劉洪鳳 韓智學(xué) 聶 影 金龍云 王桂云 岳 輝 李 齊 薛繼婷 申梅淑

(牡丹江醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江 157011)

糖尿病腎病(DN)已成為導(dǎo)致慢性腎衰竭的首位病因，腎臟纖維化是各種原因腎臟疾病進(jìn)展到慢性腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)。在腎臟纖維化形成的發(fā)病機(jī)制中，細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)始終是人們的研究熱點，組織轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)是目前公認(rèn)的致纖維化最強(qiáng)的細(xì)胞因子〔1〕，針對TGF-β1的研究已成為治療DN的一個新的靶標(biāo)。桑葉多糖(MLP)是桑葉的主要活性成分之一，具有降糖降脂、強(qiáng)心降壓、降低胰島素抵抗等多種藥理功效〔2～4〕。但是從分子水平研究MLP對DN大鼠TGF-β1基因表達(dá)的影響還未見有報道。本實驗探討MLP對DN大鼠的腎臟纖維化的干預(yù)作用。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 健康雄性Wistar大鼠100只，體重(220±50)g。MLP(南京澤朗醫(yī)藥科技有限公司);鏈脲佐菌素(STZ)(Sigma公司);PCR引物(上海博亞生物技術(shù)有限公司合成)。

1.2 大鼠模型的制備及分組 清潔級Wistar大鼠隨機(jī)分為A組15只和造模組85只。造模方法:動物適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w后，禁食12 h，將STZ按65 mg/kg一次性(ip)給藥制備糖尿病大鼠模型。造模后每日檢測血糖、尿糖，連續(xù)3 d空腹血糖值 ＞16.7 mmol/L、尿糖定性?以上、尿量增加1倍以上為糖尿病模型形成。再繼續(xù)喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)抽取兩只動物測尿 mAlb，mAlb＞15 μg/ml，確定DN模型形成。取造模成功的DN大鼠60只隨機(jī)分為 B組、C組、D組、E組，每組15只，余者棄掉。各組大鼠分別給以下處理:A組、B組大鼠2 ml·kg－1·d－1腹腔注射生理鹽水;C、D、E 治療組大鼠2 ml·kg－1·d－1腹腔注射 MLP(0.4、0.2、0.1 g/ml)，治療8 w后，取材后處死大鼠。

1.3 血、尿采集及生化檢測 MLP給藥治療8 w末，股動脈穿刺取血，血糖儀檢測空腹血糖(FPG)，兩點法測定尿素氮(BUN)，苦味酸法測定血肌酐(Cr)，以考馬斯亮藍(lán)法檢測微量白蛋白(mAlb)含量。

1.4 腎臟組織TGF-β1 mRNA水平檢測 取腎皮質(zhì)100 mg，加液氮研碎后，采用Trizol試劑提取總RNA，兩步法RT-PCR反應(yīng)檢測TGF-β1mRNA PCR，以 β-actin為內(nèi)參照。反應(yīng)條件為:94℃5 min 1 個循環(huán)，94℃ 變性 50 s，60℃ 退火 45 s，72℃ 延伸45 s，35個循環(huán)后72℃延伸7 min。TGF-β1(405 bp)上游引物序列:5'-CGAGGTGACCTGGGCACCATCATGAC-3'，下游引物序列: 5'-CTGCTCCACCTTGGGCTTGCGACCCAC-3'; β-actin(240 bp)上游引物序列:5'-AACCCTAAGGCCAACCGTGAAAAG-3'，下游引物序列:5'-TCATGAGGTAGTCTGTCAGGT-3'。取PCR擴(kuò)增產(chǎn)物5 μl在1.5%瓊脂糖中電泳，結(jié)果用UVPDGS-8000型凝膠成像系統(tǒng)成像，并用密度掃描儀分析PCR產(chǎn)物條帶，TGF-β1 mRNA表達(dá)水平以相對光密度表達(dá)量，即TGF-β1/β-actin 比率計算。1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料用s表示組間比較采用單因素方差分析。

2 結(jié)果

2.1 大鼠FPG、BUN、Cr、mAlb變化 大鼠成模后出現(xiàn)代謝紊亂癥狀，并逐漸加重，體重下降。模型組FPG、BUN、Cr、mAlb高于A組(P＜0.01)。C、D 組 FPG、BUN、Cr、mAlb高于 B 組(P＜0.01)。見表1。

表1 各組大鼠的FPG、BUN、Cr、mAlb水平( s，n=15)

表1 各組大鼠的FPG、BUN、Cr、mAlb水平( s，n=15)

與A組比較:1)P＜0.01;與B組比較:2)P＜0.01

A組5.76±0.43 6.23±1.28 31.54±2.39 9.11±0.67 B組 23.96±0.321)6.31±1.311)65.68±11.851)85.57±2.941)C組12.75±0.511)2)6.26±1.231)2)42.24±15.971)2)30.51±2.731)2)D組16.95±0.581)2)6.28±1.211)2)50.32±14.721)2)59.43±3.521)2)E組20.29±0.371)2)6.29±1.251)2)63.87±13.361)2)71.68±5.661)2)

2.2 各組大鼠TGF-β mRNA表達(dá)的測定 C、D、E治療組腎臟TGF-β1mRNA 表達(dá)分別為(0.91±0.13)、(0.98 ±0.16)、(1.21±0.11)較 DN大鼠 B組表達(dá)顯著降低(1.23±0.09，P＜0.01)。B組腎臟 TGF-β1 mRNA較 A組明顯增高(0.89±0.12，P ＜0.01)。

3 討論

DN的主要病理變化特點包括腎小球肥大、腎小球細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)積聚、基底膜增厚以及腎小球纖維化，而ECM的過度積聚則是導(dǎo)致腎小球硬化發(fā)生和發(fā)展的基礎(chǔ)〔5，6〕。TGF-β1被認(rèn)為是DN中導(dǎo)致ECM積聚的重要因子。高血糖能促進(jìn)TGF-β1表達(dá)上調(diào)，而過度表達(dá)的 TGF-β1能刺激ECM合成;ECM的合成增加或降解減少，均可引起ECM過度積聚，而ECM的過度積聚最終會導(dǎo)致腎小球的纖維化。本實驗結(jié)果顯示MLP可以顯著降低DN大鼠的FPG，BUN、Cr及mAlb水平，說明MLP對DN大鼠腎臟有著良好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與MLP下調(diào)TGF-β1 mRNA表達(dá)有關(guān)。本研究結(jié)果為今后運(yùn)用MLP治療DN提供了實驗依據(jù)，也為臨床干預(yù)DN進(jìn)展提供新的靶標(biāo)。

1 Wu Y，Ren K，Liang C，et al.Renoprotective effect of total glucosides ofpaeony(TGP)and its mechanism in experimental diabetes〔J〕.J Pharmacol Sci，2009;109(1):78-87.

2 劉洪鳳，任巖海，韓智學(xué)，等.桑葉多糖對糖尿病大鼠resistin mRNA表達(dá)的影響〔J〕·中國食物與營養(yǎng)，2012;18(4):67-8.

3 任巖海，劉洪鳳，韓智學(xué).桑葉多糖對2型糖尿病大鼠血糖血脂的影響〔J〕.中醫(yī)藥學(xué)報，2013;41(1):20-1.

4 任巖海，劉洪鳳，宋鐵軍，等.2桑葉多糖對糖尿病大鼠 Resistin蛋白表達(dá)的影響〔J〕.中醫(yī) 藥信息，2012;29(6)22-3.

5 孫培榮，石永兵，施曉松.銀杏達(dá)莫對梗阻性腎病大鼠腎間質(zhì)纖維化中 TGF-β1表達(dá)的影響〔J〕.中國誤診學(xué)雜志，2010;26(9):6304-6.

6 Wang W，Huang XR，Canlas E，et al.Essential role of Smad3 in angiotensin Ⅱ-induced vascular fibrosis〔J〕.Circ Res，2009;98(8):1032-9.