馬蕾 薛海波 管秀好 舒春梅 于娟 張俊花 運蓓蕾

特應(yīng)性皮炎患者外周血和皮損miR-155的表達(dá)及其與Th17細(xì)胞相關(guān)性研究

馬蕾 薛海波 管秀好 舒春梅 于娟 張俊花 運蓓蕾

目的探討特應(yīng)性皮炎(AD)患者外周血與皮損組織中miR-155、Th17細(xì)胞、Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt及效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)及其相關(guān)性。方法用實時熒光定量RT-PCR檢測37例AD患者外周血單一核細(xì)胞(PBMC)中miR-155、RORγt及IL-17的mRNA表達(dá)水平,流式細(xì)胞儀檢測Th17細(xì)胞比例,酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中IL-17的含量;并以33例性別、年齡匹配的健康兒童做對照。檢測5例重度AD患者皮損與皮損周圍組織中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA的表達(dá)水平,并以5例正常皮膚組織標(biāo)本為對照。結(jié)果AD患者PBMC中miR-155、RORγt及IL-17的mRNA表達(dá)水平均明顯高于健康對照(分別為5.78±1.78比1.82±0.46,6.08±1.04比1.64±0.52,7.09±1.75比1.71±0.46,均P＜0.01);AD患者PBMC中Th17細(xì)胞比例及IL-17血漿含量均明顯高于健康對照,分別為(1.78±0.52)%比(0.47±0.15)%,(32.51±6.15)pg/ml比(11.80±2.24)pg/ml,均P ＜0.01。AD患者皮損、皮損周圍組織及正常皮膚組織中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達(dá)水平間比較,差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義;皮損＞皮損周圍組織＞正常皮膚組織,F值分別為41.803、17.040和37.064,均P＜0.01。AD患者PBMC中miR-155 mRNA表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度評分、Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA表達(dá)水平、IL-17 mRNA表達(dá)水平及IL-17血漿含量呈正相關(guān),r值分別為0.405、0.426、0.402、0.410、0.408,均P＜0.05;皮損及皮損周圍組織中miR-155 mRNA表達(dá)水平與RORγt、IL-17的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān),r值分別為0.428和0.435,均P＜0.05。結(jié)論AD患者miR-155、Th17細(xì)胞及其效應(yīng)性細(xì)胞因子高表達(dá)可能與AD發(fā)病有關(guān)。

皮炎,特應(yīng)性;miR-155;Th17細(xì)胞

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis,AD)是一種炎癥性皮膚病,其病因及發(fā)病機制復(fù)雜。microRNA是一類內(nèi)源性短序列、非編碼、具有調(diào)控功能的單鏈小分子RNA,存在于基因組的非編碼區(qū),通過與目的基因mRNA的3'末端非翻譯區(qū)(3'untranslatedregion，3'UTR)互補結(jié)合,降解目的基因mRNA和(或)抑制目的基因mRNA分子的轉(zhuǎn)錄后翻譯,調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)生成,從而在多種自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中起作用［1-2］。有學(xué)者［3］用微陣列芯片研究發(fā)現(xiàn)AD皮損存在44條microRNA表達(dá)失調(diào),miR-155是明顯上調(diào)的microRNA之一,提示其在AD發(fā)病中可能起一定的作用,但具體機制尚未明確。本研究通過檢測AD患者外周血與皮損組織中miR-155、Th17細(xì)胞、Th17細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt及其效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17的表達(dá)水平,探討miR-155對AD患者Th17細(xì)胞的表達(dá)調(diào)控。

對象與方法

一、對象

AD患者37例(男21例,女16例),符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］,平均年齡(10.14 ± 3.60)歲;健康對照為33例健康體檢兒童(男18例,女15例),平均年齡(11.03±3.34)歲,兩組間性別、年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義。用SCORAD評分標(biāo)準(zhǔn)判斷AD疾病嚴(yán)重程度［5］,SCORAD評分平均值為31.89(16～51),其中中度AD(15≤SCORAD＜40)23例,重度AD(SCORAD≥40)14例。所有AD患者在入組前1周停用抗組胺藥及外用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑、免疫調(diào)節(jié)劑,6個月內(nèi)未系統(tǒng)使用糖皮質(zhì)激素及免疫相關(guān)制劑。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),入組者及其患兒監(jiān)護人均簽署知情同意書。

二、方法

1.標(biāo)本采集:晨空腹采集各組受試對象外周靜脈血7 ml,440×g離心分離血漿,Ficoll密度梯度離心法分離、獲取外周血單一核細(xì)胞(PBMC);手術(shù)切取5例重度AD患者丘疹性損害及皮損周圍組織,5例正常皮膚組織標(biāo)本取自整形外科手術(shù)。標(biāo)本于-70℃保存待檢。

2.實時定量 RT-PCR 檢測 miR-155、RORγt及IL-17的mRNA表達(dá)水平:用Trizol RNA提取試劑(美國Invitrogen公司)按說明書提取PBMC、皮損、皮損周圍組織及正常皮膚組織中總RNA,紫外分光光度儀測定其純度,吸光度值(A260/A280)在1.8～2.0之間為合格樣本。分別利用miR-155莖環(huán)引物(5'-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACT GGATACGACCCCTAT-3')、內(nèi)參U6反轉(zhuǎn)錄引物(5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3')及oligo(dT),按M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Invitrogen公司)說明書合成對應(yīng)的cDNA。用SYBR green real-time PCR master mix(日本Toyobo公司),分別以U6和β肌動蛋白為內(nèi)參照,引物序列見表1。在Rotor-Gene 3000實時PCR儀(澳大利亞Corvett Research公司) 進(jìn)行miR-155、RORγt及IL-17的定量檢測。檢測數(shù)據(jù)用分析軟件(Rotor-Gene Real-Time Analysis Software 6.0)和雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行分析。

3.流式細(xì)胞儀檢測外周血Th17細(xì)胞比例(CD4+IL17+T細(xì)胞/CD4+T細(xì)胞%):將PBMC在含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液(美國Gibco公司)中調(diào)整濃度至2×106細(xì)胞/ml,分別加入50 μg/L佛波酯(PMA)、1 mg/L鈣離子載體和10 mg/L布雷菲德菌素A(BFA,均購自美國Sigma公司),37℃、5%CO2條件下共刺激培養(yǎng)5 h;染色方法、步驟參考說明書進(jìn)行(美國eBioscience公司)。首先細(xì)胞膜FITC-CD4單克隆抗體標(biāo)記,透膜、固定后PE-IL17單克隆抗體胞內(nèi)染色。用FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測標(biāo)本,winMDI 2.9軟件分析數(shù)據(jù)。

4.酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中IL-17的含量:用美國RD公司IL-17 ELISA試劑盒,按照說明書的操作標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

表1 目的基因及內(nèi)參基因引物序列

結(jié) 果

一、AD患者和健康對照PBMC中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達(dá)水平

1.目的基因(miR-155、RORγt及 IL-17)和內(nèi)參基因(U6、β肌動蛋白)標(biāo)準(zhǔn)曲線直線擬合度良好,直線相關(guān)性好,可在較寬的范圍內(nèi)進(jìn)行定量分析;擴增動力曲線呈S型,重復(fù)表現(xiàn)一致,擴增結(jié)果理想;熔解曲線表現(xiàn)為單峰,表明擴增的特異性和重復(fù)性良好。

2.AD患者PBMC中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達(dá)水平均顯著高于健康對照者,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,見表2。

二、AD患者和健康對照者PBMC中Th17細(xì)胞比例

AD患者PBMC中Th17細(xì)胞比例(1.78±0.52%)顯著高于健康對照(0.47±0.15%),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=14.583,P＜0.01),見圖1。

三、AD患者和健康對照血漿中IL-17含量

AD患者血漿中IL-17含量為32.51±6.15 pg/ml,顯著高于健康對照者(11.80±2.24 pg/ml),差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=19.102,P＜0.01)。

表2 AD患者和健康對照PBMC中miR155、RORγt及IL-17 mRNA表達(dá)水平比較

圖1 AD患者(1a)和健康對照者(1b)Th17細(xì)胞比例流式圖

表3 AD患者皮損、皮損周圍組織及正常皮膚組織中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達(dá)水平比較

四、AD患者皮損、皮損周圍組織及正常皮膚組織中miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達(dá)水平

AD患者皮損、皮損周圍組織與正常皮膚組織間miR-155、RORγt及IL-17 mRNA表達(dá)水平比較,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.01;各組間兩兩比較差異亦均具有統(tǒng)計學(xué)意義,P＜0.05。見表3。

五、相關(guān)性檢測

AD患者外周血miR-155 mRNA表達(dá)水平與SCORAD評分、Th17細(xì)胞比例、RORγt mRNA表達(dá)水平、IL-17 mRNA表達(dá)水平及IL-17血漿含量均呈正相關(guān)。SCORAD評分r=0.405,P=0.013;Th17細(xì)胞比例r=0.426,P=0.009;RORγt mRNA表達(dá)水平r=0.402,P=0.014;IL-17 mRNA表達(dá)水平r=0.410,P=0.012;血漿IL-17含量r=0.408,P=0.012。AD患者皮損及皮損周圍組織中miR-155 mRNA表達(dá)水平與RORγt mRNA表達(dá)水平(r=0.428,P=0.018)及IL-17 mRNA表達(dá)水平(r=0.435,P=0.016)均呈正相關(guān)。

討 論

Th17細(xì)胞是一組以分泌IL-17(IL-17A)為特點的CD4+T細(xì)胞亞群,其發(fā)現(xiàn)源于對實驗性自身免疫性腦脊髓炎以及膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的研究。本研究結(jié)果顯示,Th17細(xì)胞及其特異性轉(zhuǎn)錄因子RORγt、效應(yīng)性細(xì)胞因子IL-17在AD患者外周血及皮損中均高水平表達(dá),進(jìn)一步說明Th17細(xì)胞在AD發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［6-7］。

miR-155是一種多功能的microRNA分子,國外學(xué)者在AD患者皮損microRNA表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn),miR-155 呈明顯高表達(dá)［3］。本研究結(jié)果顯示,AD患者外周血、皮損及皮損周圍組織miR-155 mRNA表達(dá)水平明顯增高,且外周血中miR-155 mRNA表達(dá)水平與疾病嚴(yán)重程度評分呈正相關(guān),表明miR-155參與AD的疾病發(fā)生過程,miR-155表達(dá)水平可能成為AD的一個新型生物標(biāo)志物。miR-155已被證實能夠明顯影響先天性免疫和適應(yīng)性免疫過程,如炎癥介導(dǎo)、抗原提呈、T細(xì)胞分化、細(xì)胞因子產(chǎn)生等［8-9］。miR-155為Th17細(xì)胞分化所必需,缺失miR-155的T細(xì)胞不能正常分化為Th17細(xì)胞;miR-155基因敲除小鼠Th17細(xì)胞數(shù)量減少,且不發(fā)生EAE［8］。進(jìn)一步研究表明,SOCS1(細(xì)胞因子信號抑制物1)是miR-155的直接靶基因,miR-155能夠通過JAK/STAT信號途徑抑制SOCS1的表達(dá),進(jìn)而促進(jìn)小鼠CD4+T細(xì)胞中Th17細(xì)胞的分化與功能,RORγt及IL-17的表達(dá)均明顯增加［10］。經(jīng)TargetScan軟件預(yù)測,SOCS1亦是人miR-155的特異性靶基因。在AD疾病狀態(tài)下,miR-155是否同樣能夠促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化與功能尚不清楚。本研究結(jié)果表明,AD患者外周血中miR-155 mRNA表達(dá)水平與Th17細(xì)胞比例、RORγt及IL-17的mRNA表達(dá)水平、IL-17血漿含量均呈正相關(guān),皮損及皮損周圍組織中miR-155 mRNA表達(dá)水平亦與RORγt及IL-17的mRNA表達(dá)水平呈正相關(guān),提示在AD疾病過程中高表達(dá)的miR-155可能通過促進(jìn)Th17細(xì)胞的分化及其功能,增強Th17細(xì)胞的致炎作用,促發(fā)和加重皮損的炎癥反應(yīng),miR-155可能成為AD治療的一個新靶點。

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2013-05-27)

(本文編輯:吳曉初)

Expression of miR-155 in peripheral blood and skin lesions from as well as its relationship with Th17 cells in patients with atopic dermatitis

Ma Lei*，Xue Haibo，Guan Xiuhao，Shu Chunmei，Yu Juan，Zhang Junhua，Yun Beilei.*Department of Dermatology，Affiliated Hospital of Binzhou Medical University，Binzhou 256603，Shandong，China

Xue Haibo，Email：xuehaibo@sina.com

ObjectiveTo detect the expressions of miR-155，T helper type 17(Th17)cells，and Th17 cellspecific transcription factor RORγt and effector cytokine interleukin(IL)-17 in peripheral blood and skin lesions from，and to evaluate their relationship in，patients with atopic dermatitis(AD).MethodsPeripheral blood was obtained from 37 patients with AD and 33 age-and sex-matched healthy controls，and biopsy specimens from the lesional and perilesional skin of five patients with severe AD as well as from the normal skin of five healthy human controls.Real-time fluorescence-based reverse transcription(RT)-PCR was employed to measure the mRNA expression levels of miR-155，RORγt and IL-17 in peripheral blood mononuclear cells(PBMCs)and skin specimens，flow cytometry to detect the percentage of Th17 cells in PBMCs，enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)to determine the plasma concentration of IL-17.Statistical analysis was done using independent sample's ttest，one-way analysis of variance followed by the least significant difference test，and linear correlation analysis.ResultsCompared with the healthy controls，the patients with AD showed a significant increase in Th17 cell percentage(1.78% ±0.52%vs.0.47% ±0.15%，P＜0.01)，mRNA expression levels of miR-155(5.78±1.78 vs.1.82±0.46，P＜0.01)，RORγt(6.08±1.04 vs.1.64±0.52，P＜0.01)and IL-17(7.09±1.75 vs.1.71±0.46，P＜0.01)，as well as in the plasma concentration of IL-17((2.51±6.15)pg/ml vs.(11.80±2.24)pg/ml，P＜0.01).There was a sequential decrease in the expression levels of miR-155，RORγt and IL-17 mRNA from lesional skin，perilesional skin to normal skin(F=41.803，17.040 and 37.064 respectively，allP ＜ 0.01).The miR-155 mRNA expression level in PBMCs was positively correlated with the SCORing Atopic Dermatitis(SCORAD)index，Th17 cell percentage，RORγt and IL-17 mRNA expression levels as well as IL-17 plasma concentration(r=0.405，0.426，0.402，0.410 and 0.408 respectively，allP ＜ 0.05).Similarly，the miR-155 expression level was positively correlated with RORγt and IL-17 mRNA expression levels in lesional and paralesional specimens(r=0.428 and 0.435 respectively，bothP ＜ 0.05).ConclusionThe up-regulated expression of miR-155，Th17 cells and their effector cytokine IL-17 may be associated with the development of AD.

Dermatitis，atopic；miR-155；Th17 cells

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.01.005

山東省科技發(fā)展計劃(2011YD18069);山東省自然科學(xué)基金(ZR2010HQ013);山東省高等學(xué)?？萍加媱?J10LF90);山東省醫(yī)藥衛(wèi)生科技發(fā)展計劃(2011QZ003);濱州市科技發(fā)展計劃(2011ZC0914)

256603山東,濱州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院皮膚科(馬蕾、舒春梅、于娟、張俊花)，臨床學(xué)院(薛海波);中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(管秀好);沈陽市第七人民醫(yī)院(運蓓蕾)

薛海波,Email:xuehaibo@sina.com