李志量 張曉東 陳浩 劉沐桑 靳培英 馮素英 王寶璽

抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡一例研究

李志量 張曉東 陳浩 劉沐桑 靳培英 馮素英 王寶璽

患者男,55歲。臨床表現(xiàn)為四肢、軀干緊張性大皰,組織學(xué)表現(xiàn)為表皮下水皰,真皮淺層有淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞等浸潤(rùn),初步診斷為大皰性類天皰瘡(BP)。在血清學(xué)分析中,發(fā)現(xiàn)該患者血清中自身抗體與鹽裂皮膚真皮側(cè)結(jié)合,且酶聯(lián)免疫吸附法未檢測(cè)到BP180、BP230、Ⅶ型膠原抗體,從而排除了大皰性類天皰瘡、獲得性大皰性表皮松解癥的診斷。通過(guò)免疫印跡、免疫沉淀檢測(cè),發(fā)現(xiàn)該患者血清存在與真皮側(cè)200 000蛋白結(jié)合的抗體,綜合這些特點(diǎn),診斷該患者為抗P200類天皰瘡,即抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡。

抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡;抗P200類天皰瘡;印跡法,蛋白質(zhì)

抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡(anti-laminin γ1 pemphigoid)是一種罕見(jiàn)的自身免疫性水皰病,免疫學(xué)特點(diǎn)與以往已知的表皮下水皰病,如大皰性類天皰瘡(bullous pemphigoid,BP)、獲得性大皰性表皮松解癥(epidermolysis bullosa acquisita,EBA)、瘢痕性類天皰瘡(cicatricial pemphigoid,CP)等有一定區(qū)別。該病患者血清中循環(huán)抗體與真皮側(cè)提取物的200 000蛋白結(jié)合,后來(lái)該蛋白被證實(shí)為層黏連蛋白γ1,是一種細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,為多種層黏連蛋白三聚體的組成成分。

病歷資料

患者男,55歲,入院前1個(gè)月無(wú)明顯誘因口腔及周圍出現(xiàn)紅斑,面積逐漸擴(kuò)大,在紅斑基礎(chǔ)上出現(xiàn)水皰,皰液澄清,皰壁緊張,自覺(jué)瘙癢,在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為大皰性類天皰瘡,給予甲潑尼龍40 mg每日1次靜脈滴注共3 d,控制不佳,軀干、四肢、頭皮也出現(xiàn)多個(gè)水皰、大皰,自覺(jué)發(fā)熱、乏力。來(lái)我院就診時(shí),體檢見(jiàn)背部散在紅斑、糜爛面,部分皮疹表面結(jié)痂(圖1a)。四肢散在皰壁緊張的水皰(圖1b),尼氏征(-)。在我院行組織病理學(xué)檢查提示表皮下水皰,真皮淺層及血管周圍見(jiàn)淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1c)。直接免疫熒光檢查示基底膜帶IgG和C3呈線狀沉積,初步診斷大皰性類天皰瘡。入院后給予靜脈注射免疫球蛋白400 mg·kg-1·d-1,甲潑尼龍80 mg/d共10 d,環(huán)磷酰胺0.6 g(僅用1次),無(wú)法控制水皰形成;將甲潑尼龍?jiān)鲋?00 mg/d,靜脈滴注5 d,新發(fā)水皰仍未得到控制;隨后停用甲潑尼龍,改為地塞米松15 mg/d,加用麥考酚酯2 g/d,皮損逐漸控制。在隨后的地塞米松減量過(guò)程中,皮損曾出現(xiàn)短暫的反復(fù),經(jīng)過(guò)1個(gè)月的維持治療,水皰逐漸干涸結(jié)痂。

材料與方法

1.主要實(shí)驗(yàn)材料:正常人皮膚取自皮膚外科整形手術(shù)后殘留皮瓣。實(shí)驗(yàn)中涉及到的主要化學(xué)試劑和試劑盒包括:鼠抗人層黏連蛋白γ1單克隆抗體(美國(guó)Santa Cruz公司),鼠抗人Ⅶ型膠原抗體(美國(guó)Sigma公司)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠、山羊抗人IgG抗體(上海碧云天生物技術(shù)研究所),異硫氰酸熒光素標(biāo)記山羊抗人IgG、IgA、IgM、C3抗體(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司),10%Bis-tris預(yù)制膠、MOPS電泳緩沖液、上樣緩沖液,蛋白預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)參照物,化學(xué)發(fā)光液,Classic IP試劑盒(美國(guó)Thermo公司),橋粒芯蛋白 Dsg1、Dsg3、BP180 NC16A、BP230、Ⅶ型膠原抗體檢測(cè)試劑盒(日本MBL公司)。

2.鹽裂間接免疫熒光(SSIIF):利用鹽裂皮膚為底物,按常規(guī)間接免疫熒光步驟進(jìn)行,使用熒光顯微鏡(Nikon Eclipse 50i)觀察。

3.真表皮抗原制備:分別用表皮抗原提取液(65 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L乙二胺四乙酸, 50 mmol/L二硫蘇糖醇,2%十二烷基硫酸鈉,pH6.8)和真皮抗原提取液(65 mmol/L Tris-HCl,10 mmol/L乙二胺四乙酸,100 mmol/L二硫蘇糖醇,2%十二烷基硫酸鈉,8 mol/L尿素,pH6.8)提取表皮、真皮蛋白,儲(chǔ)存于-70℃?zhèn)溆谩?/p>

4.免疫印跡:將真、表皮蛋白分別與4×上樣緩沖液預(yù)混,加熱變性后上樣,200 V電泳45 min。轉(zhuǎn)至PVDF膜,濕法轉(zhuǎn)印,300 mA恒流2 h,BSA室溫?fù)u床振蕩封閉1 h。分別與抗層黏連蛋白γ1單抗(1∶200稀釋)、患者血清(1∶50稀釋)在4℃搖床振蕩孵育16 h,TBST洗滌后,加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h。TBST洗去未結(jié)合的二抗,采用化學(xué)發(fā)光法在凝膠成像儀 (Bio-rad ChemiDocTMXRS+)上觀察各自條帶。

5.酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(ELISA):嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,用酶標(biāo)儀(BioTek Synergyht)讀取吸光度值,按照說(shuō)明書(shū)提供的公式計(jì)算血清抗體滴度值。

6.免疫沉淀:使用商品化的免疫沉淀試劑盒(Classic IP試劑盒，Thermo Scientific 26146),利用抗層黏連蛋白γ1單抗沉淀出真皮側(cè)蛋白,然后按免疫印跡步驟將蛋白上樣,電泳轉(zhuǎn)膜后與血清(1∶50稀釋)孵育;用Ⅶ型膠原抗體和EBA患者血清作對(duì)照。

結(jié)果

鹽裂間接免疫熒光示患者血清中IgG與鹽裂皮膚真皮側(cè)蛋白結(jié)合(圖1d),IgA、IgM陰性。3次免疫印跡結(jié)果均發(fā)現(xiàn)患者血清抗體與表皮側(cè)蛋白不反應(yīng),與真皮側(cè)蛋白結(jié)合于200 000處,層黏連蛋白γ1單克隆抗體與真皮側(cè)蛋白結(jié)合于200 000處,1例EBA患者血清抗體與290 000處蛋白結(jié)合(圖2)。應(yīng)用商品化ELISA試劑盒,患者血清中Dsg1、Dsg3、BP180、BP230、Ⅶ型膠原抗體均為陰性。免疫沉淀實(shí)驗(yàn)中,分別用抗層黏連蛋白γ1單抗和Ⅶ型膠原抗體沉淀真皮側(cè)蛋白,然后分別與患者、EBA患者和正常對(duì)照血清結(jié)合,發(fā)現(xiàn)患者血清可以與層黏連蛋白γ1抗體沉淀出的蛋白反應(yīng),結(jié)合于200 000處,而EBA患者和正常對(duì)照血清與該蛋白不反應(yīng),EBA患者血清可以與Ⅶ型膠原抗體沉淀出的蛋白反應(yīng),結(jié)合于290 000處,患者血清與該蛋白不反應(yīng)(圖3)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果,該患者最后診斷為抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡。

討論

圖1 患者病歷資料 1a:背部見(jiàn)紅斑糜爛面,部分皮疹結(jié)痂;1b:手背側(cè)見(jiàn)皰壁緊張的水皰;1c:皮損組織病理:表皮下水皰形成,真皮淺層見(jiàn)淋巴細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(HE×200);1d:鹽裂皮膚間接免疫熒光示IgG抗體沉積在真皮側(cè)

圖2 免疫印跡結(jié)果 1:患者血清與表皮側(cè)蛋白不反應(yīng);2:BP患者血清與表皮側(cè)蛋白沉積于180 000、230 000處;3:抗層黏連蛋白γ1抗體結(jié)合于真皮側(cè)蛋白200 000處;4:患者血清與真皮側(cè)200 000蛋白結(jié)合;5:EBA患者血清與真皮側(cè)290 000蛋白結(jié)合;6:正常對(duì)照、血清與真皮側(cè)蛋白不反應(yīng);7:BP患者血清與真皮側(cè)蛋白不反應(yīng)

圖3 免疫沉淀檢測(cè)結(jié)果 1:患者血清與層黏連蛋白γ1單抗沉淀蛋白結(jié)合于200 000處;2、3:EBA患者、正常對(duì)照血清與層黏連蛋白γ1單抗沉淀蛋白不反應(yīng);4:EBA患者血清與Ⅶ型膠原抗體沉淀蛋白結(jié)合于290 000處;5:患者血清與Ⅶ型膠原抗體沉淀蛋白不反應(yīng)

1996年,Chen等[1]報(bào)道了1例銀屑病患者同時(shí)伴發(fā)表皮下水皰病,該病患者血清中存在針對(duì)真皮側(cè)200 000蛋白的抗體。同年,Zillikens等[2]報(bào)道了1例不伴銀屑病的表皮下水皰病,該患者血清中也存在針對(duì)真皮側(cè)200 000蛋白的抗體。這兩例患者有著共同的特點(diǎn):臨床表現(xiàn)均與BP相似,病理表現(xiàn)為真皮中性粒細(xì)胞為主的浸潤(rùn),直接免疫熒光見(jiàn)IgG、C3在基底膜帶呈線狀沉積;SSIIF示血清抗體結(jié)合于鹽裂皮膚的真皮側(cè);電鏡觀察到免疫復(fù)合物沉積于透明板的下層;免疫印跡顯示血清抗體與真皮側(cè)200 000蛋白結(jié)合。綜合這些特點(diǎn),這兩例與常見(jiàn)的表皮下水皰病,如BP、EBA、CP等有明顯區(qū)別,是一個(gè)新病種,命名為抗P200類天皰瘡。此后,很多研究試圖揭示抗P200類天皰瘡患者血清中抗體所針對(duì)的靶抗原,這些可能的靶抗原包括層黏連蛋白β1[3]、巢蛋白[4]、Ⅵ型膠原的α鏈、細(xì)絲蛋白A[5]、Ⅶ型膠原降解產(chǎn)物[6]等,盡管這些蛋白位于真皮側(cè),且相對(duì)分子質(zhì)量接近200 000,但證實(shí)這些蛋白與P200抗血清均無(wú)相關(guān)性。直到2009年,Dainichi等[7]通過(guò)2D電泳、質(zhì)譜分析將這200 000抗原確定為層黏連蛋白γ1,此后該病即被命名為抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡。

BP和EBA患者血清中自身抗體會(huì)識(shí)別一個(gè)特定表位,如BP血清識(shí)別BP180 NC16A[8],EBA血清識(shí)別Ⅶ型膠原NC1段[9],且識(shí)別這一特定表位的抗體具有致病性,可以通過(guò)針對(duì)這一表位的抗體構(gòu)建相應(yīng)的動(dòng)物模型。但抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡卻很特殊;90%抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡患者血清自身抗體可以與層黏連蛋白γ1羧基末端的246個(gè)氨基酸段(hLAMC1-cterm)結(jié)合[7],但純化的患者血清中針對(duì)該肽段的抗體卻沒(méi)有致病性[10];用該肽段免疫兔產(chǎn)生的多克隆抗體也未能成功構(gòu)建該病的動(dòng)物模型[11]。在Florea等[12]的研究中,針對(duì)層黏連蛋白γ1氨基端的抗體可以干擾層黏連蛋白γ1與巢蛋白的結(jié)合,并能激活補(bǔ)體、誘導(dǎo)粒細(xì)胞活性氧釋放、引起真表皮分離,提示針對(duì)氨基段的抗體有致病性,但7例中僅1例患者血清中存在針對(duì)層黏連蛋白γ1氨基端的抗體,這種識(shí)別表位與致病表位的“分離”現(xiàn)象尚待進(jìn)一步研究。

綜合國(guó)外報(bào)道的該病病例,可總結(jié)如下特點(diǎn):該病發(fā)病年齡多為50～70歲,近半數(shù)伴有銀屑病?；颊呖梢猿霈F(xiàn)緊張性水皰和蕁麻疹樣發(fā)疹,伴有瘙癢,臨床表現(xiàn)與大皰性類天皰瘡難以鑒別。其病理表現(xiàn)為真皮中性粒細(xì)胞浸潤(rùn),也可形成微膿腫,也有部分患者可見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)[13]。本例患者臨床表現(xiàn)、病理學(xué)檢查及直接免疫熒光檢查均符合BP。但SSIIF檢查發(fā)現(xiàn)患者血清抗體沉積于鹽裂皮膚真皮側(cè),且ELISA法無(wú)法檢測(cè)到BP180 NC16A、BP230抗體,因此可排除大皰性類天皰瘡的診斷。目前常見(jiàn)的血清抗體沉積于鹽裂皮膚真皮側(cè)的大皰病主要是EBA和CP,EBA患者血清應(yīng)與真皮290 000蛋白結(jié)合,而該患者免疫印跡結(jié)果與之不符,且用ELISA法也未能檢測(cè)到Ⅶ型膠原抗體,故排除EBA的診斷。CP患者循環(huán)抗體可結(jié)合于表皮側(cè),抗層黏連蛋白5 CP患者的IgG循環(huán)抗體結(jié)合在真皮側(cè),層黏連蛋白5的3個(gè)亞基laminin α3、β3、γ2的相對(duì)分子質(zhì)量均不是200 000,且CP患者突出表現(xiàn)為黏膜受損,這些特點(diǎn)均與本例不符。該患者重復(fù)3次免疫印跡檢查均發(fā)現(xiàn)血清抗體結(jié)合于真皮側(cè)200 000蛋白處。查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn),血清抗體與真皮側(cè)200 000蛋白結(jié)合的表皮下大皰病只有抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡,結(jié)合該例患者SSIIF及ELISA結(jié)果,我們認(rèn)為本例患者應(yīng)該診斷為抗層黏連蛋白γ1類天皰瘡。

但我們的研究也有不足之處,在既往國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)的該病患者中,病情大多較輕,少數(shù)患者不經(jīng)治療可以自愈,且組織學(xué)表現(xiàn)以中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)為主,嗜酸性粒細(xì)胞較少;而本例患者病情相對(duì)較重,初期對(duì)治療抵抗,病理學(xué)檢查并未發(fā)現(xiàn)明顯的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn);這些現(xiàn)象的原因尚待進(jìn)一步闡明。

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2014-01-09)

(本文編輯:吳曉初)

Anti-laminin γ1 pemphigoid:a case report

Li Zhiliang，Zhang Xiaodong，Chen Hao，Liu Musang，Jin Peiying，F(xiàn)eng Suying，Wang Baoxi.Jiangsu Key Laboratory of Molecular Biology for Skin Diseases and STIs;Hospital of Dermatology，Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College，Nanjing 210042，China

s:Wang Baoxi，Email:wangbx@ncstdlc.org;Feng Suying，Email:fengsuying2010@aliyun.com

A 55-year-old male patient presented with tense bullae on the extremities and trunk.Histological examination revealed subepidermal vesicles and superficial dermal infiltration of eosinophils and lymphocytes.The patient was primarily diagnosed with bullous pemphigoid.However，serum autoantibodies of the patient bound to the dermal side of salt-split skin，and no serum antibodies against BP180，BP230 or typeⅦ collagen were detected by enzyme-linked immunosorbent assay.Hence，the diagnoses of bullous pemphigoid and epidermolysis bullosa acquisita were excluded.As Western blot and immunoprecipitation analysis showed，there existed antibodies capable of binding to a dermal antigen with a relative molecular mass of 200 000 in the serum of the patient.Based on the above findings，the patient was diagnosed as anti-laminin γ1(p200)pemphigoid.

Anti-laminin γ1 pemphigoid;Anti-p200 pemphigoid;Blotting，Western

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.001

衛(wèi)生公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201002016);江蘇省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自擬課題(201220009)

210042南京,中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病醫(yī)院,江蘇省皮膚病與性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室

王寶璽,Email:wangbx@ncstdlc.org;馮素英,Email: fengsuying2010@aliyun.com