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河南漢族腦梗死患者血漿HCY水平及MS A2756G基因多態(tài)性檢測(cè)*

2014-12-04 07:28:28李艾帆范玉佳李彥玲趙幸娟許予明
關(guān)鍵詞:半胱氨酸多態(tài)性血癥

李艾帆,張 華,范玉佳,燕 燕,李彥玲,趙幸娟,鄭 紅,許予明

1)鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州450004 2)鄭州大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞生物學(xué)與醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)教研室 鄭州450001 3)鄭州市婦幼保健院 鄭州450053 4)鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 鄭州450052

腦血管病具有高發(fā)病率、高復(fù)發(fā)率、高病死率及高致殘率的特點(diǎn),是全球范圍內(nèi)威脅中老年人健康的主要疾病之一,其中80%為缺血性卒中[1]。動(dòng)脈粥樣硬化是缺血性卒中一個(gè)重要的可控制的危險(xiǎn)因素,除了傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素,如高血壓、糖尿病、心臟病、高脂血癥外,高同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)血癥是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的卒中危險(xiǎn)因素。許多研究[2-4]認(rèn)為,高Hcy 血癥和高脂血癥在動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生中起重要的作用。蛋氨酸合成酶(methionine synthase,MS)是Hcy 代謝途徑中的關(guān)鍵酶之一,MS 基因2756A→G 突變(MS A2756G)在西方人群中比較常見(jiàn),可導(dǎo)致血漿Hcy 水平的改變[5],但國(guó)內(nèi)的研究[6-7]存在爭(zhēng)議。作者檢測(cè)300例河南漢族腦梗死患者血漿Hcy 水平及MS A2756G 基因多態(tài)性,旨在進(jìn)一步探討血漿Hcy 水平及MS A2756G 基因多態(tài)性與河南漢族人群腦梗死的關(guān)系。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年12月至2013年9月在鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院的腦梗死患者300例,診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO 修訂的各類腦血管疾病診斷要點(diǎn)。大動(dòng)脈粥樣硬化性腦梗死96例,小動(dòng)脈閉塞性腦梗死191例,心源性腦梗死5例,其他原因所致腦梗死3例,不明原因所致腦梗死5例?;颊咧心?48例,女152例,年齡22~83(64.2 ±13.2)歲。對(duì)照組選擇同期門診健康體檢者261例,其中男127例,女134例,年齡21~79(63.8 ±13.7)歲,均為無(wú)血緣關(guān)系的河南漢族人群,無(wú)腦卒中病史及家族史。以上兩組均排除患癲癇、癌癥、甲狀腺功能異常、肝腎功能不全及胃部疾病伴巨幼紅細(xì)胞貧血者。

1.2 血漿Hcy 水平測(cè)定 抽取空腹靜脈血2 mL,采用循環(huán)酶法檢測(cè)血漿Hcy 水平,>15 mol/L 為高Hcy 血癥。

1.3 PCR-RFLP 檢測(cè)MS A2756G 基因多態(tài)性

1.3.1 基因組DNA 提取和引物設(shè)計(jì) 采集外周靜脈血2 mL,EDTA 抗凝,采用酚-氯仿法提取人基因組DNA,無(wú)水乙醇沉淀后,加60 mL ddH2O 溶解。引物設(shè)計(jì)參照文獻(xiàn)[3]。上游引物序列:5'-CATG GAAGAATATGAAGATATTAGAC-3';下游引物序列:5'-GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA-3',PCR 擴(kuò) 增產(chǎn)物大小為189 bp。

1.3.2 MS 基因特定片段的PCR 擴(kuò)增 PCR 反應(yīng)體系25 μL:STR Buffer(包含MgCl2、Dntp、10 ×Buffer)2.5 μL,上、下游引物各2.0 μL,Taq 酶0.4 μL,模板DNA 1.5 μL,ddH2O 補(bǔ)至25 μL。PCR 擴(kuò)增條件:92℃預(yù)變性2 min;92℃60 min,56℃60 min,72℃90 min,35個(gè)循環(huán);72℃延伸7 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)20 g/L 瓊脂糖凝膠電泳,EB 染色。

1.3.3 限制性內(nèi)切酶酶切PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 酶切反應(yīng)體系20 μL,包括PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物10 μL,Hae Ⅲ0.5 μL,Buffer R 2.0 μL,ddH2O 7.5 μL。酶切產(chǎn)物在37℃水浴鍋中溫浴16 h。取6 μL 擴(kuò)增產(chǎn)物加入20 g/L 瓊脂糖凝膠負(fù)極端的加樣孔,以溴酚藍(lán)為指示劑,EB 為染色劑,在10 V 電壓下電泳30 min,凝膠成像儀下觀察并照相。

1.3.4 測(cè)序與鑒定 選取各基因型位點(diǎn)野生型、雜合突變型各30例、純合突變型3例的PCR 產(chǎn)物,由上海寶生物有限公司進(jìn)行測(cè)序分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 分析。兩組年齡的比較采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn),性別和各疾病發(fā)病率以及MS A2756G 基因型和等位基因頻率分布的比較采用χ2檢驗(yàn)。不同基因型和不同腦梗死類型間血漿Hcy 水平的比較采用單因素方差分析。定量資料相關(guān)性采用線性相關(guān)分析,有等級(jí)資料的相關(guān)關(guān)系采用等級(jí)相關(guān)分析。血漿Hcy 水平、MS A2756G 基因型及其他危險(xiǎn)因素與腦梗死的相關(guān)關(guān)系用logistic 回歸分析,結(jié)果以相對(duì)危險(xiǎn)度(odds ratio,OR)和95%可信區(qū)間(95%CI)表示。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩組一般資料比較 腦梗死組高血壓及糖尿病的發(fā)病率均高于對(duì)照組,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 兩組一般資料比較

2.2 兩組及不同腦梗死類型血漿Hcy 水平比較腦梗死組血漿Hcy 水平為(19.3 ±7.2)μmol/L,高于對(duì)照組的(15.1±4.9)μmol/L(t =8.031,P<0.001)。不同腦梗死類型患者血漿Hcy 水平比較見(jiàn)表2。

表2 不同腦梗死類型患者血漿Hcy 水平比較 μmol/L

2.3 PCR-RFLP 結(jié)果

2.3.1 酶切產(chǎn)物的判定結(jié)果 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)酶切后有3種基因型:野生型(AA 型)只有189 bp 片段;雜合突變型(AG 型)有159 和189 bp 片段;純合突變型(GG 型)只有159 bp 片段。電泳結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 酶切產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.3.2 PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果 見(jiàn)圖2。

圖2 PCR 產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果

2.4 兩組MS A2756G 基因型及等位基因頻率分布比較 兩組人群基因型分布均符合Hardy-weinberg 平衡(χ2=1.897,P=0.169),具有人群代表性。腦梗死組和對(duì)照組間3種基因型和2種等位基因頻率分布的比較見(jiàn)表3。

表3 兩組MS A2756G 基因型和等位基因頻率分布比較例(%)

2.5 MS A2756G 基因型與血漿Hcy 水平的關(guān)系474例MS A2756G AA 型、84例AG 型和3例GG 型受檢者血漿Hcy水平分別為(17.31 ± 6.71)、(17.42 ±5.73)、(19.03 ±6.50)μmol/L,3 者比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=0.110,P=0.896)。

2.6 腦梗死危險(xiǎn)因素分析 相關(guān)分析顯示,血漿Hcy 水平與腦梗死的發(fā)生相關(guān)(r = 0.390,P<0.001),MS A2756G 基因多態(tài)性與血漿Hcy 水平無(wú)關(guān)(r =0.036,P =0.391),與腦梗死的發(fā)生無(wú)關(guān)(r= -0.003,P =0.943)。以MS A2756G 多態(tài)性、Hcy 水平、高血壓、糖尿病、高脂血癥為自變量(MS A2756G 基因野生型為0,突變型為1;無(wú)高Hcy 血癥為0,高Hcy 血癥為1;無(wú)糖尿病為0,糖尿病為1;無(wú)高血壓為0,高血壓為1;無(wú)高脂血癥為0,高脂血癥為1),以腦梗死是否發(fā)生作為因變量,采用logistic回歸模型進(jìn)行多因素分析,結(jié)果顯示高血壓、糖尿病、高脂血癥、高Hcy 血癥可以增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),MS A2756G 基因突變不增加腦梗死的風(fēng)險(xiǎn)。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 腦梗死危險(xiǎn)因素的logistic 回歸分析結(jié)果

3 討論

Hcy 是一種含硫氨基酸,是機(jī)體內(nèi)蛋氨酸和半胱氨酸代謝過(guò)程中的一個(gè)重要中間產(chǎn)物。Hcy 在MS 催化下,以維生素B12 為輔酶,通過(guò)甲基化合成甲硫氨酸,通過(guò)再甲基化形成蛋氨酸。在Hcy 代謝過(guò)程中,甲硫氨酸合成酶的遺傳缺陷以及葉酸、維生素B12 的缺乏均可使體內(nèi)的甲硫氨酸代謝發(fā)生障礙,導(dǎo)致血漿Hcy 水平升高。近年來(lái)一些研究[2]已經(jīng)證明血漿Hcy 水平升高與動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病,包括缺血性卒中有關(guān)。研究[8]認(rèn)為高Hcy 血癥與小動(dòng)脈閉塞性卒中關(guān)系更密切;也有一些研究[9-10]認(rèn)為高Hcy 血癥與大動(dòng)脈粥樣硬化性卒中相關(guān)。這些研究結(jié)論仍有爭(zhēng)議。該研究結(jié)果顯示,腦梗死組的血漿Hcy 水平高于對(duì)照組,與Masser等[11]的研究結(jié)果一致。相關(guān)分析結(jié)果顯示,血漿Hcy 水平與腦梗死的發(fā)生相關(guān)。Logistic 回歸分析結(jié)果顯示高血壓、糖尿病、高脂血癥、高Hcy 血癥可以增加腦梗死的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。以上結(jié)果提示在河南漢族人群中,高Hcy 血癥是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。

1996年Leclerc 等[5]首次在葉酸/維生素B12代謝障礙的cbⅠG 互補(bǔ)組患者中發(fā)現(xiàn),甘氨酸取代了位于第919 位上的天冬氨酸;G 等位基因在加拿大白人中的分布較高,該位點(diǎn)突變影響了甲硫氨酸的甲基化過(guò)程,使體內(nèi)的Hcy 水平降低,可以降低心血管事件的發(fā)生率。張廣森等[12]研究發(fā)現(xiàn),Hcy代謝相關(guān)酶G 等位基因頻率在心腦血管組與正常對(duì)照組之間的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。該研究結(jié)果顯示,河南漢族人群中MS A2756G 基因型和等位基因頻率分布差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

MS A2756G 多態(tài)位點(diǎn)AA、AG、GG 3種基因型受檢者的血漿Hcy 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示MS A2756G 基因突變對(duì)血漿Hcy 水平無(wú)明顯影響,與國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)[13-15]報(bào)道一致。Logistic 回歸分析結(jié)果顯示,MS A2756G 基因突變不是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。由于MS A2756G 位點(diǎn)的突變率相對(duì)較低,要充分展示MS A2756G 位點(diǎn)多態(tài)性與腦梗死的關(guān)系,需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量,還需進(jìn)行腦梗死的多個(gè)候選基因的聯(lián)合分析。

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