馬康康 李忠玉 粟盛梅 曹文娟 戴文婷 楊曉玉 賀紅梅 鐘光明

pORF5質粒蛋白拮抗LL37抗菌肽增強沙眼衣原體感染的初步研究

馬康康 李忠玉 粟盛梅 曹文娟 戴文婷 楊曉玉 賀紅梅 鐘光明

目的探討pORF5質粒蛋白能否通過抑制LL37抗菌肽增強沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis, Ct)感染,并初步探討其分子機制。方法表達并純化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白經蛋白酶酶切制備不含GST標簽的pORF5蛋白;pORF5蛋白和LL37單獨或共孵育衣原體后再感染HeLa細胞,間接免疫熒光技術計數(shù)衣原體包涵體形成數(shù)量;熒光定量PCR檢測TNF-α、LL37基因表達水平。結果單獨Ct感染組衣原體包涵體形成單位(IFU)為3.8×105/ml,LL37處理組IFU為2.0×105/ml,pORF5蛋白處理組IFU為3.0×105/ml, pORF5蛋白和LL37共處理組IFU為3.1×105/ml。pORF5蛋白處理組、LL37與pORF5蛋白共處理組和單獨Ct感染組之間比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但明顯高于LL37單獨處理組(P＜0.05)。pORF5蛋白和LL37共同處理組TNF-α表達水平明顯高于LL37單獨處理組(P＜0.01);pORF5蛋白處理組較Ct處理組LL37基因轉錄水平下降了19%。結論pORF5質粒蛋白能拮抗LL37抗菌肽增強Ct感染,其機制可能與上調腫瘤壞死因子α、下調LL37表達相關。

沙眼衣原體;pORF5質粒蛋白;LL37;抗菌肽類

沙眼衣原體(Chlamydia trachomatis,Ct)是一種嚴格細胞內寄生的革蘭陰性菌,共有19個血清型, A～C血清型可感染引起沙眼,L血清型可感染引起性病淋巴肉芽腫,D～K血清型可感染人體泌尿生殖系統(tǒng),引起非淋菌性尿道炎、宮頸炎、不孕癥等,對人類生殖健康造成極大危害[1]。Ct感染患者HIV陽性率[2]和宮頸癌[3]發(fā)生率也明顯高于正常人群。由于Ct感染后癥狀不明顯,極易被患者忽視而得不到及時有效的治療導致嚴重的并發(fā)癥。因此,闡明Ct的致病機制、研制有效疫苗對預防控制衣原體感染性疾病有重要意義[4]。Ct除含有約1 mb的基因外,各血清型中亦存在一個7.5 kb的隱蔽性質粒,有研究報道,衣原體質粒缺失菌株不能激活TLR2依賴的免疫反應,不引起上生殖道病變[5-6],提示質粒能編碼毒力因子參與衣原體上行性感染和病理損傷過程。在質粒編碼的8種質粒蛋白中, pORF5是唯一定位于包涵體外的分泌性蛋白[7]。LL37抗菌肽是目前發(fā)現(xiàn)的人類唯一的Cathelicidins家族成員,廣泛分布于各種上皮細胞中,具有廣譜的抗菌活性,能降低衣原體的感染率。本研究旨在探討pORF5質粒蛋白能否通過拮抗LL17抗菌肽促進Ct感染,并初步分析其分子機制,為深入研究pORF5蛋白功能,闡明Ct致病機制提供依據(jù)。

材料與方法

一、材料

1.菌株與質粒:pGEX-6p/pORF5重組質粒、E.coliXL1-blue菌株、HeLa細胞均由本研究所保存。

2.主要試劑:預染蛋白 Marker為美國Fermentas公司產品,Glutathione Sepharose 4B購于美國Pharmacia公司,PreScission Protease、Cy2標記的羊抗兔IgG為美國GE Healthcare公司產品,血清及DMEM細胞培養(yǎng)基為美國Gibco公司產品, HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑為北京康為世紀生物科技有限公司產品,LL37由上海濤宇國際貿易有限公司合成。

二、方法

1.衣原體的感染:將HeLa細胞接種于24孔細胞培養(yǎng)板,18～24 h培養(yǎng)后長至單層,棄去細胞培養(yǎng)液,細胞經30 μg/ml DEAE-dextran處理10 min后加入衣原體感染液,37℃孵育2 h后棄去上清,加入含有2 μg/ml放線菌酮的完全培養(yǎng)基,37℃, 5%CO2繼續(xù)培養(yǎng)40 h。

2.pORF5融合蛋白GST標簽的切割與鑒定:將 pGEX-6p/pORF5原核表達重組質粒轉化XL1-Blue大腸桿菌,IPTG誘導表達4 h,離心收集誘導后細菌,超聲破菌后12 000×g離心收集上清。利用谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B純化GST-pORF5融合蛋白,融合蛋白加入蛋白酶,室溫4 h或4℃過夜后離心,收集上清和磁珠洗脫液即為去除GST標簽的pORF5蛋白。切割后的pORF5蛋白經SDS-PAGE凝膠電泳,以pORF5多抗為一抗,羊抗鼠IgG為二抗,進行Western印跡分析鑒定。同時將純化后的pORF5蛋白與50 mg/ml的多粘菌素B 37℃孵育30 min以去除內毒素,BCA法測定pORF5蛋白濃度。

3.間接免疫熒光實驗:Ct感染HeLa細胞40 h后,4%甲醛室溫固定30 min,2%皂素透膜處理1 h, PBS洗滌細胞后加入1%BSA室溫封閉1 h,然后再依次加入兔抗衣原體抗體,37℃孵育1 h;Cy2標記的羊抗兔抗體、Hoechst 33258,37℃1 h,最后PBS洗滌、封片,干燥,熒光顯微鏡觀察結果并拍照保存。

4.pORF5和LL37對衣原體感染的影響:HeLa細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板,106個/孔,37℃,5% CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h。DEAE-dextran處理后將實驗分為4組:第1組為20 μg/ml LL37和30 μg/ml pORF5蛋白37℃孵育30 min后,與衣原體繼續(xù)孵育2 h后感染HeLa細胞;第2組為20 μg/ml LL37與衣原體孵育2 h后感染HeLa細胞;第3組為30 μg/ml pORF5與衣原體孵育2 h后感染HeLa細胞;第4組為單獨Ct感染組。各處理組置于37℃,5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h,棄上清,加入含有2 μg/ml放線菌酮的完全培養(yǎng)基,繼續(xù)培養(yǎng)40 h。細胞固定后進行間接免疫熒光染色,熒光顯微鏡計數(shù)各組包涵體形成數(shù)量。

5.實時熒光定量PCR:從基因庫中查詢LL37、腫瘤壞死因子(TNF)α基因DNA序列,設計特異性引物(表1)。引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成。采用Trizol法提取細胞總RNA,反轉錄采用HiFi-MMLVcDNA第一鏈合成試劑盒。實時熒光定量PCR擴增體系:cDNA 1 μl,qPCR混合物10 μl,正、反向引物各0.4 μl,滅菌蒸餾水補充至總體積20 μl。反應條件:94℃預變性10 min,94℃變性15 s, 60℃退火15 s,72℃延伸30 s,40個循環(huán)后,72℃繼續(xù)延伸5 min?；虻谋磉_量的計算采用△△Ct方法,即基因相對表達量=2-△△Ct,△△Ct=(Ct實驗組目的基因-Ct實驗組內參基因)-(Ct對照組目的基因-Ct對照組內參基因)

表1 熒光定量PCR引物序列

6.pORF5和LL37對衣原體感染HeLa細胞TNF-α表達的影響:按上述方法將實驗分為4組, LL37與pORF5蛋白單獨或共同孵育后處理衣原體,感染單層HeLa細胞,繼續(xù)培養(yǎng)6 h后收集細胞,實時熒光定量PCR擴增TNF-α基因,采用2-△△Ct法進行數(shù)據(jù)的相對定量分析。ELISA測定各處理24 h后的細胞培養(yǎng)上清中TNF-α濃度,分析目的基因mRNA轉錄及表達水平的差異。

7.pORF5對衣原體感染HeLa細胞LL37表達的影響:HeLa細胞培養(yǎng)至單層后分成3組,加入經30 μg/ml pORF5蛋白室溫預孵2 h的衣原體感染液;直接加入衣原體感染液;空白對照組。細胞經上述處理2 h后更換為含有放線菌酮的完全培養(yǎng)基, 6 h后消化收集細胞,實時熒光定量PCR檢測LL37表達的變化,ELISA測定各處理24 h后的培養(yǎng)上清中LL37濃度。

三、統(tǒng)計學分析

結果

一、pORF5融合蛋白的純化與GST標簽的切割

重組質粒pGEX-6p/pORF5轉化到XL1-Blue大腸桿菌,IPTG誘導表達可溶性pORF5融合蛋白,融合蛋白經谷胱甘肽瓊脂糖凝膠4B純化后,蛋白酶切割GST標簽,收集上清和磁珠洗脫液即為酶切后pORF5蛋白。pORF5蛋白經SDS-PAGE分析,可見大小約28 000有清晰條帶,與pORF5蛋白大小一致(圖1a)。以酶切后pORF5蛋白為抗原,鼠抗pORF5多抗作為一抗,羊抗鼠IgG為二抗進行Western印跡分析,結果在28 000處出現(xiàn)清晰條帶(圖1b)。

圖1 pORF5蛋白的純化與鑒定 1a:酶切后pORF5蛋白的SDS-PAGE鑒定 1:標準參照物;2:未經酶切的GST-pORF5融合蛋白;3:酶切后上清;4:第1次洗脫液;5:第2次洗脫液;6:第3次洗脫液;7:酶切后GST-pORF5融合蛋白beads。1b:酶切后pORF5蛋白的Western印跡鑒定 1:XL1 Blue E.coli裂解產物;2:酶切后無GST標簽的pORF5蛋白

二、pORF5蛋白拮抗LL37抗菌肽促進衣原體感染

用30 μg/ml pORF5蛋白和20 μg/ml LL37單獨或共同與Ct孵育后感染HeLa細胞,間接免疫熒光法計數(shù)結果顯示單獨Ct感染組包涵體形成單位(IFU)為3.8×105/ml,LL37處理組IFU為2.0×105/ml, pORF5蛋白處理組IFU為3.0×105/ml,pORF5蛋白與LL37共同處理組IFU為3.1×105/ml(圖2)。LL37處理組衣原體IFU明顯減少,與單獨Ct感染組相比較,IFU下降了47%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。pORF5蛋白與LL37共同處理組IFU較LL37單獨組IFU增加了55%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),但與pORF5蛋白單獨處理組比,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),見圖3。

圖2 間接免疫熒光法檢測衣原體包涵體 HeLa細胞接種于6孔細胞培養(yǎng)板后培養(yǎng)18～24 h長至單層,分別用30 μg/ml pORF5蛋白和20 μg/ml LL37單獨或共同與Ct孵育后感染HeLa細胞,40 h后細胞固定進行間接免疫熒光染色,顯微鏡下計數(shù)各處理組包涵體形成單位值,結果發(fā)現(xiàn)pORF5蛋白處理組、pORF5蛋白與LL37共處理組和空白對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),但高于LL37單獨處理組(P＜0.05)。綠色為衣原體;藍色為DNA

三、pORF5蛋白拮抗LL37增強TNF-α表達

分別提取不同處理組HeLa細胞總RNA,將逆轉錄后的cDNA作為模板進行實時熒光定量PCR擴增。以β肌動蛋白為內參照,對TNF-α基因的表達情況進行相對定量分析。結果發(fā)現(xiàn),LL37處理組HeLa細胞TNF-α基因的表達水平顯著低于單獨Ct感染組與pORF5蛋白處理組(P＜0.01),分別約減少了5.8倍和6.3倍,pORF5蛋白與LL37共處理組較LL37單獨處理組TNF-α基因的表達水平增加了3.5倍。ELISA結果亦發(fā)現(xiàn)LL37處理組TNF-α表達水平明顯低于pORF5單獨或與LL37共處理組(P＜0.01)。見表2。

表2 腫瘤壞死因子α mRNA和蛋白表達(±s)

表2 腫瘤壞死因子α mRNA和蛋白表達(±s)

注:n=3。a:與LL37處理組、pORF5蛋白與LL37共處理組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),與pORF5蛋白處理組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);b:與LL37處理組、pORF5蛋白與LL37共處理組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);c:與pORF5蛋白與LL37共處理組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

組別 mRNA表達 蛋白表達(pg/ml)單獨Ct感染組 1.51±0.14a 2 120.9±248.1a Ct+pORF5處理組 1.62±0.21b 1 999.8±208.9b Ct+LL37處理組 0.22±0.02c 678.4±75.2c Ct+pORF5+LL37處理組 1.00±0.09 1 388.6±156.1

四、pORF5蛋白下調Ct感染HeLa細胞LL37的表達

圖3 不同處理組包涵體形成單位計數(shù)結果 a:與單獨Ct感染組、pORF5蛋白單獨處理組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),與LL37處理組差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);b:與單獨Ct感染組比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),與LL37處理組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);c:與單獨Ct感染組、pORF5蛋白單獨處理組、pORF5蛋白與LL37共處理組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

以不同稀釋度的對照樣本建立標準曲線,結果標準曲線中Ct值和樣本LL37濃度間呈現(xiàn)良好的線性關系,相關系數(shù)(R2)為0.99,基因擴增效率在85%以上。將實驗組各樣本10倍稀釋后,分別用LL37和β肌動蛋白特異性引物擴增,計算出各樣品LL37基因相對定量;同時收集24 h培養(yǎng)后上清, ELISA測定LL37表達水平,結果發(fā)現(xiàn)Ct處理組與pORF5蛋白處理組LL37基因的轉錄水平及蛋白表達水平較對空白照組均明顯增加(P＜0.01),pORF5蛋白處理組較Ct處理組LL37基因轉錄水平下降了19%。見表3。

表3 LL37基因mRNA和蛋白表達(±s)

表3 LL37基因mRNA和蛋白表達(±s)

注:n=3。a:與空白對照組、pORF5蛋白處理組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);b:與空白對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)

組別 mRNA表達 蛋白表達(pg/ml)空白對照組 0.06±0.01 4.5±1.5單獨Ct感染組 1.12±0.15a 135.5±21.2a Ct+pORF5處理組 0.93±0.10b 95.3±15.8b

討論

Ct進入生殖道后,首先是具有感染性的原體(EB)吸附于黏膜上皮細胞,在細胞內形成包涵體,進而轉化為代謝活躍的網狀體(RB),RB以二分裂形式繁殖,形成眾多的子代RB,子代RB重新轉化為EB并釋放出細胞外再感染鄰近細胞。為實現(xiàn)Ct在生殖道組織的上行性感染,EB必須存在某種機制拮抗生殖道黏膜局部固有免疫。作為生殖道黏膜固有免疫的重要組成部分,抗菌肽具有廣譜抗微生物特性[8-9]。人類抗菌肽主要有防御素家族和Cathelicidin家族,LL37是Cathelicidin家族中唯一存在于人體的成員,廣泛分布于各種上皮細胞中,是人體天然防御的重要組成部分,對G+和G-細菌均有很好的殺傷作用[10],能夠降低衣原體的感染率[11]。Ct是如何抵抗生殖道LL37抗菌肽的抗菌作用至今仍不清楚。

Ct19個血清型中均存在7.5 kb的隱蔽性質粒,質粒不是衣原體生存的必須元件,但衣原體質粒缺失株毒力高度降低,不能上行引起生殖道病變[5-6],充分提示質粒能編碼某種毒力因子并能拮抗抗菌肽的抗菌活性,促進Ct感染上行擴散。我們[12-13]前期研究已經證實pORF5蛋白體內外均能促進IL-1β、IL-8、TNF-α等多種炎癥細胞因子的產生,提示pORF5蛋白可能參與了衣原體免疫病理損傷過程。本實驗首先用抗菌肽LL37處理Ct后再感染HeLa細胞,發(fā)現(xiàn)Ct IFU明顯降低,較單獨Ct感染組降低了47%,證實LL37能夠抑制Ct的感染。進一步將pORF5蛋白和LL37共同處理Ct后感染HeLa細胞,發(fā)現(xiàn)Ct IFU明顯增多,較LL37單獨處理組IFUs上升了55%,充分說明pORF5蛋白能拮抗LL37抗衣原體活性促進Ct感染。

實驗過程中,我們發(fā)現(xiàn)Ct處理組、pORF5蛋白處理組的HeLa細胞TNF-α基因轉錄水平明顯升高,但LL37處理組TNF-α基因轉錄水平明顯降低,分別較Ct處理組與pORF5蛋白處理組約降低了5.8倍和6.3倍,當用pORF5蛋白預先與LL37孵育后再處理Ct,發(fā)現(xiàn)TNF-α基因轉錄水平恢復上升水平,較LL37單獨處理組TNF-α基因表達水平增加了3.5倍。進一步測定TNF-α蛋白表達水平,結果亦顯示,pORF5與LL37共處理組TNF-α表達水平明顯高于LL37處理組,提示pORF5質粒蛋白能拮抗LL37增強TNF-α表達。作為一種重要的前炎癥細胞因子,TNF-α能夠激活炎癥反應并能促進細胞凋亡,持續(xù)產生的TNF-α能夠引發(fā)組織損傷[14],使宮頸部位出現(xiàn)充血、水腫等癥狀并伴有分泌增加等,有利于Ct感染的上行擴散,在衣原體持續(xù)性感染過程中具有重要作用。本研究結果顯示,pORF5蛋白能拮抗LL37作用提高Ct感染HeLa細胞TNF-α的表達,TNF-α水平的升高一方面可誘導Ct感染細胞發(fā)生細胞凋亡,促進Ct在細胞的擴散;另一方面放大炎癥反應,促進Ct持續(xù)性感染。

為初步探討pORF5蛋白在Ct感染過程中的作用,本研究分別用Ct或pORF5蛋白預先與Ct孵育后再感染HeLa細胞,結果發(fā)現(xiàn)Ct能較高水平地誘導HeLa細胞中LL37基因轉錄,pORF5蛋白處理組HeLa細胞LL37基因轉錄水平高于對照組,但較Ct處理組LL37轉錄水平下降19%;同時pORF5蛋白處理組LL37蛋白表達水平明顯降低Ct處理組。Bergman等[15]研究發(fā)現(xiàn),淋球菌可通過降低LL37的表達抑制其抗淋球菌活性,從而為淋球菌提供有利的生殖道生存環(huán)境,提示pORF5蛋白亦可通過下調Ct感染細胞LL37表達水平,降低LL37對Ct感染的抑制作用,最終促進Ct在生殖道組織的生存與擴散。本研究初步證實pORF5蛋白可能通過上調TNF-α、下調LL37基因表達,降低LL37對Ct感染的抑制作用,為進一步闡明Ct持續(xù)性感染中免疫致病機制提供依據(jù)。然而pORF5蛋白拮抗LL37抗菌肽是直接通過與LL37結合封閉其活性區(qū)域,或者改變LL37表面電荷分布以達到抑制LL37的抗Ct作用等尚待進一步研究。

[1]Gallegos G，Ramos B，Santiso R，et al.Sperm DNA fragmentation in infertile men with genitourinary infection byChlamydia trachomatisand Mycoplasma[J].Fertil Steril，2008，90(2):328-334.

[2]Kilmarx PH，Mock PA，Levine WC.Effect ofChlamydia trachomatiscoinfection on HIV shedding in genital tract secretions[J].Sex Transm Dis，2001，28(6):347-348.

[3]da Silva Barros NK，Costa MC，Alves RR，et al.Association of HPV infection andChlamydia trachomatisseropositivity in cases of cervical neoplasia in Midwest Brazil[J].J Med Virol，2012，84(7):1143-1150.

[4]齊蔓莉，王敬，劉原君，等.白介素2基因佐劑對沙眼衣原體E型DNA疫苗的免疫增效作用[J].中華皮膚科雜志，2012，45 (5):322-324.

[5]Frazer LC，Darville T，Chandra-Kuntal K，et al.Plasmid-curedChlamydiacaviaeactivates TLR2-dependentsignaling and retains virulence in the guinea pig model of genital tract infection[J].PLoS One，2012，7(1):e30747.

[6]O′Connell CM，AbdelRahman YM，Green E，et al.Toll-like receptor 2 activation byChlamydia trachomatisis plasmid dependent，and plasmid-responsive chromosomal loci are coordinately regulated in response to glucose limitation by C. trachomatis but not byC.muridarum[J].Infect Immun，2011，79 (3):1044-1056.

[7]Li Z，Chen D，Zhong Y，et al.The chlamydial plasmid-encoded protein pgp3 is secreted into the cytosol ofChlamydia-infected cells[J].Infect Immun，2008，76(8):3415-3428.

[8]Hickey DK，Patel MV，F(xiàn)ahey JV，et al.Innate and adaptive immunity at mucosal surfaces of the female reproductive tract:stratification and integration of immune protection against the transmission of sexually transmitted infections[J].J Reprod Immunol，2011，88 (2):185-194.

[9]Sharma S，Sethi S，Prasad R，et al.Characterization of low molecular weight antimicrobial peptide from human female reproductive tract.Indian J Med Res，2011，134(5):679-687.

[10]Donati M，Di Leo K，Benincasa M，et al.Activity of cathelicidin peptides againstChlamydia spp[J].Antimicrob Agents Chemother，2005，49(3):1201-1202.

[11]Donati M，Di Francesco A，Gennaro R，et al.Sensitivity ofChlamydia suisto cathelicidin peptides[J].Vet Microbiol，2007，123(1-3): 269-273.

[12]鄧紅玉，李忠玉，吳移謀，等.沙眼衣原體pORF5質粒蛋白誘發(fā)小鼠生殖道免疫損傷初步研究[J].中華微生物學和免疫學雜志，2013，33(2):107-111.

[13]Zhou H，Huang Q，Li Z，et al.pORF5 plasmid protein ofChlamydia trachomatisinduces MAPK-mediated proinflammatory cytokines via TLR2 activation in THP-1 cells[J].Sci China Life Sci，2013，56(5):460-466.

[14]Murthy AK，Li W，Chaganty BK，et al.Tumor necrosis factor alpha production from CD8+T cells mediates oviduct pathological sequelae following primary genitalChlamydiamuridaruminfection[J].Infect Immun，2011，79(7):2928-2935.

[15]Bergman P，Johansson L，Asp V，et al.Neisseria gonorrhoeaedown regulates expression of the human antimicrobial peptide LL-37[J].Cell Microbiol，2005，7(7):1009-1017.

2014-01-07)

(本文編輯:吳曉初)

pORF5 plasmid protein promotesChlamydia trachomatisinfection through inhibition of the antibacterial peptide LL37:a preliminary study

Ma Kangkang，Li Zhongyu*，Su Shengmei，Cao Wenjuan，Dai Wenting，Yang Xiaoyu，He Hongmei，Zhong Guangming.*Institute of Pathogenic Biology，Medical College，University of South China，Hengyang 421001，Hunan，China

Li Zhongyu，Email:nhlzhy1023@126.com

ObjectiveTo investigate whether pORF5 plasmid protein promotesChlamydia trachomatis(Ct) infection through inhibition of the antibacterial peptide LL37，and to explore its potential molecular mechanism.MethodsAfter expression and purification，the glutathione S-transferase(GST)-pORF5 fusion protein was digested with proteases to obtain pORF5 protein without GST tag.Some Hela cells were classified into four groups:Ct group infected with unpretreated Ct，pORF5 group infected with Ct that had been pretreated with pORF5 of 30 μg/ml for 2 hours，LL37 group infected with Ct that had been pretreated with LL37 of 20 μg/ml for 2 hours，combination group infected with Ct that had been pretreated with pORF5 of 30 μg/ml and LL37 of 20 μg/ml for 2 hours.After additional culture，indirect immunofluorescence assay was performed to count the number of Ct inclusion-forming units(IFUs)，and real-time，fluorescence-based quantitative PCR and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA) to detect the protein and mRNA expressions of tumor necrosis factor-α(TNF-α)respectively.Some Hela cells were divided into three groups:blank control group remaining untreated，Ct group infected with unpretreated Ct，pORF5 group infected with Ct that had been pretreated with pORF5 of 30 μg/ml for 2 hours.After 6 hours of additional culture，real-time，fluorescence-based quantitative PCR and ELISA were conducted to measure the mRNA and protein expressions of LL37，respectively.ResultsThe concentration of IFUs was significantly higher in the Ct group，pORF5 group and combination group than in the LL37 group(3.8×105/ml，3.0×105/ml and 3.1×105/ml vs.2.0×105/ml，allP＜0.05)，with no significant differences between the Ct group，pORF5 group and combination group(P＞0.05).The expressions of TNF-α mRNA and protein were significantly increased in the combination group compared with the LL37 group.The mRNA expression of LL37 was reduced by 19%in the pORF5 group compared with the Ct group.ConclusionspORF5 plasmid protein could promote Ct infection by counteracting the antibacterial peptide LL37，which may be associated with the up-regulation of TNF-α expression and downregulation of LL37 expression in Ct-infected cells.

Chlamydia trachomatis;pORF5 plasmid protein;LL37;Antimicrobial peptides

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.005

國家自然科學基金(81102230、31470277);湖南省高校創(chuàng)新平臺開放基金(13K081);湖南省普通高等學校重點實驗室資助項目(湘教通[2012]312號);湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程培養(yǎng)項目(2013-13)

421001湖南衡陽,南華大學醫(yī)學院病原生物學研究所[馬康康(現(xiàn)在吉首大學醫(yī)學院病原生物學教研室, 416000湖南吉首)、李忠玉、粟盛梅、曹文娟、戴文婷、楊曉玉、賀紅梅];美國德州大學圣安東尼奧健康科學中心(鐘光明)

李忠玉,Email:nhlzhy1023@126.com