任紀(jì)禎 陳振雨 楊廷 萬金娥 趙明

高壓氧對兔耳增生性瘢痕形成過程中缺氧誘導(dǎo)因子1α和胰島素樣生長因子Ⅰ受體表達(dá)的影響

任紀(jì)禎 陳振雨 楊廷 萬金娥 趙明

目的探討高壓氧對兔耳增生性瘢痕的形成及瘢痕組織中缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、胰島素樣生長因子Ⅰ受體（IGF-1R）表達(dá)的影響。方法選取20只新西蘭大白兔建立兔耳瘢痕模型，隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)給予高壓氧時(shí)間不同分為7 d、14 d、21 d及28 d組，每組4只共48個(gè)創(chuàng)面，實(shí)驗(yàn)組術(shù)后立即給予高壓氧處理，對照組處于常氧壓空氣環(huán)境中。術(shù)后第29天切取瘢痕組織進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色，觀察形態(tài)學(xué)差異，計(jì)算瘢痕增生指數(shù)；免疫組化法檢測HIF-1α、IGF-1R的表達(dá)。結(jié)果HE染色可見實(shí)驗(yàn)組成纖維細(xì)胞數(shù)量及膠原纖維含量較對照組明顯減少。對照組瘢痕增生指數(shù)為4.28±0.22，7 d、14 d、21 d及28 d實(shí)驗(yàn)組分別為3.64±0.29、3.46±0.21、3.29±0.21、3.16±0.15，各組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=77.70，P＜0.05）。免疫組化檢測可見，各實(shí)驗(yàn)組HIF-1α、IGF-1R的表達(dá)量均較對照組顯著降低（P＜0.01），14 d組兩因子表達(dá)量較7 d組、21 d組較14 d組減少（均P＜0.05），28 d組與21 d組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05）。結(jié)論高壓氧可降低兔耳瘢痕組織中HIF-1α、IGF-1R的表達(dá)，對兔耳增生性瘢痕的形成有明顯抑制作用。

高壓氧；瘢痕；缺氧誘導(dǎo)因子1，α亞基；胰島素樣生長因子-I受體

缺氧是影響瘢痕增生的的重要因素之一，Kischer等［1］研究發(fā)現(xiàn)，低氧在病理性瘢痕的形成過程中起著重要作用。低氧不但能調(diào)控瘢痕中成纖維細(xì)胞的活性、膠原的合成與降解，還能影響一些生長因子如缺氧誘導(dǎo)因子1（HIF-1）、血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）、轉(zhuǎn)化生長因子 β1（TGFβ1）等的分泌。HIF-1是缺氧特異感受因子，能對缺氧產(chǎn)生適應(yīng)性反應(yīng)，減輕缺氧造成的損害，它隨缺氧程度變化而變化［2-4］，該因子可調(diào)節(jié)多種靶細(xì)胞因子如血管內(nèi)皮生長因子、促紅細(xì)胞生成素等。胰島素樣生長因子Ⅰ受體（IGF-1R）介導(dǎo)的信號通路與瘢痕的形成密切相關(guān)，其不但能誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成和分泌膠原等細(xì)胞外基質(zhì)，還能抑制細(xì)胞凋亡，從而使瘢痕中成纖維細(xì)胞獲得持久增殖和分泌的能力，影響創(chuàng)面愈合后組織改建［5-6］。高壓氧治療能使創(chuàng)面局部血氧含量增高，改善組織缺氧狀態(tài)，增加組織供氧，促進(jìn)創(chuàng)面愈合［7-8］。本實(shí)驗(yàn)擬在瘢痕形成過程中給予高壓氧治療，并觀察高壓氧對病理性瘢痕中HIF-1α、IGF-1R表達(dá)的影響，探討高壓氧在瘢痕形成過程中可能發(fā)揮的作用。

材料與方法

一、材料

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康新西蘭大白兔20只，體重2.0～2.5 kg，兔耳健全，雌雄不拘，由青島市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號 SCXK（魯）2009～0007。

2.實(shí)驗(yàn)材料：兔抗兔HIF-1α單克隆抗體、兔抗兔IGF-lR單克隆抗體產(chǎn)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；SABC試劑盒、DAB顯色試劑盒產(chǎn)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

二、方法

1.兔耳增生性瘢痕模型的建立：選取20只新西蘭大耳白兔，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，參照李薈元［9］方法制作瘢痕模型，并加以改良，用鹽酸氯胺酮30 mg/kg、地西泮5 mg/kg肌內(nèi)注射麻醉成功后，固定于操作臺上，兔耳腹側(cè)面皮膚聚維酮碘消毒，嚴(yán)格無菌操作下，在兔耳腹側(cè)中段沿長軸避開可見血管作直徑為1 cm大小創(chuàng)面，每耳6處，創(chuàng)面間隔1 cm以上，去掉兔耳全層皮膚，并用刮勺徹底刮除軟骨膜，壓迫止血。模型制備成功后，采取單兔單籠標(biāo)準(zhǔn)條件下飼養(yǎng)。將兔隨機(jī)分成實(shí)驗(yàn)組和對照組，實(shí)驗(yàn)組根據(jù)給予高壓氧的時(shí)間不同分為7 d、14 d、21 d及28 d組，每組4只共48個(gè)創(chuàng)面。

2.高壓氧處理：實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后立即置于DS-Ⅱ型實(shí)驗(yàn)動(dòng)物加壓艙，純氧洗艙5 min，升壓10 min至0.1 MPa后穩(wěn)壓，吸純氧60 min，減壓10 min。實(shí)驗(yàn)組按分組不同分別行高壓氧治療7 d、14 d、21 d及28 d，每天同一時(shí)間治療1次。對照組處于常氧壓空氣環(huán)境中。

3.標(biāo)本取材及處理：于模型制備后29 d，在同樣麻醉?xiàng)l件下統(tǒng)一切取實(shí)驗(yàn)組和對照組瘢痕組織及周圍1 mm正常組織，4%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋，蘇木精-伊紅（HE）染色、免疫組化染色，光鏡下觀察HE染色切片，用測微尺測出瘢痕最高點(diǎn)至耳軟骨表面的垂直厚度（a）、瘢痕周邊正常皮膚至耳軟骨表面的垂直厚度（b），瘢痕增生指數(shù)（hypertrophic index，HI）=a/b。蠟塊包埋時(shí)，盡量讓瘢痕的高點(diǎn)豎直線與蠟塊相平行，均由同一醫(yī)師切片，切出一個(gè)最大面，然后以此最大面完成瘢痕指數(shù)的測量計(jì)算。

4.結(jié)果判定：HIF-1α、IGF-1R陽性細(xì)胞半定量（參照徐少駿方法［10］）玻片置于相同強(qiáng)度光線下觀察，按染色的深淺（信號強(qiáng)度）分為3級：棕黑色為強(qiáng)陽性“+++”，棕黃色為陽性“++”，淺棕色為弱陽性“+”。在表皮隨機(jī)取5個(gè)位置，每個(gè)位置從表皮層到真皮深層根據(jù)組織厚度取4～6個(gè)高倍視野，每個(gè)視野隨機(jī)觀察50個(gè)細(xì)胞，將陽性細(xì)胞選定在各個(gè)級別中，用權(quán)重方法將全部陽性信號進(jìn)行量化，即“+++”乘 3，“++”乘 2，“+”乘 1。權(quán)重量化的數(shù)值反映了該位置的信號強(qiáng)度，取5個(gè)位置的平均值作為該標(biāo)本的相對信號強(qiáng)度。

5.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，所有數(shù)據(jù)采用±s表示，組間兩兩比較用LSD-t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、形態(tài)學(xué)觀察

7 d、14 d、21 d及28 d實(shí)驗(yàn)組和對照組創(chuàng)面在上皮化后均逐漸形成不同程度瘢痕增生，實(shí)驗(yàn)組瘢痕較對照組明顯減輕。對照組瘢痕增生明顯，高出皮膚表面，充血呈紫紅色，質(zhì)硬；實(shí)驗(yàn)組瘢痕增生不明顯，瘢痕體積小，色白，質(zhì)軟。見圖1。

二、HE染色結(jié)果

對照組瘢痕組織成纖維細(xì)胞數(shù)目多、核大，毛細(xì)血管增生明顯，膠原纖維致密粗大，排列紊亂；各實(shí)驗(yàn)組瘢痕均較對照組薄，成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，膠原纖維減少，較疏松，可見少量毛細(xì)血管，以21、28 d組較為明顯。見圖2。

三、HI

各實(shí)驗(yàn)組HI值均比對照組低（均P＜0.05），7 d、14 d、21 d組HI值隨高壓氧治療時(shí)間的延長逐漸降低，14 d組低于7 d組，21 d組低于14 d組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），21 d組與28 d組比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

圖1 兔耳增生性瘢痕形成第29天形態(tài)學(xué)觀察：實(shí)驗(yàn)組和對照組兔耳創(chuàng)面都形成了不同程度的增生性瘢痕 1a：對照組瘢痕增生明顯，高出皮膚表面，充血呈紅色，觸之質(zhì)硬；1b～1e：分別為7、14、21、28 d組，與對照組相比，各實(shí)驗(yàn)組瘢痕增生不明顯，瘢痕體積較對照組小，顏色較淺，質(zhì)軟

圖2 兔耳增生性瘢痕形成第29天組織學(xué)表現(xiàn)（HE×100） 2a：對照組瘢痕內(nèi)大量成纖維細(xì)胞，膠原纖維致密粗大，排列紊亂；2b～2e：分別為7、14、21、28 d實(shí)驗(yàn)組，其瘢痕均較對照組薄，成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，膠原纖維少，排列較疏松

圖3 兔耳增生性瘢痕形成第29天胰島素樣生長因子Ⅰ受體（IGF-1R）的表達(dá)（免疫組化 ×100） 3a：對照組可見IGF-1R表達(dá)；3b～3e：分別為7、14、21、28 d組，IGF-1R表達(dá)較對照組明顯減弱

圖4 兔耳增生性瘢痕形成第29天缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）的表達(dá)（免疫組化×100） 4a：對照組可見HIF-1α表達(dá)； 4b ～ 4e：分別為7、14、21、28 d實(shí)驗(yàn)組，HIF-1α表達(dá)較對照組明顯減弱

四、HIF-1α、IGF-1R 的表達(dá)

實(shí)驗(yàn)組和對照組均可見HIF-1α、IGF-1R表達(dá)，見圖3、4。各實(shí)驗(yàn)組HIF-1α、IGF-1R的表達(dá)量均較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），14 d組兩因子表達(dá)量較7 d組顯著減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），21 d組兩因子的表達(dá)量較14 d組減少（P＜0.05），28 d組兩因子的表達(dá)量與21 d組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

討 論

研究表明，兔耳瘢痕造模成功后28 d左右瘢痕增生達(dá)到高峰［9］，此后28～56 d瘢痕處于增生穩(wěn)定期，在該時(shí)間內(nèi)既可觀察藥物對瘢痕繼續(xù)增生的抑制作用，又可觀察藥物等因素對已形成的固有瘢痕的影響［11-12］。本研究在造模后立即給予高壓氧干預(yù)，主要觀察高壓氧對兔耳瘢痕形成過程中早期的影響，因此選擇在高壓氧開始干預(yù)后的第29天統(tǒng)一取材來觀察高壓氧抑制瘢痕的效果。

表1 高壓氧對各組兔耳瘢痕增生指數(shù)、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、胰島素樣生長因子Ⅰ受體（IGF-1R）表達(dá)的影響（±s）

表1 高壓氧對各組兔耳瘢痕增生指數(shù)、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）、胰島素樣生長因子Ⅰ受體（IGF-1R）表達(dá)的影響（±s）

注： 與對照組比較，a：P ＜ 0.05，b：P ＜ 0.01； 與 7 d組比較，c：P ＜0.05，d：P ＜ 0.01；與 14 d 組比較，e：P ＜ 0.05

組別 創(chuàng)面數(shù) 瘢痕增生指數(shù) HIF-1α IGF-1R對照組 48 4.28±0.22 46.86±4.21 56.82±4.80實(shí)驗(yàn)組7 d組 48 3.64±0.29a 38.33±3.16b47.38±3.67b 14 d組 48 3.46±0.21c 31.85±2.55d42.92±2.60d 21 d組 48 3.29±0.21e 29.77±1.89e39.79±2.06e 28 d組 48 3.16±0.15 28.06±1.67 37.78±2.22 F值 77.70 146.01 110.66 P值 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

黎國屏和李清懷［13］在研究高壓氧對燒傷創(chuàng)面的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，高壓氧能改善組織低氧，使創(chuàng)面愈合速度加快，減少瘢痕組織形成。Al-Waili等［14］在研究高壓氧和惡性腫瘤的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，高壓氧能抑制乳腺癌動(dòng)物模型中TGFβ1和IGF-1的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組HI值均比對照組低；組織形態(tài)學(xué)上，與對照組比較，各實(shí)驗(yàn)組瘢痕增生不明顯，瘢痕體積小，色白，質(zhì)軟，HE結(jié)果示各實(shí)驗(yàn)組瘢痕均較對照組薄，成纖維細(xì)胞數(shù)目減少，膠原纖維減少，較疏松，以21 d、28 d組較為明顯；免疫組織化學(xué)檢測顯示，各實(shí)驗(yàn)組HIF-1α、IGF-1R的表達(dá)量均較對照組顯著降低。此結(jié)果與 Romero-Valdovinos等［15］的研究結(jié)果基本一致，即高壓氧不但可以降低瘢痕中成纖維細(xì)胞的增殖，而且能降低瘢痕中TGF-β mRNA與IGF mRNA的表達(dá)，因此，高壓氧不但調(diào)控細(xì)胞活性，影響膠原的合成與降解，而且還能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的表達(dá)來進(jìn)一步影響瘢痕形成。

本研究發(fā)現(xiàn)，HIF-1α及IGF-1R在14 d組表達(dá)量較7 d組顯著減少，21 d組較14 d組減少，28 d組與21 d組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明盡早應(yīng)用高壓氧干預(yù)可能更有利于創(chuàng)面愈合。

本研究結(jié)果初步表明，兔耳瘢痕形成過程中早期給予高壓氧治療可降低增生性瘢痕中HIF-1α、IGF-1R的表達(dá)，抑制增生性瘢痕的形成，推測其機(jī)制可能與以下因素有關(guān)：瘢痕形成早期，高壓氧通過改善組織氧張力，改善瘢痕的缺氧狀態(tài)，同時(shí)促進(jìn)損傷血管的修復(fù)及促進(jìn)新血管的生成，增加組織氧供，促進(jìn)肉芽組織的生成，加快創(chuàng)面愈合，并且高壓氧下調(diào)IGF-1R、HIF-1α等與瘢痕增生密切相關(guān)的生長因子。IGF-1R表達(dá)降低能抑制成纖維細(xì)胞的生長增殖，減少膠原的合成、分泌，HIF-1α表達(dá)降低通過調(diào)節(jié)一系列靶基因來進(jìn)一步抑制成纖維細(xì)胞的增殖及血管生成等來抑制瘢痕的增殖。

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2013-12-05）

（本文編輯：尚淑賢）

Effects of hyperbaric oxygen on the expressions of hypoxia-inducible factor 1α and insulin-like growth factor-1 receptor in the formation of hyperplastic scar in rabbit ears

Ren Jizhen,Chen Zhenyu,Yang Ting,Wan Jin′e,Zhao Ming.Affiliated Hospital of Qingdao University,Qingdao 266003,China

；Chen Zhenyu,Email；czy.plastic@126.com

ObjectiveTo evaluate the effects of hyperbaric oxygen on the expressions of hypoxia-inducible factor 1α （HIF-1α） and insulin-like growth factor-1 receptor （IGF-1R） in the formation of hyperplastic scar in rabbit ears.MethodsThe ears of 20 New Zealand rabbits were used to construct an animal model for hyperplastic scar by operation.After the establishment of scar models,the rabbits were randomly divided into 4 experimental groups and one control group with 4 mice （48 wound surfaces） in each group.The mice in the 4 experimental groups were treated with hyperbaric oxygen for 7,14,21 and 28 days,respectively,and those in the control group remained in normoxic environment after operation.Scar tissues were resected from all the rabbit ears on day 29 after operation.Hematoxylin and eosin （HE）staining was conducted for the observation of morphological changes and calculation of scar elevation index,and immunohistochemistry to measure the expressions of HIF-1α and IGF-1R.Statistical analysis was carried out by one-way analysis of variance followed by least significant differencet-test.ResultsHE staining showed that both the number of fibroblasts and amount of collagen fibers were significantly reduced in the experimental groups compared with the control group.Scar elevation index was 4.28±0.22 in the control group,3.64±0.29,3.46±0.21,3.29±0.21,3.16±0.15 in the 7-,14-,21-and 28-day experimental groups respectively,with significant differences among these groups （F=77.70,P＜ 0.05）.The expressions of HIF-1α and IGF-1R were significantly lower in these experimental groups than in the control group （allP＜0.01）,lower in the 14-day group than in the 7-day group（P＜0.05）,and lower in the 21-day group than in the 14-day group（P＜0.05）,with no significant differences between the 28-day group and 21-day group （bothP ＞ 0.05）.ConclusionHyperbaric oxygen can effectively down-regulate the expressions of HIF-1α and IGF-1R in scar tissue,and significantly inhibit the formation of hyperplastic scar in rabbit ears.

Hyperbaric oxygenation；Cicatrix；Hypoxia-inducible factor 1,alpha subunit；Receptor,IGF type 1

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.008

山東省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目（2011YD18036）

266003青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院

陳振雨，Email：czy.plastic@126.com