孔杰 孫毅娜 趙樂(lè)然 肖萌 王敬 李卓然 劉原君 劉全忠

D型沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白pgp3的克隆、表達(dá)、鑒定及其免疫原性初探

孔杰 孫毅娜 趙樂(lè)然 肖萌 王敬 李卓然 劉原君 劉全忠

目的獲得D型沙眼衣原體質(zhì)粒蛋白pgp3基因及其蛋白,并鑒定其免疫原性。方法 PCR擴(kuò)增目的基因,將其定向插入原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α,提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測(cè)序、PCR鑒定。再將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21并誘導(dǎo)表達(dá),Western印跡鑒定目的蛋白,谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)磁珠純化pgp3-GST融合蛋白。用純化后的蛋白免疫新西蘭家兔,Western印跡檢測(cè)抗體與pgp3蛋白的結(jié)合,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測(cè)定抗體效價(jià)。結(jié)果克隆目的基因序列長(zhǎng)度為795 bp,與基因庫(kù)中一致,Western印跡顯示目的蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為54 000,并得到純化蛋白。所得兔血清可識(shí)別pgp3蛋白,ELISA檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)達(dá)1∶25 600。結(jié)論成功表達(dá)具有強(qiáng)免疫原性的pgp3-GST融合蛋白,為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

衣原體,沙眼;pgp3蛋白;重組融合蛋白質(zhì)類;免疫法;疫苗,合成

越來(lái)越多的研究提示衣原體質(zhì)粒是衣原體的毒力因子[1],它能夠調(diào)節(jié)衣原體基因組基因的轉(zhuǎn)錄,在衣原體的致病過(guò)程中具有重要作用。在沙眼衣原體(Ct)各血清型中,該質(zhì)粒結(jié)構(gòu)高度相似,含有8個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF1-8)[2]。 Comanducci等[3-4]對(duì) B、D、L1、L2四種血清型的Ct質(zhì)粒核苷酸序列進(jìn)行了對(duì)比分析,結(jié)果顯示各血清型之間的變異率＜1%。由ORF5編碼的pgp3蛋白是Ct中唯一由質(zhì)粒編碼的分泌性蛋白,本研究對(duì)pgp3蛋白進(jìn)行分離和純化,并檢測(cè)其在動(dòng)物體內(nèi)的免疫原性,為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、質(zhì)粒、菌株及動(dòng)物

原核表達(dá)載體pGEX-6P-1由美國(guó)德克薩斯大學(xué)健康科學(xué)中心鐘光明教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。大腸埃希菌DH5α、BL21,PCR模板(Ct D型標(biāo)準(zhǔn)株基因組)由本實(shí)驗(yàn)室保存。健康雄性新西蘭家兔購(gòu)于天津?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中心。

二、試劑

BamH I、Not I內(nèi)切酶產(chǎn)自美國(guó) Fermentans公司;零背景快速連接試劑盒、小鼠抗谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶(GST)單克隆抗體產(chǎn)自天根生化科技(北京)有限公司;辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色液產(chǎn)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;硝酸纖維素膜產(chǎn)自美國(guó)Pall公司;GST磁珠產(chǎn)自美國(guó)GenScript生物科技有限公司;RIPA蛋白裂解液、3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)顯色液產(chǎn)自北京索萊寶科技有限公司;還原型谷胱甘肽(GSH)覆蓋的96孔酶標(biāo)板由美國(guó)德克薩斯州大學(xué)健康科學(xué)中心鐘光明教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。

三、pgp3基因擴(kuò)增

自行設(shè)計(jì)的引物含有BamH I和Not I酶切位點(diǎn),上游引物序列為5′-CGCGGATCCATGGGAAAT TCTGGTTTTTATTTG-3′, 下游引物序列為 5′-TTTTCCTTTTGCGGCCGCTTAAGCGTTTGTTTGAGG TATTA-3′。PCR反應(yīng)體系中含有上下游引物各1 μl,D 型標(biāo)準(zhǔn)株基因組 1 μl,PCR Mix 15 μl,DDW 12 μl。 擴(kuò)增條件為：95℃ 3 min;95℃ 1 min,65℃1 min,68℃ 1 min,35個(gè)循環(huán);72℃ 8 min。10 g/L瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行鑒定。

四、重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/pgp3的構(gòu)建

按說(shuō)明書(shū)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物連接到pZeroBack載體。用BamH I和Not I內(nèi)切酶分別雙酶切pZeroBack/pgp3和空質(zhì)粒pGEX-6P-1,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收酶切產(chǎn)物,用T4連接酶23℃作用2 h。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌DH5α,轉(zhuǎn)化后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行擴(kuò)增以提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切、測(cè)序、PCR鑒定,基因測(cè)序由天根生化科技(北京)有限公司完成,測(cè)序引物為5′-GGGCTGGCAAGCCAC GTTTGGTG-3′。

五、pgp3-GST融合蛋白的表達(dá)和鑒定[5]

選取構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸埃希菌BL21中,挑取BL21單克隆菌落進(jìn)行增量培養(yǎng),菌液加異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),終濃度為1 μmol/L,誘導(dǎo)表達(dá) 40 min。4 ℃、5 438× g離心4 min收集菌體,PBS重懸,加溶菌酶、Triton-X 100裂解后超聲破碎,4℃、12 235×g離心20 min后取上清進(jìn)行Western印跡以鑒定融合蛋白的表達(dá)。Western印跡所用一抗為小鼠抗GST抗體,濃度為1∶1 000;二抗為HRP標(biāo)記的羊抗小鼠IgG,濃度為1∶6 000,DAB顯色液顯色。

六、蛋白純化

取100 μl GST磁珠放入1.5 ml離心管中,PBS(pH7.4)洗滌3次后加入1 ml上述上清,連續(xù)振蕩1 h后PBS洗滌磁珠3次,加100 μl洗脫液(20 mmol/L GSH,0.05 mol/L Tris-Hcl,pH8.0)洗脫3次得到純化的目的蛋白。將純化蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western印跡鑒定。

七、免疫家兔[6]

選擇體重2.5 kg的雄性新西蘭家兔,用500 μg純化后的pgp3蛋白與等體積弗氏完全佐劑乳化混合,背部多點(diǎn)皮下注射進(jìn)行初次免疫。此后第2周、第4周取250 μg蛋白與弗氏不完全佐劑混合后經(jīng)相同途徑進(jìn)行免疫。第3次免疫后1周耳緣靜脈取血,所得血液于室溫靜置1 h后放于4℃冰箱過(guò)夜,4℃、825×g離心10 min,吸取上清分裝備用。

八、Western印跡檢測(cè)抗體與pgp3蛋白的結(jié)合

D型沙眼衣原體的培養(yǎng)見(jiàn)文獻(xiàn)[7],衣原體培養(yǎng)48 h后,棄培養(yǎng)液,PBS清洗6孔板3次,每孔加入含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液200 μl,冰上作用30 min后用細(xì)胞刮將貼壁的細(xì)胞刮下,用1.5 ml離心管收集孔內(nèi)全部液體,13 201×g離心10 min,收集管內(nèi)上清。所得上清做SDS-PAGE后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜,脫脂奶粉封閉后加抗體,一抗為兔血清(稀釋比例為1∶100),二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(稀釋比例為1∶3 000),DAB顯色液顯色。

九、ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)[8]

將未純化的pgp3蛋白稀釋后包被GSH覆蓋的96孔酶標(biāo)板。免疫后兔血清與BL21/pGEX-6P-1誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解液振蕩混合1 h后倍比稀釋作為一抗,二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG,濃度為1∶5 000。設(shè)置正常兔血清為一抗的陰性對(duì)照組和PBS為一抗的空白對(duì)照組。TMB顯色,顯色終止后酶標(biāo)儀讀取吸光度(A)450值,當(dāng)(標(biāo)本A值-空白A值)/(陰性對(duì)照A值-空白A值)≥2.1時(shí)判定為陽(yáng)性。

結(jié) 果

一、pgp3基因的擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增出單一特異性條帶,與pgp3基因(795 bp)大小一致,見(jiàn)圖1a。

圖1 pgp3基因的擴(kuò)增和重組質(zhì)粒的鑒定 1a：pgp3基因的PCR擴(kuò)增結(jié)果 1：標(biāo)準(zhǔn)參照物;2,3：PCR產(chǎn)物;1b：重組質(zhì)粒pZeroBack/pgp3的酶切鑒定 1：酶切產(chǎn)物;2：標(biāo)準(zhǔn)參照物;1c：重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/pgp3的酶切鑒定 1：pGEX-6P-1/pgp3酶切產(chǎn)物;2：空質(zhì)粒pGEX-6P-1酶切產(chǎn)物;3：標(biāo)準(zhǔn)參照物;1d：重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/pgp3中pgp3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 1：標(biāo)準(zhǔn)參照物,2：PCR產(chǎn)物

二、重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒pZeroBack/pgp3經(jīng)BamH I內(nèi)切酶和Not I內(nèi)切酶雙酶切后電泳顯示兩條片段分別與載體(2 974 bp)和目的基因(795 bp)大小一致,見(jiàn)圖1b。重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/pgp3經(jīng)BamH I和Not I內(nèi)切酶雙酶切后,瓊脂糖凝膠電泳顯示酶切后的兩個(gè)片段分別位于相當(dāng)于載體(4 984 bp)和目的基因(795 bp)大小的位置,空質(zhì)粒pGEX-6P-1酶切后僅有一條帶,見(jiàn)圖1c。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)pgp3基因序列與GeneBank中一致。同時(shí)以重組質(zhì)粒為模版進(jìn)行PCR擴(kuò)增,產(chǎn)物為單一清晰條帶,與pgp3基因大小一致,見(jiàn)圖1d。

三、pgp3-GST融合蛋白的表達(dá)和鑒定結(jié)果

經(jīng)測(cè)序鑒定含有重組質(zhì)粒pGEX-6P-1/pgp3的BL21的菌液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達(dá),獲取菌體沉淀,裂解后取可溶性蛋白進(jìn)行Western印跡分析,在相對(duì)分子質(zhì)量為54 000的位置有一條特異性條帶,空質(zhì)粒BL21/pGEX-6P-1和空菌BL21中均沒(méi)有此條帶;空質(zhì)粒BL21/pGEX-6P-1在相對(duì)分子質(zhì)量26 000位置附近出現(xiàn)GST表達(dá)條帶,重組質(zhì)粒和空菌BL21中均無(wú)此條帶,見(jiàn)圖2。

四、蛋白純化結(jié)果

采用GST磁珠純化目的蛋白,SDS-PAGE顯示單一目的條帶,Western印跡證實(shí)其為pgp3-GST融合蛋白,見(jiàn)圖3。

五、Western印跡檢測(cè)多克隆抗體結(jié)果

提取D型沙眼衣原體總蛋白,充分變性后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜,檢測(cè)兔血清中pgp3抗體。衣原體總蛋白在相對(duì)分子質(zhì)量為26 000附近出現(xiàn)清晰條帶,見(jiàn)圖4。

六、抗體效價(jià)檢測(cè)結(jié)果

用未純化的pgp3蛋白包被覆蓋GSH的96孔酶標(biāo)板,間接ELISA法檢測(cè)多克隆抗體效價(jià)為 1∶25 600。

圖2 pgp3-GST融合蛋白的Western印跡鑒定 1：標(biāo)準(zhǔn)參照物;2：pgp3-GST 融合蛋白;3：BL21/pGEX-6P-1 表達(dá)產(chǎn)物;4：大腸埃希菌BL21表達(dá)產(chǎn)物

討 論

由Ct引起的泌尿生殖道感染是世界范圍內(nèi)最流行的性傳播疾病之一,其發(fā)病隱匿,反復(fù)遷延,持續(xù)的感染會(huì)導(dǎo)致女性盆腔炎癥、宮外孕和輸卵管性不孕,導(dǎo)致男性尿道炎和附睪炎。但是Ct的致病機(jī)制尚未明確,致病菌檢出率低,抗生素耐藥現(xiàn)象日益突出。本研究制備了在Ct致病過(guò)程中可能具有重要作用的基因及其抗體,為探索Ct致病機(jī)制及改進(jìn)目前的診斷和治療方法提供一定的線索。

Ct質(zhì)粒編碼8種蛋白,其中7種只存在于包涵體中,pgp3則能夠分泌到宿主細(xì)胞的胞質(zhì)中[1]。pgp3蛋白在衣原體感染宿主細(xì)胞12 h便可檢測(cè)出,這種現(xiàn)象存在于所有種類的衣原體[9],推測(cè)pgp3蛋白對(duì)于衣原體在宿主細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)發(fā)育具有重要作用。衣原體在包涵體內(nèi)進(jìn)行代謝及復(fù)制,分泌到宿主細(xì)胞質(zhì)的蛋白可能是聯(lián)系衣原體和宿主細(xì)胞的媒介,因此構(gòu)建表達(dá)Ct分泌蛋白對(duì)于推進(jìn)Ct與宿主細(xì)胞相互作用的研究有一定的意義。

圖3 純化pgp3-GST融合蛋白的鑒定 3a：十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)鑒定1：標(biāo)準(zhǔn)參照物;2：純化蛋白;3b：Western印跡鑒定 1：標(biāo)準(zhǔn)參照物;2：純化蛋白 圖4 Western印跡檢測(cè)多克隆抗體 1：標(biāo)準(zhǔn)參照物;2：沙眼衣原體總蛋白

用感染Ct的女性患者的抗體與8種質(zhì)粒蛋白作用,所有的蛋白均可被至少一個(gè)抗體標(biāo)本所識(shí)別,說(shuō)明人體感染Ct后8種質(zhì)粒蛋白均可表達(dá)[10],進(jìn)而說(shuō)明質(zhì)粒在Ct感染人體時(shí)有一定的作用。Pgp3抗體普遍存在于Ct泌尿生殖道感染患者血清中[11],具有很高的敏感性和特異性,這些特點(diǎn)為沙眼衣原體的血清學(xué)檢測(cè)及保護(hù)性免疫研究提供了線索,因此制備動(dòng)物源性抗體有助于推進(jìn)Ct診斷方法的改進(jìn)和相關(guān)疫苗的研制。Li等[12]構(gòu)建出pgp3的DNA疫苗,用其免疫Ct感染小鼠模型,發(fā)現(xiàn)接種疫苗組比對(duì)照組的小鼠輸卵管病理變化明顯減輕。

本研究采用的目的基因載體pGEX-6P-1帶有GST-標(biāo)簽,GST為常用的可溶性蛋白標(biāo)簽,pgp3為分泌蛋白因此pGEX有助于它的可溶性表達(dá)。此外,GST可與GSH共價(jià)結(jié)合,利用這種特性可將pgp3-GST融合蛋白快速純化。本研究采用GSH覆蓋的96孔酶標(biāo)板做ELISA,GSH可結(jié)合菌體裂解蛋白中GST,從而使pgp3-GST融合蛋白特異地結(jié)合到酶標(biāo)板。同時(shí),兔血清與BL21/pGEX-6P-1誘導(dǎo)表達(dá)后的菌體裂解液充分混合,血清中的GST抗體可與pGEX-6P-1表達(dá)的大量GST充分結(jié)合,從而避免了GST抗體對(duì)pgp3抗體滴度的影響。采用純化后的蛋白免疫家兔,獲得高效價(jià)的抗體,證實(shí)該蛋白具有良好的免疫原性。

[1]Chen D，Lei L，Lu C，et al.Characterization of pgp3，aChlamydiatrachomatisplasmid-encoded immunodominant antigen[J].J Bacteriol，2010，192(22):6017-6024.

[2]Galaleldeen A，Taylor AB，Chen D，et al.Structure of theChlamydia trachomatisimmunodominant antigen pgp3[J].J Biol Chem，2013，288(30):22068-22079.

[3]Comanducci M，Ricci S，Cevenini R，et al.Diversity of theChlamydia trachomatiscommon plasmid in biovars with different pathogenicity[J].Plasmid，1990，23(2):149-154.

[4]Comanducci M，Cevenini R，Moroni A，et al.Expression of a plasmid gene ofChlamydia trachomatisencoding a novel 28 kDa antigen[J].J Gen Microbiol，1993，139(5):1083-1092.

[5] 李燕，劉原君，盛彩虹，等.沙眼衣原體多形外膜蛋白PmpG的克隆、表達(dá)、純化及鑒定[J].中華皮膚科雜志，2010，43(8):568-571.

[6] 劉原君，盛彩虹，劉勇，等.E型沙眼衣原體主要外膜蛋白多克隆抗體的制備、鑒定和初步應(yīng)用[J].中華傳染病雜志，2011，29(5):257-260.

[7] 邵麗麗，楊曉靜，楊麗娜，等.多次傳代培養(yǎng)提高沙眼衣原體泌尿生殖道感染的檢出率[J].中華皮膚科雜志，2010，43(2):129-130.

[8]Sharma J，Zhong Y，Dong F，et al.Profiling of human antibody responses toChlamydia trachomatisurogenital tract infection using microplates arrayed with 156 chlamydial fusion proteins[J].Infect Immun，2006，74(3):1490-1499.

[9]Li Z，Chen D，Zhong Y，et al.The Chlamydial plasmid-encoded protein pgp3 is secreted into the cytosol ofChlamydia-infectedcells[J].Infect Immun，2008，76(8):3415-3428.

[10]Li Z，Zhong Y，Lei L，et al.Antibodies from women urogenitally infected withC.trachomatispredominantly recognized the plasmid protein pgp3 in a conformation-dependent manner[J].BMC Microbiol，2008，8:90.

[11]Comanducci M，Manetti R，Bini L，et al.Humoral immune response to plasmid protein pgp3 in patients withChlamydia trachomatisinfection[J].Infect Immun，1994，62(12):5491-5497.

[12]Li ZY，Wang SP，Wu YM，et al.Immunization with hlamydial plasmid protein pORF5 DNA vaccine induces protective immunity against genital chlamydial infection in mice[J].Sci China C Life Sci，2008，5l(11):973-980.

2013-06-13)

(本文編輯：尚淑賢)

Plasmid-encoded pgp3 protein ofChlamydia trachomatisserovar D:cloning,expression,identification,and evaluation of immunogenicity

Kong Jie*，Sun Yina，Zhao Leran，Xiao Meng，Wang Jing，Li Zhuoran，Liu Yuanjun，Liu Quanzhong.*Department of Dermatology and Venereology，Tianjin Medical University General Hospital，Tianjin 300052，China

Liu Yuanjun，Email:Liuyuanjun1980@126.com

ObjectiveTo express and identify the plasmid-encoded pgp3 protein ofChlamydia trachomatis(Ct)serovar D，and to evaluate its immunogenicity.MethodsThe pgp3 gene of Ct serovar D was amplified by PCR and directly inserted into the prokaryotic expression plasmid vector pGEX-6P-1 through the pZeroBack vector.Then，the recombinant plasmid pGEX-6P-1/pgp3 was transformed intoE.coliDH5α followed by enzymatic digestion，sequencing and PCR identification.After the identification，the recombinant plasmid was transformed intoE.coliBL21 followed by isopropyl-β-D-thiogalactoside(IPTG)induction.The expressed protein was identified by Western blot，and purified by glutathione S-transferase(GST)MagBeads.Male New Zealand rabbits were immunized with the purified protein for three times.Blood samples were collected from these rabbits one week after the last immunization and subjected to the qualification and quantification of anti-pgp3 polyclonal antibodies by Western blot and enzymelinked immunosorbent assay(ELISA)respectively.ResultsThe length of the cloned gene was 795 bp，which was consistent with the sequence of the pgp3 gene in GenBank.The recombinant fusion protein，whose relative molecular weight was 54 000，was successfully purified.The serum of immunized rabbits could react with the pgp3 protein，with the titer of anti-pgp3 polyclonal antibodies being 1 ∶25 600.ConclusionsThe pgp3-GST fusion protein with high immunogenicity is successfully expressed and purified，which may lay a foundation for further studies.

Chlamydia trachomatis;Protein，pgp3;Recombinant fusion proteins;Immunization;Vaccines，synthetic

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.008

國(guó)家自然科學(xué)基金(31100138、30901460、30671879)

300052天津醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院皮膚性病科(孔杰、趙樂(lè)然、肖萌、王敬、李卓然、劉原君、劉全忠);天津醫(yī)科大學(xué)代謝病醫(yī)院內(nèi)分泌研究所(孫毅娜)

劉原君,Email：Liuyuanjun1980@126.com