鄭 斌 李光宇 李佳睿 鄭永晨 (吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林 長(zhǎng)春 3004)

現(xiàn)代研究表明多酚類化合物是綠茶中主要的有效成分，包括兒茶素及其衍生物，兒茶素主要包括表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯(EGCG)、表沒(méi)食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒(méi)食子酸酯(ECG)和表兒茶素(EC)，其中含量最多的是EGCG〔1〕。大量研究表明，茶葉具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制與兒茶素的抗氧化作用、茶氨酸的鎮(zhèn)靜作用和咖啡堿的興奮作用有關(guān)。EGCG是茶多酚中抗氧化功能最強(qiáng)的化合物，具有抗腫瘤、抗輻射、抗衰老和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡等功能〔2，3〕;然而，EGCG 在一定條件下可以產(chǎn)生過(guò)氧化氫，表現(xiàn)為促氧化的細(xì)胞毒作用〔4，5〕。因此，探討EGCG對(duì)于細(xì)胞促氧化和抗氧化的條件非常有意義。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠視神經(jīng)節(jié)細(xì)胞系RGC-5購(gòu)自ATCC(本室保存);EGCG(Sigma-Aldrich);DMEM培養(yǎng)液和胎牛血清(FBS，Hyclone);過(guò)氧化氫(Fluka);過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒和活性氧(ROS)檢測(cè)試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所);中性紅;過(guò)氧化氫酶(牛肝，Sigma-Aldrich);臺(tái)酚藍(lán)(Sigma-Aldrich);細(xì)胞培養(yǎng)板和培養(yǎng)瓶(NUNC)。二氧化碳培養(yǎng)箱(150i.Thermal);全波長(zhǎng)分光光度儀(Thermal);倒置顯微鏡和倒置熒光顯微鏡(奧林巴斯)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) RGC-5細(xì)胞培養(yǎng)在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，用培養(yǎng)瓶進(jìn)行細(xì)胞增殖和傳代，傳代細(xì)胞密度2.0×104細(xì)胞/ml。實(shí)驗(yàn)細(xì)胞培養(yǎng)于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，細(xì)胞密度1.0×105細(xì)胞/ml，培養(yǎng)16～24 h，細(xì)胞融合度達(dá)75%用于試驗(yàn)。

1.2.2 EGCG和 EGCG-E配制 EGCG(分子量 458.4，純度98%)配制10 mmol的貯存液;取46.8 mg EGCG，分別溶于10 ml生理鹽水和無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基中;培養(yǎng)基溶解的EGCG中加入1.0 mg過(guò)氧化氫酶，37℃ 4 h;然后80℃ 30 min滅活過(guò)氧化氫酶(EGCG-E)，兩種EGCG液分別過(guò)濾除菌，凍存。1.2.3 細(xì)胞增殖率檢測(cè) 用中性紅攝入法檢測(cè)細(xì)胞增殖率。用0.25%胰酶消化細(xì)胞，用10%FBS的DMEM稀釋細(xì)胞，密度1.0 ×105細(xì)胞/ml，加入 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)版，每孔 100 μl，37℃、5%CO2培養(yǎng)16～24 h，細(xì)胞融合度達(dá)75%用于試驗(yàn)，試驗(yàn)時(shí)培養(yǎng)液換成含1%FBS的DMEM。根據(jù)不同試驗(yàn)組培養(yǎng)的時(shí)間加入中性紅。方法是棄凈培養(yǎng)液，用無(wú)血清DMEM洗2次，用無(wú)血清 DMEM稀釋中性紅濃度為0.05 mg/ml，每孔加入100 μl，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h;棄凈液體，用PBS洗2次，棄凈PBS后每孔加入100 μl酸化乙醇液(0.4%鹽酸，70%乙醇)，室溫避光2 h，檢測(cè)OD530的光密度。細(xì)胞增殖和存活率計(jì)算方法是試驗(yàn)孔光密度比正常對(duì)照組的比值乘100%。1.2.4 過(guò)氧化氫檢測(cè) 試劑在冰水浴上溶解，系列稀釋標(biāo)準(zhǔn)品，在檢測(cè)孔內(nèi)加入50 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品;每個(gè)樣品2孔，再向樣品孔加入100 μl檢測(cè)試劑輕輕振蕩混勻，室溫放置30 min，檢測(cè)560 nm光密度。制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算過(guò)氧化氫濃度。1.2.5 ROS檢測(cè) 用無(wú)血清培養(yǎng)液1∶1 000稀釋DCFH-DA，使終濃度為10 μmol。棄細(xì)胞培養(yǎng)液，加入50 μl稀釋的DCFHDA，37℃細(xì)胞水浴箱內(nèi)孵育20 min。用無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞三次，再加入50 μl無(wú)血清培養(yǎng)液。熒光檢測(cè)488 nm激發(fā)和525 nm收集的光密度，以試驗(yàn)孔的光密度比正常對(duì)照孔光密度比值乘100%為各組ROS相對(duì)活性。1.2.6 RGC-5細(xì)胞代謝過(guò)氧化氫 在75%細(xì)胞融合度96孔板內(nèi)分別加入200 μmol的EGCG和過(guò)氧化氫100 μl，設(shè)置正常對(duì)照孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，在培養(yǎng)0，10 ，30 ，60，90，120，150，180和240 min時(shí)收集培養(yǎng)上清液，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)收集3個(gè)復(fù)孔。用過(guò)氧化氫檢測(cè)試劑盒檢測(cè)過(guò)氧化氫。1.2.7 EGCG，EGCG-E和過(guò)氧化氫細(xì)胞毒作用 在75%細(xì)胞融合度的96孔板內(nèi)分別加入不同稀釋度的EGCG，EGCG-E和過(guò)氧化氫 100 μl，稀釋液是含 1%FBS的 DMEM，濃度為 0，12.5，25，50，100，200 和 400 μmol;每個(gè)稀釋度 6 個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，中性紅攝入法檢測(cè)。1.2.8 EGCG和EGCG-E預(yù)處理的抗氧化作用 在75%細(xì)胞融合度96孔板內(nèi)分別加入25 μmol EGCG或EGCG-E 100 μl，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)2 h;棄凈液體，再重復(fù)處理一次;用含1%FBS的DMEM 稀釋過(guò)氧化氫，濃度分別為0，25，50，100，200，400 和 800 μmol;每孔100 μl，每個(gè)稀釋度 6 個(gè)復(fù)孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)24 h，中性紅攝入法檢測(cè)細(xì)胞存活率。1.2.9 EGCG，EGCG-E和過(guò)氧化氫對(duì)RGC-5細(xì)胞ROS的影響用含1%FBS的DMEM培養(yǎng)液分別稀釋EGCG，EGCG-E和過(guò)氧化氫;濃度分別為 0，12.5，50，100，200 和 400 μmol，每孔100 μl，每個(gè)稀釋度 6 復(fù)孔，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng) 24 h，棄凈培養(yǎng)液，進(jìn)行ROS檢測(cè)。

2 結(jié)果

2.1 RGC-5細(xì)胞代謝過(guò)氧化氫 直接加入的過(guò)氧化氫代謝快，120 min已接近消失，在最初30 min代謝50%以上;而EGCG產(chǎn)生的過(guò)氧化氫消失較慢，需要近240 min，150 min仍高于初始濃度的50%。見(jiàn)圖1。

圖1 RGC-5細(xì)胞代謝過(guò)氧化氫

2.2 EGCG，EGCG-E和過(guò)氧化氫對(duì)RGC-5細(xì)胞的細(xì)胞毒作用過(guò)氧化氫對(duì)RGC-5細(xì)胞的IC50為200 μmol;EGCG的IC50為367 μmol;而 EGCG-E 的 IC50在400 μmol以上。見(jiàn)圖2。

圖2 EGCG和EGCG-E對(duì)RGC-5細(xì)胞的細(xì)胞毒作用

2.3 EGCG和EGCG-E預(yù)處理RGC-5細(xì)胞抗氧化作用 預(yù)處理的RGC-5細(xì)胞存活率明顯提高;EGCG-E的存活率略高于EGCG。見(jiàn)圖3。

圖3 EGCG和EGCG-E預(yù)處理RGC-5細(xì)胞抗氧化作用

2.4 EGCG，EGCG-E和過(guò)氧化氫對(duì)RGC-5細(xì)胞ROS的影響EGCG和EGCG-E濃度增高后ROS活性相對(duì)降低，兩者沒(méi)有明顯差別;而過(guò)氧化氫在400 μmol時(shí)ROS明顯升高。見(jiàn)圖4。

圖4 EGCG，EGCG-E和過(guò)氧化氫對(duì)RGC-5細(xì)胞ROS的影響

3 討論

EGCG是茶葉中的多酚類化合物，EGCG具有抗氧化和對(duì)抗各種活性氧的作用，EGCG與靶蛋白結(jié)合引起細(xì)胞靜止或凋亡，還可以激活氧化還原敏感的NrfI信號(hào)通路，調(diào)節(jié)應(yīng)激氧壓力下抗氧化酶的活性〔6，7〕。

近期研究發(fā)現(xiàn)EGCG在體內(nèi)可以產(chǎn)生多種活性氧，人和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明大量的攝入茶葉可以引起肝毒性。有報(bào)道重復(fù)低劑量的過(guò)氧化氫刺激可以誘導(dǎo)抗氧化酶系統(tǒng)的活性而保護(hù)大劑量過(guò)氧化氫引起的細(xì)胞損傷〔8〕，但是EGCG具體的生物活性作用的位置不清。

本文研究結(jié)果表明EGCG在培養(yǎng)細(xì)胞液中可以產(chǎn)生過(guò)氧化氫，并且EGCG產(chǎn)生的過(guò)氧化氫持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)。EGCG經(jīng)過(guò)氧化氫酶處理后表現(xiàn)為IC50上升400 μmol以上，表明EGCG對(duì)細(xì)胞的毒性并非完全來(lái)自EGCG產(chǎn)生的過(guò)氧化氫。本文研究結(jié)果顯示EGCG和EGCG-E預(yù)處理對(duì)抗過(guò)氧化氫作用差別較小，說(shuō)明EGCG不單純是產(chǎn)生的小劑量過(guò)氧化氫誘導(dǎo)細(xì)胞抗氧化作用，還有EGCG對(duì)細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。在培養(yǎng)的條件下細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生與很多因素有關(guān)系，根據(jù)本文結(jié)果，EGCG和EGCG-E不同濃度處理RGC-5細(xì)胞，ROS產(chǎn)生隨濃度升高而減少，推測(cè)EGCG和EGCG-E在較高濃度時(shí)并非直接抑制ROS產(chǎn)生，可能是對(duì)細(xì)胞的毒性所致，而400 μmol過(guò)氧化氫顯示的高ROS可能是細(xì)胞死亡后殘留的過(guò)氧化氫。

總之，EGCG表現(xiàn)為在一定條件下產(chǎn)生過(guò)氧化氫，對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生氧化作用，在較低劑量表現(xiàn)抗氧化作用，因此不宜過(guò)多攝入。

1 Yang CS，Wang X，Lu G，et al.Cancer prevention by tea:animal studies，molecular mechanisms and human relevance〔J〕.Nat Rev Cancer，2009;9:429-39.

2 Yang CS，Lambert JD，Sang S.Antioxidative and anti-carcinogenic activities of tea polyphenols〔J〕.Arch Toxicol，2009;83:11-21.

3 Ishii T，Mori T，Tanaka T，et al.Covalent modification of proteins by green tea polyphenol(－)-epigallocatechin-3-gallate through autoxidation〔J〕.Free Radic Biol Med，2008;45:1384-94.

4 Li GX，Chen YK，Hou Z，et al.Pro-oxidative activities and dose-response relationship of(－)-epigallocatechin-3-gallate in the inhibition of lung cancer cell growth:acomparative study in vivo and in vitro〔J〕.Carcinogenesis，2010;31:902-10.

5 Leonilla Elbling，Irene Herbacek，Rosa-Maria Weiss，et al.Hydrogen peroxide mediates EGCG-induced antioxidant protection in human keratinocytes〔J〕.Free Rad Biol Med，2010;49:1444-52.

6 Owuor ED，Kong AN.Antioxidants and oxidants regulated signal transduction pathways〔J〕.Biochem.Pharmacol，2002;64:765-70.

7 Na HK，Kim EH，Jung JH，et al.(一)-Epigallocatechin gallate induces Nrf2－mediated antioxidant enzyme expression via activation of PI3K and ERK in human mammary epithelial cells〔J〕.Arch Biochem Biophys，2008;476:171-7.

8 Lambert JD，Sang S，Yang CS.Biotransformation of green tea polyphenols and the biological activities of those metabolites〔J〕.Mol Pharm，2007;4:819-25.