夏汝山 顧靜 陶詩沁 楊莉佳

凝集生長毛乳頭細(xì)胞分泌性蛋白組的初步分析

夏汝山 顧靜 陶詩沁 楊莉佳

目的了解毛乳頭細(xì)胞在凝集生長狀態(tài)下分泌性蛋白組的表達(dá)。方法以凝集和非凝集生長的毛乳頭細(xì)胞為研究對象,分別制備分泌性蛋白質(zhì),以雙向凝膠電泳技術(shù)和PDQuest軟件分析二者之間的蛋白圖譜的差異,通過基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜(MLDI-TOF-MS)鑒定表達(dá)差異的蛋白質(zhì),通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫NCBInr檢索分析。結(jié)果建立了重復(fù)性好、分辨率高的雙向電泳圖譜;在凝集生長和非凝集生長的毛乳頭細(xì)胞分泌性蛋白質(zhì)中分別檢測到(1 134±52)個和(1 078±36)個蛋白點,大多匹配。按照差異量在5倍以上的標(biāo)準(zhǔn),二者存在差異蛋白質(zhì)28個,經(jīng)過MLDI-TOF-MS質(zhì)譜鑒定出10種差異表達(dá)蛋白點,其中8種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),分別為Rho GDP分離抑制劑1、細(xì)絲蛋白A、胱抑素C、纖維連接蛋白、親環(huán)素A、前膠原C端蛋白酶增強子、組織金屬蛋白酶抑制劑、組織金屬蛋白酶-2抑制劑。2種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào),為神經(jīng)肽h3和基質(zhì)金屬蛋白酶-3金屬蛋白酶組織抑制劑-1復(fù)合物復(fù)合物。結(jié)論凝集生長和非凝集生長毛乳頭細(xì)胞差異蛋白主要涉及信號通路、細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解等功能。

毛乳頭細(xì)胞;分泌蛋白質(zhì)類;電泳,凝膠,雙向;MALDI-TOF質(zhì)譜

毛乳頭是毛囊的真皮部分,體外培養(yǎng)時呈凝集性生長為其特性之一,有誘導(dǎo)毛囊形成和再生的能力。隨著細(xì)胞傳代至第6～15代時,毛乳頭細(xì)胞(dermal papilla cells，DPC)失去凝集性生長特性并失去誘導(dǎo)毛囊形成和毛囊再生的能力。研究證實,凝集生長的DPC分泌大量蛋白樣因子,共同調(diào)節(jié)其他DPC、外根鞘細(xì)胞和角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖[1]。研究這些蛋白質(zhì),對于闡明毛囊周期調(diào)控,解決脫發(fā)問題具有一定的價值。然而,這些有重要功能的蛋白質(zhì)大多是低豐度蛋白質(zhì),由于含量少,樣品制備成為實驗的關(guān)鍵。在前期[2]工作中,我們建立了制備DPC分泌性蛋白質(zhì)組方法。在本研究中,我們通過蛋白質(zhì)組學(xué)比較凝集與非凝集生長DPC的蛋白表達(dá)差異,探討DPC凝集生長的生理基礎(chǔ)。

材料與方法

一、材料

1.試劑及儀器:DMEM培養(yǎng)基為美國Hyclone公司產(chǎn)品;IPG膠條(pH3～10,13 cm)、IPG緩沖液、DTT、碘乙酰胺、CHAPS、尿素、丙烯酰胺、甲叉丙烯酰胺、Tris為美國Amersham Pharmacia產(chǎn)品;三氟乙酸、胰蛋白酶為美國Sigma產(chǎn)品。硝酸銀為國產(chǎn)試劑。雙向電泳模具、IPGPhorⅡ型等電聚焦儀和SE600電泳儀為美國Amersham Pharmacia公司產(chǎn)品;凝膠掃描儀為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品;MALDITOF質(zhì)譜儀為德國Burker公司產(chǎn)品。

2.標(biāo)本:所需毛乳頭來自門診外科頭皮術(shù)后殘留的含毛發(fā)正常組織。經(jīng)無錫市第二人民醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng):采用“二步酶”法分離和培養(yǎng)人頭皮毛乳頭,DPC在常規(guī)條件下擴(kuò)大培養(yǎng),培養(yǎng)第3代以前為凝集性生長DPC,第6代以后為非凝集性生長DPC(圖1)。細(xì)胞生長至80%融合時,用0.1 mol/L PBS洗滌3次,加入適量Williams E無血清培養(yǎng)基,孵育24 h后收集無血清培養(yǎng)上清,在4℃低溫、1 699×g條件下離心1 h,收集上清液。

2.蛋白質(zhì)樣品制備:DPC分泌性蛋白質(zhì)制備,參照已建立的方法[2]。

3.雙向電泳及圖像分析:雙向電泳參照G?rg等[3]描述的方法,150 μg總蛋白與重水化液(8 mol/L尿素,2%CHAPS,60 mmol/L DTT和0.5%IPG緩沖液pH 3～10)混合,總體積250 μl吸入IPG膠槽,置于IPGphor等電聚焦儀電極板上,重水化和等電聚焦在20℃自動進(jìn)行,總電壓時間積40 000 Vh。等電聚焦后于平衡液中平衡2次。SDS-PAGE在SE600電泳儀中進(jìn)行。電泳結(jié)束后,用質(zhì)譜兼容的銀染法染色,超純水脫色至背景清楚。用Gel Doc 2000成像系統(tǒng)對凝膠進(jìn)行掃描,圖像經(jīng)PDQuest分析軟件進(jìn)行處理并比較差異蛋白質(zhì)點。

4.肽質(zhì)量指紋譜(PMF)鑒定:選取差異5倍以上的蛋白點,從凝膠上準(zhǔn)確切割后用水清洗幾次后用含50%乙腈,25 mmol/L NH4HCO3溶液浸泡膠片,至膠片中藍(lán)色褪盡;真空離心干燥使膠片完全脫水,加入0.01 μg/μl的胰酶溶液5～10 μl,待酶液完全吸收后補充10 μl 25 mmol/L NH4HCO3,37℃保溫15 h;加5%三氟乙酸50～100 μl于40℃保溫1 h,吸出上清,加入2.5%三氟乙酸,50%乙腈50～100 μl于30℃保溫1 h,吸出上清,合并上清液,冷凍干燥。制備好的樣品置于質(zhì)譜儀上進(jìn)行分析,采用線性模式、正離子譜測定,離子源加速電壓1為20 kV,加速電壓2為18.85 kV,N2激光波長337 nm,脈沖寬度為3 ns,離子延遲提取500 ns,真空度4× 10-7Torr,質(zhì)譜信號單次掃描累加50次,并用基質(zhì)峰和胰蛋白酶自動降解離子峰為內(nèi)標(biāo)校正質(zhì)譜峰,獲得PMF。

5.數(shù)據(jù)庫查詢:通過中國國家生物醫(yī)學(xué)中心的蛋白質(zhì)組學(xué)網(wǎng)站(www.proteomics.com.cn),Mascot網(wǎng)站(http://www.matrixscience.com/)查詢。

6.統(tǒng)計學(xué)分析:雙向電泳實驗重復(fù)3次,電泳圖譜經(jīng)PDQuest軟件分析,蛋白點數(shù)以±s表示。MASCOT是數(shù)據(jù)庫檢索軟件,質(zhì)譜分析中以MASCOT評分作為一個直觀的數(shù)值來評價一個結(jié)果是否可信,Mascot分?jǐn)?shù)高低取決于數(shù)據(jù)庫的大小與設(shè)定的P值,我們以MASCOT評分＞65,P＜0.05認(rèn)定結(jié)果可信,以得分最高的蛋白作為匹配蛋白。

結(jié)果

一、凝集與非凝集性生長毛乳頭細(xì)胞生長特征

低傳代DPC呈現(xiàn)凝集性生長特征(圖1a),第6代后的DPC呈梭形,表現(xiàn)為成纖維細(xì)胞形態(tài),不出現(xiàn)凝集性生長特征,為非凝集性生長DPC(圖1b)。

圖1 毛乳頭細(xì)胞的生長狀態(tài) 1a:凝集生長毛乳頭細(xì)胞,細(xì)胞呈現(xiàn)聚集成細(xì)胞團(tuán)的生長特點;1b:非凝集生長毛乳頭細(xì)胞,細(xì)胞呈現(xiàn)成纖維細(xì)胞特點,呈梭形,非聚集生長

二、雙向電泳結(jié)果

本研究建立了重復(fù)性較好、分辨率較高的雙向凝膠電泳銀染圖譜(圖2)。在凝集生長和非凝集生長的DPC分泌性蛋白質(zhì)中分別檢測到(1 134±52)個和(1 078±36)個蛋白點,各點清晰獨立。差異蛋白點主要集中在分子量較低的蛋白質(zhì),與分泌性蛋白質(zhì)的特點相吻合。按照差異量在5倍以上的標(biāo)準(zhǔn),凝集生長和非凝集生長毛乳頭細(xì)胞存在差異蛋白質(zhì)28個。

圖2 毛乳頭細(xì)胞分泌性差異蛋白質(zhì)雙向電泳圖譜,二者大多匹配,差異點主要集中在低分子量蛋白質(zhì),在此區(qū)域凝集生長毛乳頭細(xì)胞的蛋白點數(shù)高于非凝集生長毛乳頭細(xì)胞 2a:凝集生長毛乳頭細(xì)胞;2b:非凝集生長毛乳頭細(xì)胞

三、質(zhì)譜鑒定和數(shù)據(jù)庫檢索

通過MALDI-TOF/TOF質(zhì)譜儀鑒定差異蛋白點,11個蛋白點獲得很好的PMF圖譜,與10個蛋白質(zhì)相匹配(表1),其中8種蛋白質(zhì)表達(dá)上調(diào),分別為Rho GDP分離抑制劑1(Rhogdi 1)、細(xì)絲蛋白A、胱抑素C、纖維連接蛋白、親環(huán)素A、前膠原C端蛋白酶增強子(PCPE-1)、組織金屬蛋白酶抑制劑(TIMP)、組織金屬蛋白酶-2抑制劑(TIMP-2);2種蛋白質(zhì)表達(dá)下調(diào),為神經(jīng)肽h3和基質(zhì)金屬蛋白酶-3金屬蛋白酶組織抑制劑-1復(fù)合物(Mmp-3TIMP-1)復(fù)合物。根據(jù)質(zhì)譜鑒定信息查詢數(shù)據(jù)庫,這些差異蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解等生理過程等。

表1 凝集生長和非凝集生長毛乳頭細(xì)胞質(zhì)譜鑒定的差異分泌蛋白質(zhì)

討論

毛乳頭是毛囊生長和毛發(fā)周期的控制中心,毛乳頭細(xì)胞的生長狀態(tài)決定其生理功能,因此研究凝集和非凝集生長狀態(tài)下毛乳頭細(xì)胞蛋白表達(dá)差異有助于闡明毛乳頭在毛囊生長和周期調(diào)控中的作用。比較蛋白質(zhì)組學(xué)已經(jīng)成功用于分泌性蛋白質(zhì)組研究[4]。本實驗中,我們應(yīng)用比較蛋白組學(xué)技術(shù)對凝集和非凝集生長狀態(tài)下毛乳頭細(xì)胞分泌的差異蛋白質(zhì)進(jìn)行了研究,在多次探索實驗條件后,根據(jù)優(yōu)化的實驗條件進(jìn)行雙向電泳,獲得了重復(fù)性較好、分辨率較高的雙向凝膠電泳銀染圖譜。在凝集和非凝集生長的DPC分泌性蛋白質(zhì)中分別檢測到(1 134± 52)個和(1 078±36)個蛋白點,各點清晰獨立。按照差異量在5倍以上的標(biāo)準(zhǔn),凝集生長和非凝集生長毛乳頭細(xì)胞存在差異蛋白質(zhì)28個,其中11個獲得良好的肽質(zhì)量指紋譜,與10種蛋白質(zhì)相匹配,8種蛋白質(zhì)在凝集性生長狀態(tài)下表達(dá)上調(diào),2種蛋白質(zhì)在凝集性生長條件下表達(dá)下調(diào)。通過數(shù)據(jù)庫查詢得知,這些差異蛋白質(zhì)主要參與了細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞外基質(zhì)合成及降解等生理過程等。

由于DPC分泌性蛋白質(zhì)以低豐度的形式存在,增加了通過雙向電泳進(jìn)行分析的難度,為此我們采用了與質(zhì)譜兼容的銀染法,在保證蛋白較好分離的基礎(chǔ)上增加了敏感性。本實驗鑒定的10種差異蛋白質(zhì)中5種蛋白質(zhì)參與信號通路、細(xì)胞增殖與分化,包括細(xì)絲蛋白、纖維連接蛋白、胱抑素C、親環(huán)素A和Rho GDI 1。細(xì)絲蛋白參與細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)信號通路[5];纖維連接蛋白和胱抑素C參與細(xì)胞增殖等[6-7]。親環(huán)素A參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo),維持發(fā)育中或變性蛋白質(zhì)的正確結(jié)構(gòu)[8]。Rho GDI 1參與細(xì)胞運動調(diào)控[9]。4種蛋白質(zhì)為細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,包括 TIMP、TIMP-2、Mmp-3TIMP-1和PCPE-1,在調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的合成和降解中發(fā)揮關(guān)鍵作用[10-11]。我們推測,這些信號分子和基質(zhì)蛋白可能與毛乳頭細(xì)胞的凝集性生長和毛囊生長發(fā)育相關(guān)。

神經(jīng)肽是存在于神經(jīng)組織并參與神經(jīng)系統(tǒng)功能作用的一類特殊的信息物質(zhì),神經(jīng)肽h3曾在肺癌組織中被發(fā)現(xiàn)[12],未見于其他組織和細(xì)胞。本研究中神經(jīng)肽h3的出現(xiàn)是否與毛乳頭生長相關(guān)尚不清楚,需要深入探討。

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2014-01-01)

(本文編輯:吳曉初)

A preliminary analysis of the secretome of aggregated dermal papilla cells

Xia Rushan，Gu Jing，Tao Shiqin，Yang Lijia.Department of Dermatology，Wuxi No.2 People′s Hospital，Nanjing Medical University，Wuxi 214002，Jiangsu，China

Yang Lijia，Email:yanglijia726@163.com

ObjectiveTo study the expression of secreted proteins in aggregated dermal papilla cells (DPCs).MethodsDPCs were isolated from human scalp tissue and subjected to primary culture and subculture. Aggregated and non-aggregated DPCs served as the subject of this study.Secreted proteins were prepared from these cells and subjected to two-dimensional polyacrylamide gel electrophoresis.Differentially expressed proteins were screened by the PDQuest image analysis software.Protein spots were digested and identified by matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight(MALDI-TOF)mass spectrometry，and finally analyzed using the National Center forBiotechnologyInformation (NCBI)non-redundant(Nr)proteindatabase.ResultsTwo-dimensional electrophoresis maps with good repeatability and high resolution were established.Image analysis of 2-D gels revealed that the average number of detected protein spots was 1 134±52 and 1 078±36 in aggregated and nonaggregated DPCs respectively，and the majority of these protein spots were matched between aggregated and nonaggregated DPCs.Twenty-eight protein spots showed more than 5-fold difference between the two groups of cells，and 10 proteins were preliminarily identified as differentially expressed proteins by peptide-mass fingerprinting.Of these differentially expressed proteins，8 proteins including Rhogdi 1，filamin A，cystatin C，fibronectin，cyclophilin A，procollagen C proteinase enhancer 1，tissue inhibitor of metalloproteinase and tissue inhibitor of metalloproteinase-2 were up-regulated，and 2 proteins including neuropolypeptide h3 and matrix metalloproteinase-3/tissue inhibitor of metalloproteinase-1 complex were down-regulated in aggregated DPCs compared with non-aggregated DPCs.ConclusionsDifferentially expressed proteins between aggregated and non-aggregated DPCs are mainly implicated in cell signaling pathway，cellular proliferation and differentiation，extracellular matrix synthesis and degradation，and so on.

Dermal papilla cells;Secretory proteins;Electrophoresis，gel，two-dimensional;MALDI-TOF mass spectrometry

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.003

南京醫(yī)科大學(xué)科技發(fā)展基金(2011NJMUZ05);無錫市衛(wèi)生局科研計劃項目(ML201202)

214002江蘇無錫,南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫市第二人民醫(yī)院皮膚科

楊莉佳,Email:yanglijia726@163.com