個大的AI家系進行突變位點檢測。

一、對象

對浙江省一AI家系進行現(xiàn)場調(diào)查，在獲得所有受試者知情同意后，進行詳細的皮膚科檢查。采集家系中11例患者和6例健康人血樣或口腔黏膜標(biāo)本，另選與該家系無關(guān)的100例健康人作為對照。本研究經(jīng)寧波市第二醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

二、方法

1.外周血基因組DNA提?。撼槿≡摷蚁抵?1例患者、6例健康人及與該家系無關(guān)的100例健康人外周血5 ml，2%EDTA抗凝，-70℃冷凍。采用全血基因組DNA提取試劑盒（德國Qiagen公司）提取外周血DNA。取部分患者口腔黏膜拭子提取DNA。

2.PCR 擴增：根據(jù)文獻［4］，合成早老素 1（PSEN1）、單過性跨膜蛋白（NCSTN）和早老素增強子2（PSENEN）的引物，其中第11外顯子引物序列：上游5′-AGGAAATTCAGAGAGCC TTGGT-3′,下游 3′-CTGAAGTTCTGGAGGGGGTAGT-5′。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系總體積 25 μl，反應(yīng)液成分包括 14.8 μl緩沖液，dNTP 5 μl，上下游引物各1.0 μl，Taq酶0.2 μl（1 U），基因組DNA 1.0 μl，反應(yīng)條件為94℃預(yù)變性2 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃1 min，共30個循環(huán)，72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析。

3.DNA測序與分析：所有PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后采用ABI3730全自動DNA測序儀（美國Applied Biosystems公司）進行序列測定，各測序結(jié)果采用BLAST軟件進行同源性分析。

三、結(jié)果

1.家系調(diào)查和臨床表現(xiàn)：鑒定了一個5代67人中國漢族人AI家系（圖1），家系中25例患者（男13例，女12例），符合常染色體顯性遺傳。檢測對象包括該家系11例患者和6例健康人。先證者，男，44歲，自14歲開始，頸后、背部及臀部出現(xiàn)多個紅色丘疹、結(jié)節(jié)，伴疼痛，此后皮損逐漸變軟，自行破潰溢膿，愈后留有凹陷性瘢痕、囊腫和膿腫，30年來皮損反復(fù)發(fā)生，逐漸增多增大，部分融合成不規(guī)則形巨大斑塊，以左側(cè)臀部為著，腋下及腹股溝散在個別暗紅色炎性丘疹、結(jié)節(jié)（圖2）。家族中其余24例患者有類似癥狀，均在青春期發(fā)病，癥狀均較先證者輕，皮損主要累及臀部及頸背部，腋下及腹股溝均未累及。

2.突變分析：對家系中11例患者、6例健康人及與該家系無血緣關(guān)系的100例健康人的NCSTN、PSEN和PSENEN所有外顯子采用PCR擴增，11例患者的NCSTN基因第11號外顯子存在c.1258C＞T（p.Q420X）錯義突變（圖3）。所有突變均經(jīng)正向和反向測序證實。而家系中的6例健康人及100例健康對照的DNA測序結(jié)果未發(fā)現(xiàn)此突變。查詢美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)該突變。

四、討論

AI亦稱為毛囊閉塞三聯(lián)征，是指聚合性痤瘡、化膿性汗腺炎、穿掘膿腫性頭部毛囊周圍炎同時存在。AI病變主要累及腋下、腹股溝、外生殖器區(qū)及肛周等毛囊皮脂腺單位、頂泌汗腺分布豐富的部位。有文獻［4］報道，NCSTN基因突變的患者，以面部、前額、頸背部、胸部、臀部和腰部等非典型部位的病變?yōu)橹?，而腋下的病變相對較輕。本研究中該家系患者的皮損分布特征與該文獻報道的一致，患者皮損主要分布于頸背部、胸部和臀部，腋下未被累及。

圖1 反常性痤瘡患者家系圖 箭頭所指為先證者

圖2 先證者（Ⅲ-23）臀部皮損

圖3 反常性痤瘡患者（3a）及家系內(nèi)健康人（3b）NCSTN基因第11外顯子測序結(jié)果（箭頭示突變位置）

AI的確切病因及發(fā)病機制尚不十分清楚，認為是毛囊閉鎖、遺傳因素、激素水平變化及外因刺激等多種因素共同作用引起的疾病［11］。王寶璽等［4］研究表明，編碼 γ 分泌酶亞單位的PSEN1、NCSTN和PSENEN 3個基因發(fā)生突變，都會導(dǎo)致家族性反常性痤瘡。我們對1個AI家系5代中11例患者的NCSTN、PSEN和PSENEN所有外顯子進行測序，發(fā)現(xiàn)NCSTN基因第11號外顯子存在c.1258C＞T（p.Q420X）錯義突變，該家系中的6例健康人及與該家系無關(guān)的100例健康人DNA混合液PCR產(chǎn)物測序，未發(fā)現(xiàn)此突變。查詢美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)庫，未發(fā)現(xiàn)該突變。因此認為，我們發(fā)現(xiàn)的是一個新的致病突變，該突變導(dǎo)致NCSTN的第420位密碼子由CAG變成TAG，氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榻K止密碼子，所編碼的蛋白將提前終止（全長709個氨基酸），進而可能影響γ分泌酶功能。

γ分泌酶是由NCSTN、PSEN、APH1和PSENEN 4種蛋白亞基構(gòu)成的蛋白復(fù)合體，能切割各種Ⅰ型蛋白酶,包括Notch信號通路的受體及與阿爾采默病密切相關(guān)的淀粉樣前蛋白［12］。NCSTN編碼一有高度糖基化胞外結(jié)構(gòu)域的Ⅰ型跨膜蛋白，由709個氨基酸組成，Asn263-Ala483區(qū)域是其活性中心，對γ分泌酶的組裝及其功能的發(fā)揮起著重要作用［13］。動物模型研究發(fā)現(xiàn)，小鼠皮膚γ分泌酶滅活后，會影響Notch信號通路，引發(fā)毛囊過度角化，出現(xiàn)與反常性痤瘡患者病變皮膚相似的組織病理改變［14］。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)NCSTN的c.1258C＞T（p.Q420X）錯義突變，導(dǎo)致第420位由氨基酸谷氨酰胺變?yōu)榻K止密碼子。在第420個氨基酸提前出現(xiàn)的終止密碼子將導(dǎo)致NCSTN的胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域與胞外結(jié)構(gòu)域斷裂，被截短的蛋白其功能必然會受到影響。因此，這可能是該家系患者發(fā)病的分子基礎(chǔ)。本研究中，NCSTN基因突變的患者，以面部、頸背和臀部等非典型部位的病變?yōu)橹?，而腋下的病變相對較輕。這一發(fā)現(xiàn)目前僅在王寶璽等的研究及本研究中有報道，還需要更多的家系研究進一步證實。

[1]倉田,曾躍平,王寶璽.反常性痤瘡八例分析[J].國際皮膚性病學(xué)雜志,2013,39（4）；219-221.

[2]惠云,李海玲,李志量,等.反常性痤瘡17例臨床分析[J].中華皮膚科雜志,2014,47（1）；62-63.

[3]倉田,王寶璽,渠濤.反常性痤瘡發(fā)病機制的研究進展[J].國際皮膚性病學(xué)雜志,2012,38（6）；373-375.

[4]Wang B,Yang W,Wen W,et al.Gamma-secretase gene mutations in familial acne inversa[J].Science,2010,330（6007）；1065.

[5]Pink AE,Simpson MA,Brice GW,et al.PSENEN and NCSTN mutations in familial hidradenitis suppurativa（Acne Inversa）[J].J Invest Dermatol,2011,131（7）；1568-1570.

[6]Li CR,Jiang MJ,Shen DB,et al.Two novel mutations of the nicastrin gene in Chinese patients with acne inversa[J].Br J Dermatol,2011,165（2）；415-418.

[7]Liu Y,Gao M,Lv YM,et al.Confirmation by exome sequencing of the pathogenic role of NCSTN mutations in acne inversa（hidradenitis suppurativa）[J].J Invest Dermatol,2011,131（7）；1570-1572.

[8]Miskinyte S,Nassif A,Merabtene F,et al.Nicastrin mutations in French families with hidradenitis suppurativa[J].J Invest Dermatol,2012,132（6）；1728-1730.

[9]Nomura Y,Nomura T,Sakai K,et al.A novel splice site mutation in NCSTN underlies a Japanese family with hidradenitis suppurativa[J].Br J Dermatol,2013,168（1）；206-209.

[10]Zhang C,Wang L,Chen L,et al.Two novel mutations of the NCSTN gene in Chinese familial acne inverse[J].J Eur Acad Dermatol Venereol,2013,27（12）；1571-1574.

[11]徐浩翔,王寶璽.反常性痤瘡發(fā)病機制和治療的研究進展[J].國際皮膚性病學(xué)雜志,2011,37（4）；242-245.

[12]Bergmans BA,De Strooper B.Gamma-secretases；from cell biology to therapeutic strategies[J].Lancet Neurol,2010,9（2）；215-226.

[13]YuG,NishimuraM,ArawakaS,et al.Nicastrin modulates presenilinmediated notch/glp-1 signal transduction and betaAPP processing[J].Nature,2000,407（6800）；48-54.

[14]Pan Y,Lin MH,Tian X,et al.Gamma-secretase functions through Notch signaling to maintain skin appendages but is not required for their patterning or initial morphogenesis[J].Dev Cell,2004,7（5）；731-743.

2014-03-19）

（本文編輯：顏艷）

Clinical and genetic analysis of a pedigree with acne inversa

Jiao Ting,Han Changyuan,Zhang Li,Feng Yanna,Wang Jinyan.Department of Dermatology,Ningbo No.2 Hospital,Ningbo 315010,Zhejiang,China

；Wang Jinyan,Email；nbwangjinyan@126.com

ObjectiveTo detect γ-secretase gene mutations in a large Chinese pedigree with acne inversa（AI）.MethodsClinical evaluation was carried out in a large pedigree with AI through field investigation. Peripheral blood samples were obtained from 17 family members（11 affected and 6 unaffected）and 100 unrelated healthy human controls.DNA was extracted from the blood samples,and PCR was performed to amplify all the coding regions of PSEN 1,PSENEN and NCSTN genes followed by DNA sequencing analysis.ResultsThere were 67 members over 5 generations in this family,of whom,25（13 males and 12 females） were affected by AI.AI was inherited in an autosomal dominant manner in this family.Skin lesions were mainly distributed on the neck,back,chest and buttocks,and occasionally in subaxillary regions.DNA sequencing revealed a novel missense mutation,c.1258C＞ T （p.Q420XP）,in the exon 11 of the NCSTN gene in 11 affected family members,which leads to a substitution of glutamine by a premature termination codon at amino acid 420 （p.Q420X）.The mutation was undetected in either the unaffected members or the unrelated healthy controls,and had not been registered in the single nucleotide polymorphism （SNP） database in National Center for Biotechnology Information.ConclusionsThere is a novel heterozygous missense mutation，c.1258C ＞ T in the exon 11 of the NCSTN gene，which may be the molecular basis of pathogenesis of AI in this family.

Acne inversa；Phenotype；Mutations

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.015

寧波市2013年度第二批科技項目（2013A610268）

315010浙江，寧波市第二醫(yī)院皮膚科

王金燕，Email：nbwangjinyan@126.com