張小婷 李水鳳 趙瑩 葉艷婷 戚世玲 楊雨清 曹慧 章星琪

斑禿皮損內(nèi)朗格漢斯細(xì)胞及CD8+T細(xì)胞的數(shù)量及分布分析

張小婷 李水鳳 趙瑩 葉艷婷 戚世玲 楊雨清 曹慧 章星琪

目的探討斑禿患者脫發(fā)皮損中朗格漢斯細(xì)胞在斑禿病理進(jìn)程中的分布以及與T細(xì)胞的關(guān)系。方法對29例斑禿患者(活動(dòng)期16例,非活動(dòng)期13例)頭皮脫發(fā)皮損進(jìn)行CD1a免疫組化染色,對其中17例斑禿患者行CD4、CD8免疫組化染色。熒光半定量PCR測定局部皮損淺層和深層CD1a和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果斑禿患者表皮和真皮各處包括真皮淺層血管周圍、毛囊周圍,真皮深層血管周圍、毛囊周圍CD1a陽性LC數(shù)量均較健康對照顯著增加(Z=4.354,2.884,4.640,3.217,3.496,均P＜0.01),活動(dòng)期皮損表皮層、深層血管、深層毛囊CD1a陽性LC數(shù)量較非活動(dòng)期皮損高(Z=2.457,2.130,1.954,P≤0.05)。斑禿患者CD1a、GM-CSF mRNA相對表達(dá)量在皮損真皮淺層雖與健康對照無差異,但在深層均高于健康對照(Z=2.702,2.941,均P＜0.01)。斑禿患者淺層血管周圍LC與深層毛囊周圍CD8+T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.618,P＜0.05),活動(dòng)組淺層血管周圍LC與深層毛囊周圍CD8+T細(xì)胞數(shù)量分布呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.795,P=0.01),非活動(dòng)組淺層血管周LC與深層毛囊周圍CD8+T細(xì)胞數(shù)量分布則無相關(guān)關(guān)系。結(jié)論斑禿患者皮損LC數(shù)量增加,且在活動(dòng)期皮損升高更明顯?；顒?dòng)期斑禿皮損中淺層血管周圍LC與深層毛囊周圍CD8+T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān),推測LC在斑禿疾病進(jìn)展中發(fā)揮作用。

斑禿;郎格漢斯細(xì)胞;T淋巴細(xì)胞;CD1a蛋白

朗格漢斯細(xì)胞(LC)是來源于骨髓的免疫細(xì)胞,CD1a蛋白是其主要的細(xì)胞表面標(biāo)志分子。研究顯示,粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞刺激因子(GM-CSF)可以促進(jìn)CD1a的轉(zhuǎn)錄和翻譯,促進(jìn)和維持CD1a在表皮微環(huán)境中的表達(dá)［1］,并和其他因素一起促進(jìn)骨髓細(xì)胞分化成LC。我們研究LC在斑禿中的浸潤特征,CD1a和GM-CSF mRNA在斑禿皮損中的表達(dá),以期了解該細(xì)胞在斑禿皮損中的分布特點(diǎn),并對CD4+、CD8+T細(xì)胞進(jìn)行免疫染色并分析與CD1a分布的關(guān)系,從而了解LC和斑禿發(fā)病的關(guān)系。

對象與方法

一、對象

我院脫發(fā)?？?008年10月至2012年10月就診的3個(gè)月內(nèi)無外用或系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素及其他藥物的29例斑禿患者,其中女16例,男13例,男女比例為0.8∶1;年齡6～52歲,平均(26.86±11.934)歲;發(fā)病年齡為6～52歲,平均(24.76±12.543)歲;病程6～120個(gè)月,平均(24.74±34.81)個(gè)月。脫發(fā)面積 1% ～ 100%(根據(jù) Olsen/Canfield評分)［2］, 平均(54.03±37.320)%。其中斑片型12例(41.4%),彌漫型 6 例(20.7%),亞全禿/全禿/普禿型 11 例(37.9%)。特應(yīng)性病史(包括過敏性鼻炎、哮喘、濕疹等)8例(27.6%),有自身免疫疾病家族史1例,有斑禿家族史2例,甲改變9例。根據(jù)拉發(fā)試驗(yàn)分為活動(dòng)組(13例)和非活動(dòng)組(16例),特應(yīng)性疾病組(8例)和非特應(yīng)性疾病組(21例)。本研究經(jīng)中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者簽署知情同意書。

同時(shí)進(jìn)行血清學(xué)檢查(血細(xì)胞計(jì)數(shù)、IgE水平)及頭皮病理活檢。頭皮取材方法:取斑禿患者頭皮皮損邊緣或?qū)φ战M0.8 cm×1.0 cm組織,含完整毛囊結(jié)構(gòu),深及脂肪層。對照組織來自本院外科及皮膚科頭皮手術(shù)所取皮疹邊緣正常頭皮,健康對照組均無脫發(fā)表現(xiàn)。將頭皮組織分為兩部分,一部分用4%甲醛固定后用特定方法進(jìn)行包埋制片,另一部分在皮脂腺水平離斷為頭皮淺層和深層,分別提取RNA。

二、CD1a+、CD4+、CD8+細(xì)胞免疫組化染色

按照說明書操作。以試劑公司提供的陽性切片為陽性對照,以磷酸鹽緩沖液(PBS)代替一抗作為陰性對照。對29例斑禿患者及13例健康對照(美容除皺手術(shù)患者)行CD1a(1∶200,美國RD Systems公司)免疫組化染色;并對13例斑禿患者行CD4(1∶50,北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)、CD8(1∶200,美國Epitomics-an Abcam公司)免疫組化染色。兩位研究者分別對陽性結(jié)果進(jìn)行判定:以皮脂腺水平為界分為淺層和深層,分別計(jì)數(shù)淺層血管和淺層毛囊包括皮脂腺水平以上毛囊表皮、毛囊周圍以及皮脂腺陽性細(xì)胞數(shù),深層血管和深層毛囊包括皮脂腺水平以下毛囊上皮、毛囊周圍CD1a陽性細(xì)胞數(shù)。每例患者計(jì)數(shù)病理片中5個(gè)陽性率最高的高倍鏡視野(×400)并取其平均數(shù)。

三、熒光半定量 PCR檢測 CD1a、GM-SCF mRNA表達(dá)水平

引物設(shè)計(jì):CD1a用德國Qiagen公司設(shè)計(jì)引物CATALOG NO：QT0000840;GM-CSF 用德國 Qiagen公司設(shè)計(jì)引物CATALOG NO：QT01676962。內(nèi)參照為β肌動(dòng)蛋白,上游引物5'-CTAAGTCATAGTCCG CCTAGAAGCA-3',下游引物5'-TGGCACCCAGCA CAATGAA-3'。斑禿患者及健康對照頭皮在解剖顯微鏡下分為淺層(纖維組織)和深層(脂肪組織),分離出的斑禿患者纖維組織和脂肪組織參照Qiagen試劑盒步聚提取總RNA,按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DDR037A)逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。反應(yīng)條件如下:37℃15 min,85℃15 s,cDNA-20℃保存。CDNA的擴(kuò)增反應(yīng)體系及條件儀器為Bio-Rad iQ5,使用Takara試劑盒［00041A,寶生物工程(大連)有限公司］,反應(yīng)體 系 20 μl:SYBR Premix Ex Taq 酶 10 μl,Rox Reference DYE 0.4 μl,dH2O 6.2 μl,1.8 μl DNA 模板,上下游引物各0.8 μl;反應(yīng)條件:預(yù)變性 95℃1 min,95℃5 s、62℃1min,共40個(gè)循環(huán),95℃1 min,65℃30 s,72℃15 s,1個(gè)循環(huán)。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

相關(guān)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,組間均值比較用非參數(shù)Mann Whitney U檢驗(yàn),連續(xù)數(shù)據(jù)的組間相關(guān)關(guān)系用Pearson correlation分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、LC的分布特點(diǎn)

1.正常頭皮LC分布:正常頭皮毛囊皮脂腺中LC主要分布于表皮和毛囊上部,包括漏斗部、皮脂腺導(dǎo)管和腺上皮,其分布密度類似于表皮(圖1,表1)。而毛囊下部LC數(shù)量減少,且主要見于其上段的隆突部附近,毛球部幾乎看不到LC。

2.斑禿皮損LC分布:斑禿皮損表皮、毛囊、皮脂腺中LC數(shù)量增多,分布位置向毛囊下部遷移。毛乳頭和深層毛囊周圍存在CD1a浸潤。斑禿患者表皮、真皮淺層毛囊、深層毛囊和血管周圍以及皮脂腺處CD1a陽性LC數(shù)量均較健康對照顯著增加(Z=4.354,2.884,4.640,3.217,3.496,均P＜0.01),見圖1,表1。活動(dòng)期皮損表皮層、真皮深層血管、深層毛囊CD1a陽性LC數(shù)量較非活動(dòng)期皮損高(Z=2.457,2.130,1.954,P ≤ 0.05)。

3.LC數(shù)量與分布部位、臨床資料的關(guān)系:表皮層CD1a陽性LC數(shù)量與淺層血管周圍、淺層毛囊、深層血管、深層毛囊周圍LC數(shù)量均呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.411,0.460,0.478,0.399,P＜0.01或0.05)。深層血管周圍與深層毛囊LC數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.630,P＜0.01)。淺層血管周圍與深層血管周圍CD1a陽性LC數(shù)量呈正相關(guān)(r=0.642,P＜0.01)。而淺層毛囊與深層毛囊CD1a陽性LC數(shù)量則無相關(guān)關(guān)系(r=0.304,P＞0.05)。

斑禿患者CD1a陽性LC分布情況與臨床資料相關(guān)關(guān)系分析結(jié)果顯示,特應(yīng)性與非特應(yīng)性者、血清IgE升高與IgE正常者,血清嗜酸性粒細(xì)胞升高與嗜酸性粒細(xì)胞正常者,有甲改變與無甲改變者、有斑禿家族史與無斑禿家族史者、有自身免疫疾病家族史與無自身免疫疾病家族史者、不同脫發(fā)類型之間LC分布在表皮層、淺層血管周、淺層毛囊周、深層血管和深層毛囊周分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＞0.05)。而各部位LC數(shù)量與年齡、發(fā)病年齡、病程、脫發(fā)面積等均無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(均P＞0.05)。

二、T細(xì)胞的分布特點(diǎn)

斑禿患者CD4+T、CD8+T細(xì)胞浸潤主要見于深層毛囊周圍,CD8+T細(xì)胞在斑禿患者深層毛囊多于淺層毛囊,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.429,P＜0.05),而CD4+T細(xì)胞雖然深層毛囊多于淺層毛囊,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見表2。

三、T細(xì)胞數(shù)量分布與LC相關(guān)性分析

1.LC與CD4+T細(xì)胞:斑禿患者非活動(dòng)組表皮層LC數(shù)量與深層血管周圍、深層毛囊周圍CD4+T細(xì)胞數(shù)量分別呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.573,-0.553,均P＜0.05)?；顒?dòng)組淺層血管周圍、深層血管周圍、深層毛囊周圍LC與CD4+T細(xì)胞數(shù)量分布無統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)性(均P＞0.05)。

2.LC與CD8+T細(xì)胞:淺層血管周圍LC與深層毛囊周圍CD8+T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.618,P＜0.05),深層毛囊周圍LC與淺層毛囊周圍CD8+T分布呈正相關(guān)(r=0.570,P＜0.05)?；顒?dòng)組淺層血管周圍LC與深層毛囊周圍CD8+T分布呈正相關(guān)(r=0.795,P=0.01),而在非活動(dòng)組深層LC與淺層血管周圍CD8+T分布呈正相關(guān)(r=0.812,P＜0.05)。而淺層血管周圍、淺層毛囊周圍、深層血管周圍、深層毛囊周圍LC與CD8+T細(xì)胞數(shù)量分布無相關(guān)關(guān)系(均P＞0.05)。

表1 不同部位朗格漢斯細(xì)胞(LC)在斑禿患者和健康對照頭皮中的分布情況(±s)

表1 不同部位朗格漢斯細(xì)胞(LC)在斑禿患者和健康對照頭皮中的分布情況(±s)

注:a:斑禿患者和健康對照相同部位比較

斑禿患者(29例) 健康對照(10例) P值a表皮層 23.335±11.300 7.395±3.705 ＜0.05真皮淺層血管周圍 12.809±7.027 6.961±5.364 ＜0.01毛囊周圍 25.855±10.586 8.11±5.396 ＜0.05真皮深層血管周圍 7.944±6.390 2.000±2.327 ＜0.01毛囊周圍 11.558±10.764 2.142±2.9138 ＜0.05

表2 不同類型T細(xì)胞在17例斑禿患者真皮淺層和深層的分布情況(±s)

表2 不同類型T細(xì)胞在17例斑禿患者真皮淺層和深層的分布情況(±s)

注:a:淺層和深層相應(yīng)部位比較

CD4+T細(xì)胞 CD8+T細(xì)胞淺層 深層 P值a 淺層 深層 P值a血管周圍 15.00±9.72 12.28±10.10 ＞0.05 11.98±5.51 11.80±9.60 ＞0.05毛囊周圍 17.73±10.52 23.16±20.40 ＞0.05 13.61±8.59 23.35±23.70 ＜0.05

圖1 CD1a陽性朗格漢斯細(xì)胞(LC)在斑禿皮損和健康對照的分布 1a:斑禿皮損表皮層(×400);1b:健康對照表皮層(×400);1c:斑禿皮損真皮淺層毛囊(×200);1d:健康對照真皮淺層毛囊(×200);1e:斑禿皮損深層毛囊(×100);1f:健康對照深層毛囊(×100)

四、CD1a和GM-CSF mRNA檢測結(jié)果

斑禿患者皮損淺層CD1a mRNA表達(dá)量與健康對照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05),而深層CD1a mRNA表達(dá)量高于健康對照CD1a mRNA表達(dá)量(Z=2.702,P＜0.01)。斑禿患者皮損深層GM-CSF mRNA表達(dá)量高于健康對照(Z=2.941,P＜0.01),而皮損淺層與健康對照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。斑禿患者深層GM-CSF mRNA表達(dá)量高于淺層(Z=2.685,P＜0.01)。脫發(fā)面積＞75%的斑禿患者與脫發(fā)面積＜75%的斑禿患者相比淺層GM-CSF mRNA表達(dá)量高(Z=2.839,P＜0.01)。特應(yīng)性體質(zhì)患者與非特應(yīng)性體質(zhì)患者相比,GM-CSF mRNA表達(dá)量高(Z=2.733,P＜0.01)?；顒?dòng)組GM-CSF mRNA表達(dá)量深層高于淺層(Z=2.252,P＜0.05)。非活動(dòng)組GM-CSF和CD1a mRNA在淺層和深層的表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

討 論

斑禿是一種T細(xì)胞介導(dǎo)的針對生長期毛囊的自身免疫性炎癥性疾病,其發(fā)病機(jī)制與毛囊免疫豁免解除有關(guān),生長期毛囊是免疫豁免器官,部分上皮細(xì)胞處于免疫豁免狀態(tài),低表達(dá)MHCⅠ類分子,不表達(dá)MHCⅡ類分子［3］。在正常毛囊周圍即有一定數(shù)量的LC,但由于毛囊不表達(dá)MHCⅡ類分子,故LC功能在正常狀態(tài)下并不能被激活［4］。斑禿病理過程啟動(dòng)階段可能是大量CD8+T細(xì)胞的聚集對毛囊MHCⅠ類分子表達(dá)異常升高的反應(yīng),而CD8+T細(xì)胞的激活又導(dǎo)致MHCⅡ類分子的表達(dá),從而導(dǎo)致CD4+T細(xì)胞反應(yīng)性地在毛囊周圍大量聚集［5］。在這個(gè)過程中MHCⅡ類分子的表達(dá),可能激活了LC的功能,斑禿病理也顯示抗原呈遞細(xì)胞如單核巨噬細(xì)胞和LC均可出現(xiàn)在生長不良的毛囊周圍(這與毛囊自身抗原發(fā)生反應(yīng)相一致),并且吸引更多抗原呈遞細(xì)胞向炎癥反應(yīng)部位集中［6］。LC和樹突細(xì)胞將凋亡導(dǎo)致的自身抗原提呈給T細(xì)胞并激發(fā)自身免疫反應(yīng)［6-8］。當(dāng)皮損部位毛囊退行性變廣泛而迅速時(shí),與之相關(guān)的淋巴細(xì)胞浸潤將相應(yīng)地激活并導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)［6-8］。

本研究發(fā)現(xiàn),斑禿患者無論在表皮、真皮淺層還是真皮深層LC的數(shù)量都較健康對照高,且其CD1a mRNA的表達(dá)量在皮膚深層較健康對照高。同時(shí)我們發(fā)現(xiàn)健康對照LC主要集中于皮脂腺開口處以上及其附近毛囊漏斗部、隆突部以及皮脂腺上皮中,而毛囊下部和毛球部位LC數(shù)目明顯減少,這與既往研究一致［9］。而在斑禿患者,我們發(fā)現(xiàn)不僅在表皮淺層、皮脂腺開口部位以上毛囊漏斗部、隆突部有大量LC,還在真皮淺層血管周圍也存在大量LC浸潤,而在真皮深層皮脂腺開口以下,LC主要集中存在于有大量炎癥細(xì)胞浸潤的毛囊周圍。有趣的是,真皮淺層和深層血管周圍的LC數(shù)量呈正相關(guān),且淺層血管周圍與淺層毛囊周圍、深層血管周圍與深層毛囊LC浸潤數(shù)量均呈正相關(guān)。另外,斑禿患者無論是淺層毛囊還是真皮淺層血管周圍LC數(shù)量都高于深層毛囊、深層血管周圍,這可能與正常毛囊在皮脂腺水平以上即有相當(dāng)部分CD1a陽性LC相關(guān)［9］,同時(shí)也說明真皮淺層血管周圍LC浸潤有其重要性,至于此處LC的功能尚待進(jìn)一步研究。

然而,斑禿患者CD1a mRNA相對僅只有真皮深層高于健康對照,可能是真皮深層疾病活動(dòng)持續(xù)時(shí)間長而淺層持續(xù)時(shí)間短,淺層mRNA在升高并引起蛋白表達(dá)后已經(jīng)恢復(fù)正常［10］。促進(jìn)CD1a轉(zhuǎn)錄和翻譯的GM-CSF mRNA在斑禿深層表達(dá)量增高,這與CD1a mRNA的表達(dá)一致,且在活動(dòng)組深層GMCSF mRNA升高,脫發(fā)面積大者,mRNA水平越高,提示GM-CSF與疾病活動(dòng)性和嚴(yán)重性相關(guān),它的升高可引起CD1a表達(dá)繼發(fā)性升高,故CD1a的表達(dá)可能與疾病活動(dòng)性和嚴(yán)重程度也相關(guān)。

許多研究顯示LC浸潤與T細(xì)胞浸潤呈正相關(guān),而本研究淺層血管周圍LC與深層毛囊周圍CD8+T數(shù)量分布呈正相關(guān)關(guān)系,且活動(dòng)組淺層血管周圍LC與深層毛囊周圍CD8+T細(xì)胞分布也呈正相關(guān),而非活動(dòng)組則沒有這種相關(guān)關(guān)系。LC在真皮淺層浸潤可以引起LC數(shù)量相對缺乏的真皮深層的CD8+T細(xì)胞激活［11］。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)淺層血管周圍LC與深層毛囊周圍CD8+T細(xì)胞數(shù)量呈正相關(guān)關(guān)系,在活動(dòng)性斑禿患者尤甚明顯,提示淺層LC可能與提呈抗原給CD8+T細(xì)胞和激活細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞相關(guān)。我們在研究LC與T細(xì)胞浸潤相關(guān)時(shí)病例數(shù)較少可能之造成偏倚,需待進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行研究。

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2013-05-05)

(本文編輯:尚淑賢)

Quantity and distribution of Langerhans cells and CD8+T cells in lesions of alopecia areata

Zhang Xiaoting，Li Shuifeng，Zhao Ying，Ye Yanting，Qi Shiling，Yang Yuqing，Cao Hui，Zhang Xingqi*.*Department of Dermatology and Venereology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Sun Yat-sen University，Guangzhou 510080，China

Zhang Xingqi，Email：xingqi.zhang@hotmail.com

ObjectiveTo analyze the quantity and distribution of Langerhans cells in lesions of alopecia areata(AA)，so as to investigate their role in the pathological process of AA as well as their relationship with T lymphocytes.MethodsTissue specimens were obtained from the scalp lesions of AA in 29 patients，including 16 in active phase and 13 in non-active phase.All the specimens were subjected to immunohistochemical staining for CD1a，and 17 specimens to immunohistochemical staining for CD4 and CD8.Fluorescence-based semi-quantitative reverse transcription(RT)-PCR was performed to determine the mRNA expressions of CD1a and granulocytemacrophage colony stimulating factor(GM-CSF)in the full-thickness skin specimens.Statistical analysis was done using Mann Whitney U test and Pearson correlation analysis.ResultsThere was a significant increase in the quantity of CD1a+Langerhans cells in the epidermis，perivascular and perifollicular areas in the upper and deep dermis of the AA patients compared with the healthy controls(Z=4.354，2.884，4.640，3.217，3.496，allP ＜ 0.01)，and in the epidermis，perivascular and perifollicular areas in the deep dermis of AA patients in active phase compared with those in non-active phase(Z=2.457，2.130，1.954，P ＜ 0.05 or=0.05).The relative mRNA expression levels of CD1a and GM-CSF in the patients were similar to the healthy controls in the upper dermis，but significantly higher than the healthy controls in the deep dermis(Z=2.702，2.941，bothP ＜ 0.01).A positive correlation was observed between the quantity of perivascular Langerhans cells in the upper dermis and that of perifollicular CD8+T lymphocytes in the deep dermis in patients with AA(r=0.618，P ＜ 0.05)and in patients with active AA(r=0.795，P=0.01)，but not in patients with inactive AA(r=0.304，P ＞ 0.05).ConclusionsThe number of Langerhans cells is elevated in patients with AA，especially in patients with active AA.The quantity of perivascular Langerhans cells in the upper dermis is positively correlated with that of perifollicular CD8+T lymphocytes in the deep dermis of active AA lesions，hinting that Langerhans cells play an important role in the progression of AA.

Alopecia areata；Langerhans cells；T-lymphocytes；CD1a protein

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.010

510080廣州,中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院皮膚性病科［張小婷(現(xiàn)在溫州醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院皮膚性病科,325000)、李水鳳、葉艷婷、戚世玲、楊雨清、曹慧、章星琪］;山東菏澤市立醫(yī)院皮膚科(趙瑩)

章星琪,Email:xingqi.zhang@hotmail.com