徐良恒 顧華 郭美華 劉海洋 劉付華 涂穎 龐勤 何黎

透明質(zhì)酸對BALB/c小鼠激光損傷后皮膚屏障功能修復(fù)的研究

徐良恒 顧華 郭美華 劉海洋 劉付華 涂穎 龐勤 何黎

目的探討透明質(zhì)酸敷料促進(jìn)BALB/c小鼠皮膚激光損傷后皮膚屏障修復(fù)的作用。方法36只清潔級雌性BALB/c小鼠均分為3組,每只小鼠用脫毛膏兩側(cè)背部脫毛后,用Q開關(guān)1064激光機(jī),頻率5 Hz,光斑3 mm,能量6 J的激光照射脫毛區(qū)后,每組分別外用基質(zhì)、基質(zhì)+膠原蛋白、基質(zhì)+透明質(zhì)酸于小鼠一側(cè)背部,另一側(cè)不做處理(陰性對照)。分別于6 h,24 h,7 d,21 d測試每只小鼠背部皮膚生理功能,并取每組3只小鼠皮損處皮膚做增殖細(xì)胞核抗原染色。結(jié)果與基質(zhì)組和陰性對照比較,于第7天,基質(zhì)+膠原蛋白組,基質(zhì)+透明質(zhì)酸組經(jīng)表皮失水量值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),角質(zhì)層含水量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)較強(P＜0.05)。24 h、1 d、21 d組間經(jīng)表皮失水量、角質(zhì)層含水量及增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)強度差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),第21天各組與造模前比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。各組小鼠皮膚屏障功能恢復(fù)正常。結(jié)論透明質(zhì)酸敷料能促進(jìn)BALB/c小鼠激光術(shù)后皮膚屏障功能修復(fù),與膠原蛋白敷料作用相當(dāng)。

激光;透明質(zhì)酸;敷料,水膠體;皮膚,屏障;動物實驗

隨著醫(yī)學(xué)激光技術(shù)的發(fā)展,激光被大量運用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,過去許多難治性的損容性皮膚病得到了很好的治療,但在治療過程中,激光的熱效應(yīng)及其他相關(guān)生物學(xué)效應(yīng)會導(dǎo)致皮膚皮脂膜、皮膚“磚墻結(jié)構(gòu)”等損害,不同程度地破壞皮膚的正常結(jié)構(gòu),導(dǎo)致皮膚屏障功能破壞[1]。激光術(shù)后常用冰敷術(shù)區(qū)降低皮膚水腫及不適,莫匹羅星軟膏等外搽預(yù)防感染,但缺少一種能促進(jìn)激光術(shù)后皮膚屏障恢復(fù)的產(chǎn)品。因此,本實驗旨在觀察透明質(zhì)酸敷料對BALB/c小鼠激光術(shù)后皮膚屏障的修復(fù)效果,為臨床應(yīng)用提供參考依據(jù)。

材料與方法

一、試劑與儀器

儀器：美國HoYa-ConBio公司型號Medlite C6的激光儀,系Q開關(guān)1064 nm激光機(jī)。增殖細(xì)胞核抗原抗體(ab18197，1∶800),偶聯(lián)辣根過氧化物酶的二抗及DAB顯色劑(EnVision TM system)均購自丹麥Dako公司。

二、動物分組

清潔級雌性BALB/c小鼠40只,6周齡,平均體重(20±2)g,購自北京衛(wèi)通利華實驗動物技術(shù)有限公司,動物合格證號scxk(京)2012-0001。小鼠用人用脫毛膏兩側(cè)背部脫毛,約2 cm×2 cm區(qū)域。48 h后,取4只小鼠分別在脫毛處用Q開關(guān)1064激光機(jī),頻率5 Hz,光斑3 mm,能量分別為4 J、5 J、6 J、7 J的激光照射脫毛區(qū)。6 h后觀察小鼠皮損處發(fā)紅,水腫,結(jié)痂情況,并處死小鼠取皮損處皮膚做HE染色,選取皮膚外觀有發(fā)紅,水腫,表皮及真皮淺層較多炎癥細(xì)胞浸潤的能量6 J作為造模能量。用6 J的能量在脫毛48 h后的36只小鼠兩側(cè)背部造成激光術(shù)后皮膚模型,將小鼠分為基質(zhì)組,基質(zhì)+膠原蛋白(相對分子質(zhì)量 ＜1 000,濃度為2%)組,基質(zhì)+透明質(zhì)酸(相對分子質(zhì)量1 300 000,濃度0.2%)組,每組12只。

三、治療

激光術(shù)后敷料(膏劑)均由昆明滇虹藥業(yè)有限公司生產(chǎn),滇妝生衛(wèi)字(2011)0005號。每組小鼠選擇一側(cè)背部外用對應(yīng)敷料,每只每次100 μl,一天兩次,另一側(cè)背部則不做處理(陰性對照)。造模后每周脫毛1次,于造模6 h,1 d,7 d,21 d每組處死3只小鼠并分別取處理側(cè)及對照側(cè)背部皮損。

四、方法

1.無創(chuàng)性皮膚測試：分別于造模前,造模后,造模6 h,1 d,7 d,21 d(測試前一天脫毛)測試小鼠兩側(cè)背部皮膚經(jīng)表皮失水量(TEWL)及表皮含水量。所有檢測均在室溫為23～25℃,濕度為50%～60%的室內(nèi)進(jìn)行,每次在同一部位測量3次,取平均值。用TewameterTM儀(德國Courega+Khazaka公司)測量表皮 TEWL 值(g·h-1·cm-2),Moisture checker儀(日本Scalar公司)測量表皮含水量。

2.增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)檢測：4%甲醛固定,石蠟包埋,切片后脫蠟,用3%過氧化氫室溫孵育10 min后,用0.01 mol/L枸櫞酸鈉抗原修復(fù)液,高壓法抗原修復(fù)5 min后,用5%封閉用綿羊血清封閉30 min。加一抗,4℃過夜。加二抗,37℃孵育30 min。各步驟間均以PBS漂洗3次,每次5 min,DAB顯色后脫水,透明、封片。光鏡下觀察增殖細(xì)胞核抗原陽性表達(dá)率。陽性物質(zhì)呈棕黃色顆粒狀,主要位于細(xì)胞核,參考文獻(xiàn)[2-3]方法：觀察基底層60個高倍視野(每個標(biāo)本隨機(jī)觀察5個視野)。染色強度評分：0分為無色,1分為細(xì)胞染色呈淺黃色(輕度),2分為細(xì)胞染色呈黃色(中度),3分為細(xì)胞染色呈棕褐色(重度)。以陽性細(xì)胞百分率來判定,無陽性細(xì)胞表達(dá)計0,陽性細(xì)胞數(shù)為l%～25%計1分,陽性細(xì)胞數(shù)為26%～50%計2分,陽性細(xì)胞數(shù)為51%～75%計3分,陽性細(xì)胞數(shù)為75%～100%計4分。上面兩項相加為分級標(biāo)準(zhǔn)：陰性計0～1分,弱陽性(+)計2～3分,陽性(++)計4～5分,強陽性(+++)計6～7分。由病理科醫(yī)師連續(xù)讀片。

3.統(tǒng)計方法：無創(chuàng)性皮膚測試結(jié)果用單因素方差分析ANOVA;增殖細(xì)胞核抗原的表達(dá)用秩和檢驗及χ2檢驗,相關(guān)分析用Spearman等級相關(guān)分析法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、無創(chuàng)性皮膚測試

6 h,1 d,7 d,21 d,每組小鼠做無創(chuàng)性皮膚生理功能測試,相同時間點每組間相互比較,基質(zhì)組與陰性對照間,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),第7天,基質(zhì)+膠原蛋白組與基質(zhì)+透明質(zhì)酸組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義,兩組與基質(zhì)組間差異統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。見表1,2。

二、增殖細(xì)胞核抗原

增殖細(xì)胞核抗原主要位于細(xì)胞核,皮膚陽性反應(yīng)部位主要以基底層為主,細(xì)胞核染為棕黃色。比較每組相同時間點組間增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)強弱。于第7天,基質(zhì)+膠原蛋白組與基質(zhì)+透明質(zhì)酸組增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)強度增強。見圖1。

討 論

敷料能與創(chuàng)面緊密粘連,為創(chuàng)面提供濕潤,低氧/無氧、微酸,酶學(xué)清創(chuàng)的愈合環(huán)境,與局部應(yīng)用的藥物和機(jī)體內(nèi)源性分子相作用,促進(jìn)傷口愈合[4]。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid,HA)是一種廣泛分布于人和動物體內(nèi)的大分子酸性黏多糖,能調(diào)節(jié)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞[5],促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、調(diào)控膠原合成、抗炎等作用[6],外用能調(diào)節(jié)傷口過度收縮,減少瘢痕形成[7],能在表皮形成水化膜,保持皮膚水分,加強和維持角質(zhì)層吸水能力及屏障功能。在劉付華等[8]的臨床觀察證實,透明質(zhì)酸修護(hù)生物膜具有恢復(fù)皮膚屏障的功能和良好的保濕作用。膠原蛋白有引導(dǎo)上皮細(xì)胞遷入缺損區(qū)的能力,還可誘導(dǎo)產(chǎn)生趨化因子如血小板生長因子和纖維連接蛋白等,從而對細(xì)胞的生長有趨化作用,與皮膚損傷的修復(fù)密切相關(guān)。膠原蛋白貼敷料提供了皮膚潮濕、微酸性的微環(huán)境,在皮膚科有廣泛的應(yīng)用[9]。臨床也常將膠原蛋白貼敷料用于激光術(shù)后,促進(jìn)創(chuàng)面愈合,恢復(fù)皮膚屏障功能,楊斌等[10]運用膠原蛋白貼敷料配合微晶磨疤機(jī)及激光、光子的治療取得較好的臨床效果。

表1 各組小鼠皮膚含水量(x±s)%

表2 各組小鼠皮膚經(jīng)表皮失水量值(x±s)g·h-1·cm-2

圖1 實驗第7天,小鼠皮膚增殖細(xì)胞核抗原染色(細(xì)胞核染色),基質(zhì)+膠原蛋白組與基質(zhì)+透明質(zhì)酸組表皮較陰性對照與基質(zhì)組厚,增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)較兩對照組強(免疫組化×200) 1a：陰性對照組;1b：基質(zhì)組;1c：基質(zhì)+膠原蛋白;1d：基質(zhì)+透明質(zhì)酸

本實驗構(gòu)建了激光術(shù)后真皮淺層損傷、皮膚屏障破壞的小鼠動物模型,分別觀察了外用敷料基質(zhì),基質(zhì)+膠原蛋白,基質(zhì) +透明質(zhì)酸對皮膚屏障修復(fù)情況。皮膚屏障保持皮膚的水分,維持正常的生理功能,激光術(shù)后皮膚屏障損傷。TEWL測定的是通過皮膚擴(kuò)散入外界環(huán)境的水分,是反映皮膚屏障功能的一個重要參數(shù),可反映出皮膚屏障損傷程度,其值越高表示皮膚屏障受損越嚴(yán)重,角質(zhì)層含水量可反映皮膚屏障功能,兩指標(biāo)用于評價皮膚屏障修復(fù)情況[11]。6 h、24 h各組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。于第7天,基質(zhì)+膠原蛋白組與基質(zhì)+透明質(zhì)酸組皮膚含水量較基質(zhì)組與陰性對照高,TEWL值較其低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05),而兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。證明其能促進(jìn)皮膚屏障功能修復(fù),第21天,各組與造模前比較,角質(zhì)層含水量及TEWL值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05),小鼠屏障功能恢復(fù)。增殖細(xì)胞核抗原[12]又稱細(xì)胞周期蛋白或周期素,是一種相對分子質(zhì)量36 000、酸性、無組蛋白的細(xì)胞核多肽,是真核細(xì)胞DNA合成所必需的一種核蛋白,它的表達(dá)合成與增殖細(xì)胞的增殖周期有關(guān),是DNA聚合酶的輔助蛋白,參與調(diào)節(jié)DNA的合成,是DNA復(fù)制過程中所必需的。增殖細(xì)胞核抗原可作為細(xì)胞增殖的特異性標(biāo)記,反映細(xì)胞的增殖活性。第7天,外用透明質(zhì)酸敷料組與膠原蛋白敷料組角質(zhì)層較對照組厚,增殖細(xì)胞核抗原表達(dá)增強,證明其對皮膚屏障修復(fù)有促進(jìn)作用。

本實驗通過構(gòu)建BALB/c小鼠激光術(shù)后皮膚動物模型并外用透明質(zhì)酸敷料與膠原蛋白敷料進(jìn)行對比觀察,證實了透明質(zhì)酸敷料能促進(jìn)激光術(shù)后皮膚屏障恢復(fù),作用與臨床廣泛使用的膠原蛋白敷料相當(dāng)。

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2013-07-18)

(本文編輯：吳曉初)

Restoring effect of hyaluronic acid on impaired skin barrier function in BALB/c mice after laser irradiation

Xu Liangheng*，Gu Hua，Guo Meihua，Liu Haiyang，Liu Fuhua，Tu Ying，Pang Qin，He Li.*First Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Collaborative Innovation Center of Yunnan Province,Engineering and Technology Research Center of Yunnan Province,Kunming 650032，China

He Li，Email:heli2662@hotmail.com

ObjectiveTo evaluate the restoring effect of dressings containing hyaluronic acid on impaired skin barrier function in BALB/c mice after laser irradiation.MethodsThe back of 63 BALB/c female mice were shaved with depilatory cream followed by exposure to Q-switched 1064-laser(frequency，5 Hz;light spot，3 mm;energy，6 J).Then，the mice were randomly and equally divided into three groups to be topically treated with dressings containing vehicle，vehicle+collagen protein and vehicle+hyaluronan acid respectively twice a day for 21 days.The dressings were only applied at one side of the back of these mice，and the other side was left untreated to serve as a negative control.Skin physiological parameters were measured on the back of these mice at 6 hours，24 hours，7 days，and 21 days after the beginning of treatment，and 3 mice were sacrificed in each group at every time points.Skin tissue specimens were obtained from the back of sacrificed mice followed by immunohistochemistry for the detection of proliferating cell nuclear antigen(PCNA).ResultsOn the 7th day，the vehicle+collagen protein group and vehicle+hyaluronan acid group showed lower TEWL values((13.9±0.9)and(12.6±0.6)vs.(18.4±0.4)and(18.4 ± 0.5)g·h-1·cm-2，allP＜ 0.05)，but increased water content in stratum corneum(33.6% ± 0.1%and 33.7%±0.1%vs.25.4%±0.2%and 26.5%±1.3%，allP＜0.05)and PCNA expression compared with the vehicle group and negative control group(side).However，no significant difference was observed between these groups in any of the above parameters at 24 hours，1 day，or 21 days after the beginning of treatment(allP＞ 0.05).Additionally，all the parameters returned to the preirradiation levels on the 21stday in all the three groups(allP＞0.05)with the recovery of skin barrier function.ConclusionsThe effects of dressings containing collagen protein and those containing hyaluronic acid are comparable on the restoration of impaired skin barrier function in BALB/c mice after laser irradiation.

Laser;Hyaluronic acid;Bandages，hydrocolloid;Skin，barrier;Animal experimentation

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.05.011

教育部2013年度“創(chuàng)新團(tuán)隊發(fā)展計劃”(IRT13067);云南省衛(wèi)生高層次人才培養(yǎng)計劃(L-201211)

650032昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院、云南省協(xié)同創(chuàng)新中心、云南省工程技術(shù)研究中心(徐良恒、顧華、劉付華、涂穎、何黎);昆明醫(yī)科大學(xué)(郭美華);中國科學(xué)院昆明植物研究所(劉海洋);昆明薇諾娜皮膚醫(yī)療美容中心(龐勤)

何黎,Email：heli2662@hotmail.com