賈 欣，韓淑萍，孫惠斌，王宇輝，張超鋒，杜 斌

1)鄭州大學(xué)藥學(xué)院 鄭州450001 2)鄭州市第二人民醫(yī)院藥劑科 鄭州450006

2－甲氧基雌二醇(2－ME)是一種新型甾體激素類抗腫瘤藥物，目前在國(guó)外處于Ⅱ期臨床研究階段［1－2］。體內(nèi)外藥效學(xué)研究［3－5］表明，2－ME 對(duì)多種腫瘤細(xì)胞均有良好的抗腫瘤作用，且具有高效低毒、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)。然而2－ME 水溶性差，口服吸收無(wú)規(guī)律，明顯的首過(guò)效應(yīng)［6］限制了其應(yīng)用。針對(duì)這些缺點(diǎn)設(shè)計(jì)了供靜脈注射用的2－ME 納米混懸劑［7］。該研究中作者建立了Lewis 肺癌荷瘤小鼠模型，進(jìn)一步研究2－ME 納米混懸劑在肺癌荷瘤鼠體內(nèi)組織的分布，以期為該劑型的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1．1 材料 藥品與試劑:2－ME(純度99%，自制)，環(huán)孢素A(純度98．5%，批號(hào)120308，武漢鑫佳靈生物科技有限公司)，胎牛血清(批號(hào)1010511，美國(guó)TCB 公司)，甲醇(色譜純，德國(guó)Merck 公司)，乙腈(分析純，天津市協(xié)和昊鵬色譜科技有限公司)，其他試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:SPF 級(jí)昆明種小鼠雌雄各半，(20 ±2)g，由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)SCXK(魯)20080002。瘤株:鼠源性肺腺癌細(xì)胞株Lewis 購(gòu)自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心。儀器:Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國(guó)Agilent 公司)，T25 數(shù)顯勻漿機(jī)(德國(guó)IKA 實(shí)驗(yàn)技術(shù)公司)，MD200－2 型氮?dú)獯祾邇x(杭州奧盛儀器有限公司)，Z36HK 大容量高速冷凍離心機(jī)(德國(guó)貝托特·哈默機(jī)械制造股份公司)。

1．2 試液的配制

1．2．1 2－ME 貯備液及標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 精密稱取2－ME 64．00 mg，置于25 mL 量瓶中，甲醇溶解稀釋至刻度，配制成2．56 g/L 的2－ME 貯備液。以上述貯備液配制成質(zhì)量濃度范圍在0．25～256．00 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1．2．2 2－ME 溶液的配制 精密稱取2－ME 40．00 mg 溶于2 mL 無(wú)水乙醇中，加超純水7 mL、聚氧乙烯氫化蓖麻油1 mL，50℃熱熔攪拌0．5 h，制成質(zhì)量濃度為4．00 g/L 的2－ME 溶液［8］，滅菌。

1．2．3 2－ME 納米混懸劑的制備 精密稱取2－ME 32．00 mg 和卵磷脂192．00 mg，加入無(wú)水乙醇4 mL，超聲使溶解，構(gòu)成有機(jī)相;稱取192．00 mg 泊洛沙姆188、3．20 mg 十二烷基硫酸鈉及19．20 mg 羧甲基纖維素鈉，溶于8 mL PBS 中，構(gòu)成水相。3 000 g 磁力攪拌下將有機(jī)相緩慢滴入水相，繼續(xù)攪拌30 min，充分乳化，然后常溫減壓旋蒸除去有機(jī)溶劑，探超30次，每次3 s，制得4．00 g/L 乳白色納米混懸劑。

1．3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組與處理 參照文獻(xiàn)［9］建立Lewis 肺癌荷瘤鼠模型并將荷瘤鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為2組，即2－ME 納米混懸劑組(實(shí)驗(yàn)組)和2－ME溶液組(對(duì)照組)，每組35只。給藥前禁食12 h，自由飲水。實(shí)驗(yàn)組小鼠尾靜脈注射40 mg/kg 的2－ME 納米混懸劑，對(duì)照組同法給予2－ME 溶液。給藥5、15、30、60、120、240、480 min 后分別取5只小鼠，摘眼球取血，脫頸椎處死后，立即分離心、肝、脾、肺、腎、胃、腦及瘤組織樣品，－20℃冰箱保存。精密稱取各組織樣品，加入生理鹽水(樣品質(zhì)量與生理鹽水體積比，肝、腎、胃、腦、瘤按1∶2，脾、心按1∶3，肺按1∶4)，用組織勻漿機(jī)研磨處理，制成組織勻漿液。取組織勻漿液(腎、肺、肝、腦、脾及瘤組織取500 μL，血漿、心及胃組織取250 μL)于5 mL玻璃離心管中，加入6 倍體積的乙酸乙酯－乙腈－異丙醇(體積比為3∶2∶1)，渦流混合3 min，超聲10 min，4 000 g 離心15 min，取上清液，40℃下氮?dú)饬鞔蹈桑瑲埩粑锛?00 μL 流動(dòng)相復(fù)溶，渦流振蕩1 min，15 000 g 離心15 min，取上清液20 μL 進(jìn)樣。

1．4 色譜條件 Diamosil－C18(200 mm×4．6 mm，5 μm)為分析柱;流動(dòng)相為甲醇∶水(體積比為65∶35);流速1 mL/min;柱溫30℃;激發(fā)波長(zhǎng)285 nm，發(fā)射波長(zhǎng)325 nm;20 μL 進(jìn)樣。

1．5 方法學(xué)驗(yàn)證 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量限:精密量取不同質(zhì)量濃度的2－ME 標(biāo)準(zhǔn)溶液，40℃氮?dú)獯等ト苊?，分別加入空白血漿及組織的空白勻漿樣品，渦旋1 min 混勻，配制成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(n =3)，以峰面積A 對(duì)樣品中藥物濃度C 進(jìn)行回歸，得回歸方程，取S/N≥10 時(shí)樣品濃度作為最低定量限。

日內(nèi)精密度、日間精密度、提取回收率及方法回收率:取空白血漿和組織勻漿液，加入2－ME 溶液，配制成低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品，按1．3 處理生物樣品，分別于日內(nèi)測(cè)定5次計(jì)算日內(nèi)精密度;連續(xù)測(cè)定5 d 計(jì)算日間精密度，并計(jì)算方法回收率及提取回收率。

1．6 數(shù)據(jù)處理和靶向性評(píng)價(jià) 采用Kinetica 4．4．1藥動(dòng)學(xué)軟件(賽默飛世爾科技公司開(kāi)發(fā))對(duì)每個(gè)時(shí)間點(diǎn)血漿及各組織2－ME 的平均濃度進(jìn)行分析，得AUC0－t。給藥系統(tǒng)的靶向性評(píng)價(jià)采用相對(duì)攝取率(re)及總靶向效率(TEC)為評(píng)價(jià)參數(shù)，TEC =AUCi/∑AUC ×100%，AUCi 表示i組織的藥時(shí)曲線下面積，TEC 越大，對(duì)該組織的靶向性越顯著。re =(AUCi)實(shí)驗(yàn)組/(AUCi)對(duì)照組×100%，表示在某一組織或樣本2種不同制劑的藥物分布情況。

2 結(jié)果

2．1 方法學(xué)考察結(jié)果

2．1．1 色譜行為 血漿及各組織中內(nèi)源性物質(zhì)對(duì)樣品測(cè)定無(wú)干擾，樣品的保留時(shí)間為(10．28 ±0．73)min，分離度較好(圖1)，理論塔板數(shù)均大于4 000。

2．1．2 線性范圍 結(jié)果見(jiàn)表1。

2．1．3 精密度與回收率 結(jié)果見(jiàn)表2。

2．2 組織分布結(jié)果 不同時(shí)間點(diǎn)2－ME 納米混懸液和2－ME 溶液在血漿和組織中的分布情況見(jiàn)表3。由表3 可知，對(duì)照組(2－ME 溶液組)中藥物主要分布在血液以及血流豐富的組織中，血漿中分布最多，其次為肺、肝、腎;而實(shí)驗(yàn)組(2－ME 納米混懸劑組)藥物在血漿中的分布明顯減少，在肺、瘤及肝組織中的分布明顯增加，說(shuō)明2－ME 納米混懸劑具有明顯的被動(dòng)靶向性。

圖1 血漿和組織色譜圖

表1 2-ME 在各生物樣品中的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2．3 靶向性評(píng)價(jià) 2－ME 納米混懸劑和2－ME 溶液的TEC 和re 結(jié)果見(jiàn)表4。由表4 可知，2－ME 納米混懸劑在肺、瘤組織中的總靶向效率明顯提高，肝組織中的靶向效率略有提高，在其他組織中的靶向分布均有所減低，其中在血漿中的分布減低尤為顯著。心、肝、脾、肺、腦、瘤組織的re 均大于1，瘤組織的re最大。

表2 2-ME 在各生物樣品中的精密度及回收率(n=5)

表3 不同時(shí)間點(diǎn)2-ME 納米混懸劑和2-ME 溶液在血漿和組織中的分布情況(n=5) μg/g

表4 2-ME 納米混懸劑和2-ME溶液在血漿和組織中的TEC 和re

3 討論

研究［10］表明，2－ME 與血漿蛋白的結(jié)合率較高。在2－ME 溶液中，藥物成游離的分子狀態(tài)，使得藥物可迅速與血漿蛋白結(jié)合，結(jié)合型藥物不能透過(guò)毛細(xì)血管向組織器官轉(zhuǎn)運(yùn)，藥物大量滯留于血液中。而2－ME 納米混懸劑呈亞微米膠態(tài)分散體系，在血漿中常會(huì)被巨噬細(xì)胞作為外來(lái)物而吞噬，巨噬細(xì)胞主要分布于肺、疏松結(jié)締組織、肝、脾等處［11］，因而降低了藥物在血液中的濃度，更多地到達(dá)靶部位。有關(guān)2－ME 與肺細(xì)胞膜親和性的研究［12］結(jié)果表明，肺泡表面存在與2－ME 特異性結(jié)合的受體，使得2－ME 納米混懸劑具有較好的肺靶向性。腫瘤組織生長(zhǎng)快速，血管形成較快，導(dǎo)致血管外膜細(xì)胞缺乏、基底膜變形，通透性增加，納米粒有更多的機(jī)會(huì)蓄積在瘤體部位［13］，因此具有較好的腫瘤靶向性。該研究結(jié)果顯示，2－ME 納米混懸劑在血漿中的分布明顯減少，在肺、瘤及肝組織中分布明顯增加，說(shuō)明2－ME 納米混懸劑具有明顯的被動(dòng)靶向性。此外，靶向性評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，心、肝、脾、肺、腦、瘤組織的re 均大于1，瘤組織的re 最大，說(shuō)明2－ME 納米混懸劑對(duì)心、肝、脾、肺、腦、瘤均具有靶向性，且對(duì)瘤組織的靶向性最好。

總之，2－ME 納米混懸劑具有良好的肺腫瘤靶向性，使用2－ME 納米混懸劑有望增強(qiáng)藥物的治療效果，提高治療指數(shù);該研究為肺腫瘤的靶向治療提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Bruce JY，Eickhoff J，Pili R，et al．A phase Ⅱstudy of 2－methoxyestradiol nanocrystal colloidal dispersion alone and in combination with sunitinib malate in patients with metastatic renal cell carcinoma progressing on sunitinib malate［J］．Invest New Drugs，2012，30(2):794

［2］Harrison MR，Hahn NM，Pili R，et al．A phase Ⅱstudy of 2－methoxyestradiol (2ME2) NanoCrystal ? dispersion(NCD)in patients with taxane－refractory，metastatic castrate－resistant prostate cancer(CRPC)［J］．Invest New Drugs，2011，29(6):1465

［3］Quezada M，Alvarez M，Pe?a OA，et al．Antiangiogenic，antimigratory and antiinflammatory effects of 2－methoxyestradiol in zebrafish larvae［J］．Comp Biochem Physiol C Toxicol Pharmacol，2013，157(2):141

［4］胡海英，張麗娜，張正全，等．小鼠體內(nèi)2－甲氧基雌二醇靜脈乳劑的藥動(dòng)學(xué)及組織分布特征［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，46(1):100

［5］Mueck AO，Seeger H．2－Methoxyestradiol:biology and mechanism of action［J］．Steroids，2010，75(10):625

［6］王文佳，張正全，賈欣，等．2－甲氧基雌二醇對(duì)4T1、SPCA1 和PC－3 細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2012，47(6):804

［7］Du B，Li XT，Zhao Y，et al．Preparation and characterization of freeze－dried 2－methoxyestradiol nanoparticle powders［J］．Pharmazie，2010，65(7):471

［8］Du B，Li Y，Li XT，et al．LC with fluorescence detection for the tissue pharmacokinetics of 2－methoxyestradiol solution and liposome after intravenous administrations to rats［J］．Chromatographia，2009，70(7/8):1287

［9］徐淑云，卞如濂，陳修．藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］．北京:人民衛(wèi)生出版社，2002．

［10］李楊，張青青，孫惠斌，等．2－甲氧基雌二醇大鼠血漿蛋白結(jié)合率的測(cè)定［J］．中國(guó)新藥與臨床雜志，2011，30(10):755

［11］馬偉峰，胡海英，連曉培，等．2－甲氧基雌二醇的大鼠在體胃腸吸收特性［J］．鄭州大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版，2011，46(2):269

［12］Zhang QQ，Shi XF，Sun HB，et al．Preparation of lung cell membrane chromatography and the chromatographic affinity study of 2－methoxyestradiol and its derivatives［J］．J Liq Chromatogr Relat Technol，2013，36(19):2669

［13］Fang J，Nakamura H，Maeda H．The EPR effect:unique features of tumor blood vessels for drug delivery，factors involved，and limitations and augmentation of the effect［J］．Adv Drug Deliv Rev，2011，63(3):136