楊 斌 張 爭 毛澤斌 辛殿祺 (北京大學(xué)第一醫(yī)院泌尿外科，北京 00034)

腎細胞癌(RCC)早期缺乏典型的臨床表現(xiàn)，約30%的患者在確診時已經(jīng)發(fā)現(xiàn)有遠處轉(zhuǎn)移。RCC生物學(xué)行為極為復(fù)雜，對放療化療均不敏感〔1，2〕。大部分靶向治療藥物仍處于臨床試驗階段，并且普遍存在完全緩解率低的問題〔3〕。目前尚缺乏一個RCC的腫瘤標志物用于臨床診斷。Togashi等〔4〕通過cDNA微列陣分析，選出RCC患者中普遍且明顯過表達的基因。并通過半定量RT-PCR、免疫組織化學(xué)分析等實驗方法，最終證實低氧可誘導(dǎo)蛋白2(HIG2)蛋白的表達在RCC組織中明顯上調(diào)，而未在其他正常的器官組織內(nèi)檢測到其上調(diào)。本文分析HIG2蛋白在RCC臨床診斷上的作用。

1 材料和方法

1.1 研究對象 收集2012年10月至2013年12月北大醫(yī)院泌尿外科100例RCC患者的新鮮血液，其中男56例，年齡60～86〔平均(71.35±1.33)〕歲;女 44例，年齡 60～76〔平均(68.57±2.18)〕歲;與100名健康志愿者的新鮮血液，其中男46例，年齡24～38歲;女54例，年齡23～35歲，平均年齡28歲。患者與志愿者均已知情，并通過倫理審查。采集的血液均經(jīng)水平離心機4℃，3 000 r/min離心15 min。提取上清血清后，再經(jīng)小型離心機4℃，12 000 r/min離心10 min提取血清，并保存于－80℃以待檢測。

1.2 試劑和材料 大腸桿菌融合表達載體pGEX4T-3 Vector購于Pharmacia Biotech公司，在EcoRI和XhoI位點間插入擴增的HIG2編碼區(qū)并經(jīng)測序驗證。該HIG2/pGEX4T-3質(zhì)粒由北京大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化系王秀娟提供。大腸桿菌BL21購于天根生化科技有限公司;96孔單條可拆酶標板購于美國康寧公司;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于美國Thermo公司;HIG2鼠源單克隆抗體購于上海Santa Cruz公司;HIG2兔源多克隆抗體購于英國Abcam公司;酶聯(lián)免疫反應(yīng)板包被液購于美國SurModics公司;TMB單組分顯色液購于北京索萊寶科技有限公司。

1.3 谷胱基肽疏基轉(zhuǎn)移酶(GST)-HIG2融合蛋白可溶性表達將測序正確的HIG2/pGEX4T-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中，挑取單克隆分別接種含氨芐青霉素(Amp)的LB培養(yǎng)基中，37℃、180 r/min震蕩培養(yǎng)至 OD600=0.4～0.6，并加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度1 mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，4℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體。菌體沉淀用100 μl磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸后加等量的上樣緩沖液，經(jīng)100℃水浴5 min后，進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測融合蛋白的表達情況，鑒定表達產(chǎn)物。

1.4 GST-HIG2融合蛋白純化 將HIG2/pGEX4T-3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞后大量誘導(dǎo)，4℃、8 000 r/min離心10 min收集菌體，用1×PBS緩沖液重懸菌體。4℃條件下超聲破碎菌體，超聲后產(chǎn)物經(jīng)4℃、5 000 r/min離心20 min，分別收集離心上清液和沉淀。對收集液分別進行SDS-PAGE檢測。取超聲后的上清液過GST親和層析柱中，使柱中的上清液緩慢流穿。用10倍柱床體積的PBS沖洗。再用含GSH的洗脫液去除雜蛋白。收集流穿液和洗脫液，所有收集的液體均進行SDS-PAGE分析。純化后的HIG2蛋白用2 000 ml的1×PBS透析以除去谷胱甘肽。最后采用BCA法測定HIG2蛋白濃度。

1.5 ELISA雙抗體夾心法測定GST-HIG2表達水平 用酶聯(lián)免疫反應(yīng)板包被液，將HIG2單克隆抗體稀釋至蛋白質(zhì)濃度為2 μg/ml，4℃包被 96 孔酶標板 12 h;用 0.15 mol/L pH7.4 PBS洗滌緩沖液洗3次后加入5%脫脂奶粉37℃封閉1 h;1×PBS洗滌3次后，分別取倍比稀釋的標準品HIG2蛋白以及稀釋的健康志愿者和RCC患者的血清樣品100 μl加入上述已包被好的反應(yīng)孔中，37℃孵育1 h;1×PBS洗滌3次后，加入1∶1 000稀釋的HIG2多克隆一抗37℃孵育1 h;PBS洗滌3次后，加入1∶1 000辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔IgG 37℃孵育1 h;PBS洗滌3次后，加入TMB底物顯色液100 μl，37℃避光顯色15 min;加入 2 mol/L H2SO450 μl，終止反應(yīng)后，于酶聯(lián)免疫檢測儀450 nm波長下讀數(shù)。通過HIG2純蛋白繪制濃度標準曲線，計算200例血清樣品的濃度，并按照HIG2蛋白所占GSTHIG2蛋白的分子量比例以及血清稀釋比例，換算成純HIG2蛋白的濃度。濃度標準曲線的繪制采用了Curve Exert1.4軟件。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS19.0軟件進行工作特征曲線(ROC)分析。

2 結(jié)果

2.1 GST-HIG2融合蛋白在大腸桿菌BL21中的表達 含重組質(zhì)粒的大腸桿菌BL21經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，在相對分子質(zhì)量約31 kD位置出現(xiàn)了一條蛋白條帶，該結(jié)果與預(yù)期GST-HIG2融合蛋白相對分子量為31 kD結(jié)果一致。見圖1。

圖1 融合蛋白經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的表達

2.2 GST-HIG2融合蛋白的純化 目的蛋白GST-HIG2主要存在上清液中，表明GST-HIG2融合蛋白主要以可溶性的形式存在。利用GST融合蛋白親和層析柱進行目的蛋白純化，SDSPAGE分析顯示純化的融合蛋白呈單一條帶，純度為86%。BCA法檢測GST-HIG2融合蛋白濃度為0.42 mg/ml。見圖2。

2.3 樣品血清中HIG2蛋白濃度計算結(jié)果 經(jīng)純化后的GSTHIG2 融合蛋白分別按照 31、32、33、34、35、36、37 和 41、42、43、44、45、46、47進行稀釋，用 ELISA方法檢測得出相應(yīng) OD值，100例健康志愿者和100例RCC患者血清樣品中HIG2蛋白濃度的中位數(shù)分別為1 μg/ml(四分位差為0.61～1.56 μg/ml);3.4 μg/ml(四分位差為 2.05 ～10.47 μg/ml)。

2.4 ROC曲線分析結(jié)果 對上述濃度值繪制ROC曲線，曲線下面積為0.870，95%置信區(qū)間為(0.821，0.918)，P ＜0.001，其診斷正確性為中等，cut-off值為2.03 μg/ml，敏感度和特異度分別為76%、85%，約登指數(shù)為61%。見圖3。

圖2 融合蛋白的表達和純化

圖3 ROC曲線對健康志愿者和腎癌患者血清濃度的分析

3 討論

2009年全國范圍內(nèi)RCC新發(fā)病例數(shù)為4 916例，約占全部惡性腫瘤新發(fā)病例數(shù)的2.01%，在惡性腫瘤發(fā)病中排第12位〔1〕。根據(jù)RCC病理組織分型，最常見的病理組織類型為透明細胞癌約占80%〔5〕。RCC患者早期診斷主要依靠影像學(xué)檢查，但很多直徑＜1 cm的微小腫瘤仍然難以及時準確發(fā)現(xiàn)。穿刺活檢可判斷腫瘤的病理分級分型，但這是一項有創(chuàng)且與臨床癥狀相關(guān)聯(lián)的檢查，存在著假陰性、不能及時及針孔腫瘤轉(zhuǎn)移的可能。因此，目前尚缺乏RCC腫瘤標志物用于臨床診斷。

HIG2蛋白作為低氧誘導(dǎo)基因首次被Denko等〔6〕發(fā)現(xiàn)，其cDNA全長包含1 372個核苷酸。Togashi等〔4〕通過cDNA微列陣分析，選出RCC患者中普遍且明顯過表達的基因。并通過半定量RT-PCR、免疫組織化學(xué)分析等實驗方法最終證實HIG2蛋白在RCC明顯上調(diào)。通過小干擾RNA(siRNA)阻斷HIG2蛋白表達后，RCC細胞生長明顯受到了抑制;在腎癌細胞培養(yǎng)基中加入HIG2多克隆抗體，可明顯誘導(dǎo)RCC細胞的凋亡〔4〕。以上結(jié)果均說明HIG2蛋白在RCC細胞生長中起著重要作用。

目前von Hippel-Lindau(VHL)基因通路被認為是腎透明細胞癌中主要誘發(fā)癌癥的基因通路。腎透明細胞癌可普遍發(fā)現(xiàn)VHL基因甲基化或突變〔7〕，導(dǎo)致調(diào)控缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1α的VHL基因失活，從而使HIF蛋白異常堆積，并進一步使一系列HIF下游調(diào)控基因如血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-α等表達異常，最終導(dǎo)致細胞生理代謝紊亂誘發(fā)癌癥〔8〕。如臨床已經(jīng)使用的Sorafenib就是通過阻斷該通路的來治療RCC的藥物〔9〕。但這些藥物往往會使其下游一系列調(diào)控蛋白受到抑制，影響多種器官的正常生理代謝，造成嚴重副作用〔10〕。與之相比，Denko等〔6〕證明在低氧條件下是由 HIF1 調(diào)節(jié)HIG2的表達，阻斷該靶點通路不會影響HIF其他下游調(diào)控基因，這樣就為臨床的靶向治療避免嚴重的副作用提供了基礎(chǔ)。并且HIG2蛋白僅在RCC組織高表達。免疫染色顯示HIG2蛋白在肝臟、心臟、肺、前列腺、骨髓以及正常成人腎臟組織均不表達或低表達。半定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈式反應(yīng)顯示HIG2 mRNA在其他器官腫瘤如直腸癌、乳腺癌、肝細胞癌等幾乎檢測不到〔4〕。因此，HIG2蛋白為篩選RCC臨床診斷的腫瘤標志物以及分子藥物治療的靶標提供了理論依據(jù)。

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