欒超 楊永紅 王焱 劉毅 陳敏 蔣明軍 王寶璽

銀屑病患者皮膚中原位記憶T淋巴細(xì)胞的檢測

欒超 楊永紅 王焱 劉毅 陳敏 蔣明軍 王寶璽

目的研究皮膚組織原位記憶T淋巴細(xì)胞在銀屑病發(fā)病過程中的作用。方法收集32例進行期斑塊狀銀屑病患者的臨床資料，采集每例患者的皮損和非皮損組織、9例患者皮損消退后皮膚標(biāo)本；10例健康人皮膚為對照。采用免疫組化法檢測組織原位記憶T淋巴細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志CD69和CD103，分析組織原位記憶T淋巴細(xì)胞在銀屑病發(fā)病不同時期的情況。兩組免疫組化結(jié)果進行t檢驗。結(jié)果32例進行期銀屑病患者皮損和非皮損每高倍視野中CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞數(shù)量分別為11.34±7.60和2.72±4.20，皮損區(qū)明顯高于非皮損區(qū)（t=8.46，P＜0.01）；其中9例患者皮損消退前后每高倍視野中CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞數(shù)量分別為14.33±2.21和12.00±4.58，皮損消退前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.98，P=0.08）；健康對照組為1.70±2.98，與銀屑病患者非皮損區(qū)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.71，P＞0.05）。結(jié)論銀屑病患者皮膚中原位記憶T淋巴細(xì)胞可能在皮損的形成和復(fù)發(fā)過程中起作用。

銀屑??；記憶T淋巴細(xì)胞，原位

最近有研究發(fā)現(xiàn)，病毒感染皮膚后，皮膚中停留少量的特殊記憶T淋巴細(xì)胞亞群，對同類病毒再次感染起防御作用，不同于中心記憶T淋巴細(xì)胞（TCM） 和效應(yīng)記憶T淋巴細(xì)胞（TEM），這群CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞被命名為組織原位記憶T淋巴細(xì)胞（TRM）［1-2］。TRM細(xì)胞是最近新發(fā)現(xiàn)的一群特殊的記憶T細(xì)胞，炎癥結(jié)束后不會凋亡，能長期存活于周圍組織中。TRM細(xì)胞分化更為完全，不依賴于循環(huán)記憶T細(xì)胞的補充，能夠長期定居在周圍組織中。TRM細(xì)胞的數(shù)量不隨炎癥細(xì)胞的增多而增加，在感染和腫瘤免疫中發(fā)揮重要作用［1-5］。銀屑病是T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，易于反復(fù)發(fā)作。有研究提示，患者皮膚居住細(xì)胞可能在該病反復(fù)發(fā)作過程中起重要作用［6-7］，但對其細(xì)胞類型和致病機制卻知之甚少。隨著近年來一些T淋巴細(xì)胞新亞群的發(fā)現(xiàn)，認(rèn)識到記憶T淋巴細(xì)胞在該病復(fù)發(fā)過程中的作用［8-9］。我們推測TRM細(xì)胞可能在銀屑病的發(fā)病機制，尤其在復(fù)發(fā)過程中起重要作用。本文運用免疫組化法檢測了銀屑病患者皮損、非皮損和消退后皮膚中TRM細(xì)胞的情況，研究TRM細(xì)胞在銀屑病發(fā)病機制中的作用。

資料和方法

一、資料

1.標(biāo)本：32例進行期斑塊狀銀屑病患者來源于2013年9月至2014年1月我院門診患者，經(jīng)臨床和組織病理確診為銀屑病，男19例，女13例，年齡19～56歲，病程1個月至20年，銀屑病嚴(yán)重程度指數(shù)（PASI）3.8～46。皮膚鉆孔法采集同一患者軀干部皮損區(qū)和非皮損區(qū)皮膚標(biāo)本、9例皮損消退后皮膚標(biāo)本。10例健康人對照皮膚來源于我院皮膚外科整形手術(shù)多余的軀干部正常皮膚，男6例，女4例，年齡18～49歲。銀屑病患者和健康人對照組的性別比例和年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。本研究經(jīng)本院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

2.試劑：鼠抗人CD69單克隆抗體和兔抗人CD103單克隆抗體均由沙特阿拉伯Abcom公司生產(chǎn)，分別按1∶25和1∶500稀釋，磷酸鹽緩沖液（PBS）由美國Gibco公司生產(chǎn)。枸櫞酸抗原修復(fù)緩沖液、內(nèi)源性過氧化氫酶抑制劑、非免疫動物血清（羊）、HRP標(biāo)記抗羊鼠IgG、HRP標(biāo)記抗兔 IgG、DAB顯色試劑盒、蘇木素和中性樹膠均由福州邁新生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)。

二、方法

1.免疫組化：所有標(biāo)本經(jīng)甲醛液固定，將組織制成蠟塊后連續(xù)切成5 μm薄片，免疫組化染色按照染色試劑盒操作說明進行，所有切片均在同一質(zhì)控條件下進行，設(shè)陽性和陰性對照。其中，雙染色為DAB與AEC染色，CD69使用DAB染色，陽性為棕色，CD103使用AEC染色，陽性為紅色。

2.結(jié)果判定：CD69陽性表達定位于細(xì)胞膜，CD103陽性表達定位于細(xì)胞膜和胞質(zhì)，單染結(jié)果均為棕黃色顆粒。在同一切片上CD69（棕色）和CD103（紅色）同時染色，即同時表達CD69和CD103的T淋巴細(xì)胞見紅棕色顆粒。計算5個顯微鏡高倍視野下陽性表達T淋巴細(xì)胞平均個數(shù)。

3.數(shù)據(jù)處理：采用SPSS13.0軟件進行t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

圖1 銀屑病皮損CD69和CD103連續(xù)切片同部位單染結(jié)果表皮和真皮均有CD69+T淋巴細(xì)胞和CD103+T淋巴細(xì)胞，見棕黃色顆粒（1a：CD69×100；1b：CD103×100）

圖2 銀屑病皮損CD69（棕色）和CD103（紅色）雙染色結(jié)果CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞見紅棕色顆粒（2a：×100；2b：×200）

結(jié) 果

32例銀屑病患者皮損（圖1）和非皮損、9例皮損消退后皮膚和10例正常人對照皮膚中均可見單獨表達CD69和CD103的T淋巴細(xì)胞，分布較廣泛，包括表皮和淺深層真皮。32例銀屑病患者皮損中可見CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞，分布于表皮和真皮淺層（圖2）；9例皮損消退后皮膚中CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞主要分布于表皮；僅有13例銀屑病患者非皮損和3例健康人對照皮膚中見CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞，分布于真皮淺層。

進行期銀屑病患者皮損（32例）和非皮損（13例）每個顯微鏡高倍視野中CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞數(shù)量分別為11.34±7.60和2.72±4.20，皮損明顯高于非皮損（t=8.46，P＜ 0.01）；健康人對照皮膚（10例）為1.70±2.98，與32例銀屑病非皮損比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=0.71，P＞0.05）。銀屑病患者PASI評分與皮損中CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)（r=0.75，P＜ 0.01）。

32例銀屑病患者中的9例患者皮損消退前后每高倍視野中CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞數(shù)量分別為14.33±2.21和12.00±4.58，皮損消退前后比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（t=1.98，P=0.08）。9例患者消退后皮膚中CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞數(shù)量明顯高于10例健康人對照皮膚（t=5.87，P＜0.01）。9例患者PASI評分與皮損消退后皮膚中CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞數(shù)量正相關(guān)（r=0.89，P＜ 0.01）。

討 論

普遍認(rèn)為銀屑病是多基因遺傳背景下主要由Th17和Th1細(xì)胞介導(dǎo)的免疫異常性疾病，T淋巴細(xì)胞在該病發(fā)病機制中起中心作用。有研究［6-7］通過移植銀屑病患者發(fā)病時非皮損處皮膚到特定小鼠建立模型，發(fā)現(xiàn)非皮損處皮膚仍能發(fā)展成銀屑病皮損，提示銀屑病患者皮膚中的居住細(xì)胞可能在該病發(fā)生過程中起著重要作用。

TRM細(xì)胞與TCM和TEM具有不同的表型和功能，在周圍組織的定位需要組織局部微環(huán)境和黏附分子的參與。組織歸巢T淋巴細(xì)胞表達歸巢受體CCR9和α4β7整合素，當(dāng)T淋巴細(xì)胞到達周圍組織后CCL25和轉(zhuǎn)化生長因子α（TGF-α）誘導(dǎo)歸巢T淋巴細(xì)胞表達E鏈（CD103），與β7鏈重新整合，使T淋巴細(xì)胞在組織中定居［10］。此外，細(xì)胞因子可促進CD69表達缺失的T淋巴細(xì)胞遷移，CD69可使T淋巴細(xì)胞定位于局部組織［11-12］。CD69和CD103是TRM細(xì)胞的特征性表面標(biāo)志。

銀屑病皮損消退后是否有抗原特異性TRM繼續(xù)停留？在該病復(fù)發(fā)過程中起何作用？我們的研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損中CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量明顯高于非皮損，表明 CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞的數(shù)量與皮損的形成有關(guān)。易于反復(fù)發(fā)作是銀屑病的特點，也是治療難點，其機制目前還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者皮損消退后表皮中仍然存在相當(dāng)數(shù)量的CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞，提示TRM細(xì)胞可能與該病皮損的復(fù)發(fā)有關(guān)。但本研究中銀屑病患者皮損消退后皮損獲得困難，樣本量較小，需要擴大樣本量研究。此外，本研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病非皮損處CD69+CD103+T細(xì)胞數(shù)量與健康人皮膚無明顯差異，部分解釋了外周循環(huán)來源的活化T細(xì)胞是否導(dǎo)致皮損還取決于皮膚中居住T細(xì)胞的分布情況。

由于通過免疫組化方法同時檢測三種表面標(biāo)記存在困難，本研究沒有區(qū)別皮膚中的CD69+CD103+T淋巴細(xì)胞是屬于CD4+T淋巴細(xì)胞還是CD8+T淋巴細(xì)胞亞群。有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者臨床痊愈后皮膚中主要是CD8+T淋巴細(xì)胞［13］，推測銀屑病皮損消退后留下的主要是CD8+TRM細(xì)胞。近期的研究也發(fā)現(xiàn)，皮膚在HSV-1感染后留下的CD8+TRM細(xì)胞可以直接被再次感染的同類病毒抗原激活，TRM細(xì)胞活化閾值較低，其發(fā)揮免疫作用可以不需要CD4+T淋巴細(xì)胞和B細(xì)胞的參與［1］。因此，銀屑病患者皮膚中的TRM細(xì)胞的種類、功能和活化機制還需要進一步深入研究。

志謝本院皮膚整形美容外科和門診治療室在標(biāo)本收集過程中的大力支持

[1]Jiang X,Clark RA,Liu L,et al.Skin infection generates nonmigratory memory CD8+T（RM） cells providing global skin immunity[J].Nature,2012,483（7388）；227-231.

[2]Gebhardt T,Wakim LM,Eidsmo L,et al.Memory T cells in nonlymphoid tissue that provide enhanced local immunity during infection with herpes simplex virus[J].Nat Immunol,2009,10（5）；524-530.

[3]Gebhardt T,Whitney PG,Zaid A,et al.Different patterns of peripheral migration by memory CD4+and CD8+T cells[J].Nature,2011,477（7363）；216-219.

[4]Wakim LM,Woodward-Davis A,Bevan MJ.Memory T cells persisting within the brain after local infection show functional adaptations to their tissue of residence[J].Proc Natl Acad Sci USA,2010,107（42）；17872-17879.

[5]Masopust D,Choo D,Vezys V,et al.Dynamic T cell migration program provides resident memory within intestinal epithelium[J].J Exp Med,2010,207（3）；553-564.

[6]Boyman O,Hefti HP,Conrad C,et al.Spontaneous development of psoriasis in a new animal model shows an essential role for resident T cells and tumor necrosis factor-alpha[J].J Exp Med,2004,199（5）；731-736.

[7]Nestle FO,Conrad C,Tun-Kyi A,et al.Plasmacytoid predendritic cells initiate psoriasis through interferon-alpha production[J].J Exp Med,2005,202（1）；135-143.

[8]黃瓊,韓凌,方栩,等.尋常性銀屑病患者外周血CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的功能研究[J].中華皮膚科雜志,2010,43（4）；251-255.

[9]陳珊宇,楊森,高昱,等.尋常型銀屑病皮膚中皮膚歸巢T細(xì)胞免疫組化研究[J].中華皮膚科雜志,2002,35（2）；91-93.

[10]El-Asady R,Yuan R,Liu K,et al.TGF-｛beta｝-dependent CD103 expression by CD8（+） T cells promotes selective destruction of the host intestinal epithelium during graft-versushost disease[J].J Exp Med,2005,201（10）；1647-1657.

[11]Nakayama T,Kasprowicz DJ,Yamashita M,et al.The generation of mature,single-positive thymocytesin vivois dysregulated by CD69 blockade or overexpression[J].J Immunol,2002,168（1）；87-94.

[12]Shiow LR,Rosen DB,Brdicková N,et al.CD69 acts downstream of interferon-alpha/beta to inhibit S1P1 and lymphocyte egress from lymphoid organs[J].Nature,2006,440（7083）；540-544.

[13]Bovenschen HJ,Vissers WH,Seyger MM,et al.Selective persistence of dermal CD8+T cells in lesional plaque psoriasis after clobetasol-17 propionate treatment[J].Acta Derm Venereol,2005,85（2）；113-117.

2014-02-05）

（本文編輯：顏艷）

Detection of tissue-resident memory T lymphocytes in patients with psoriasis

Luan Chao,Yang Yonghong,Wang Yan,Liu Yi,Chen Min,Jiang Mingjun,Wang Baoxi.Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs；Hospital of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

；Chen Min,Email；drchenmin@126.com

ObjectiveTo investigate the role of tissue-resident memory T lymphocytes in the pathogenesis of psoriasis.MethodsClinical information was collected from 32 patients with progressive plaque psoriasis.Tissue specimens were obtained from both lesional and nonlesional psoriatic skin of all the patients,as well as from faded lesions in 9 of these patients.Tissue specimens from the normal skin of 10 healthy individuals served as the controls.Immunohistochemical staining was performed to detect the two characteristic surface markers CD69 and CD103 on tissue-resident memory T lymphocytes and to analyze the status of these T lymphocytes at different stages of psoriasis.The results of immunohistochemical staining were compared byttest.ResultsThe mean number of CD69+CD103+T lymphocytes per high-power field was significantly higher in lesional skin than in nonlesional skin of the 32 patients（11.34±7.60 vs.2.72±4.20,t =8.46,P＜0.01）,but similar between psoriatic lesions in the 9 patients before and after subsidence（14.33±2.21 vs.12.00±4.58,t =1.98,P=0.08）.There was no significant difference in the mean number of CD69+CD103+T lymphocytes between nonlesional psoriatic skin and normal control skin（2.72±4.20 vs.1.70±2.98,t =0.71,P＞0.05）.ConclusionTissue-resident memory T lymphocytes may play a role in the formation and recurrence of psoriatic lesions in patients.

Psoriasis；Memory T lymphocyte,resident

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.011.009

衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費（201002016）

210042南京，中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院、江蘇省皮膚病與性病分子生物學(xué)重點實驗室

陳敏，Email：drchenmin@126.com