龔育清,楊安樹,*,陳紅兵,祖琴琴
(1.南昌大學食品科學與技術國家重點實驗室,江西南昌330047;2.南昌大學中德聯(lián)合研究院,江西南昌330047)
大豆含有豐富的蛋白質,除蛋氨酸外,其余必需氨基酸的組成和比例與動物蛋白相似,是優(yōu)質蛋白質的主要來源之一;同時,大豆還富含不飽和脂肪酸、維生素、礦物質和其他營養(yǎng)成分,具有很高的營養(yǎng)價值。隨著蛋白分離技術的不斷發(fā)展,大豆蛋白制品的口感和食品功能性不斷提高,大豆蛋白常作為配料廣泛應用于各類食品中[1]。然而,大豆又是聯(lián)合國糧農組織(FAO)認定的八大類過敏食品之一,因此,大豆在食品加工業(yè)中的廣泛應用也給大豆過敏人群帶來了潛在的危害[2-3]。迄今為止,國內外對大豆過敏尚無根治的辦法,而對大豆過敏患者而言,要完全避免攝入含有大豆過敏原的食品幾乎是不可能的。因此,弄清大豆中所含過敏原的種類和特性,并有針對性地采取相應的處理方法,使大豆中的過敏原失活、鈍化,從而生產出低致敏性或無致敏性的大豆產品,保護大豆過敏患者的食用安全,具有非常重要的現(xiàn)實意義。目前用于蛋白脫敏的方法主要可以分為物理、化學和生物技術三大類,其中生物技術因其具有高效性、特異性、無污染等優(yōu)點日漸成為人們關注的焦點,生物技術被廣泛應用于低致敏性大豆及大豆制品的生產,是一種非常具有發(fā)展前景的制備低致敏大豆制品的方法。
大豆過敏原蛋白為熱穩(wěn)定性因子,是大豆引發(fā)機體發(fā)生食物過敏反應的主要成分[4]。根據(jù)超速離心分析,用沉降系數(shù)S表示各組分,可將大豆過敏原蛋白分為15S、11S、7S和2S 4種球蛋白,11S球蛋白和7S球蛋白是大豆蛋白中的兩種主要組成成分,約占大豆種子總蛋白的70%[5],其中11S組分主要是大豆球蛋白,而7S組分主要是β-伴大豆球蛋白。根據(jù)不同的生物學功能,大豆蛋白過敏原可分為種子儲藏蛋白、結構蛋白和防御相關蛋白3大類。其中,大豆種子儲藏蛋白主要包括大豆球蛋白(11S球蛋白)、β-伴大豆球蛋白(7S球蛋白)以及7S球蛋白組分中的兩個低豐度蛋白(Gly m Bd 28K和Gly m Bd 30K);結構蛋白主要包括 Gly m 1(疏水蛋白)、Gly m 2(殼蛋白)、Gly m 3(抑制蛋白)等;防御相關蛋白主要包括病理相關蛋白、凝集素多肽片段、胰蛋白酶抑制劑等[6]。迄今為止,大豆種子儲藏蛋白被認為是大豆過敏原蛋白中引發(fā)機體發(fā)生食物過敏反應的主要成分。
大豆球蛋白(Glycinin,11S)是大豆中的一種主要貯藏蛋白,占種子總蛋白的19.5%~23.1%,具有大約3000個氨基酸殘基,分子量為320~360ku[7]。大豆球蛋白是一種六聚體寡蛋白,每個單聚體亞基大多由一個酸性多肽鏈(A,分子量約為38ku)和一個堿性多肽鏈(B,分子量約為20ku)通過二硫鍵(S-S)連接形成A-S-S-B單體形式[8-9]。已發(fā)現(xiàn)的大豆球蛋白的酸性多肽鏈有6種:A1a、A1b、A2、A3、A4和A5;堿性多肽鏈有5種:B1a、B1b、B2、B3和B4。目前已分離得到的大豆球蛋白單聚體亞基有A1aB1b(G1,53.6ku)、A2B1a(G2,52.4ku)、A1bB2(G3,52.2ku)、A5A4B3(G4,61.2ku)和A3B4(G5,55.4ku)共5種[10]。大豆球蛋白的堿性多肽鏈的致敏性較弱,而其酸性多肽鏈與IgE、IgM、IgA有很強的結合活性,致敏性較強。
伴大豆球蛋白(Conglycinin,7S)通過免疫電泳法分離、鑒定可分為α、β、γ 3種,其中,β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)是其主要存在形式,是大豆中的一種主要貯藏蛋白,占種子總蛋白的10%~12.7%,同時也是大豆中的主要過敏原[11]。β-伴大豆球蛋白是由α(約67ku)、α′(約71ku)和β(約50ku)3種亞基由疏水作用相互締合而成的共軛型三聚糖蛋白[11],其中,α亞基又稱為Gly m Bd 60K,相對于α′亞基和β亞基,α亞基致敏性更強,它具有很強結合IgE、IgM和IgA的活性,能被25%的大豆過敏患者血清所識別[12],部分品種的大豆還含有β′亞基。目前研究表明,β-伴大豆球蛋白有10種存在形式,其中已被鑒定出來有α3、α2α′、α2β、αα′β、αβ2、α′β2共6種,分別被稱為B1-B6[7]。
Gly m Bd 28K是大豆蛋白7S組分中的一種低豐度蛋白,由于它能被約25%的大豆過敏患者血清識別,因此被認為是大豆中的主要過敏原之一[13]。Gly m Bd 28K是一種以寡聚體形式存在的天冬酰胺糖蛋白,屬于Cupin蛋白家族,糖基通過N-連接方式與Gly m Bd 28K蛋白上第20位的天冬酰胺殘基連接[14],單體含有240個氨基酸殘基,分子質量為26ku。通過去糖基化作用,能使Gly m Bd 28K與大豆過敏患者血清中IgE特異性結合的活性喪失,說明糖基化位點是特異性IgE識別的重要表位[14],可以推斷N-連接聚糖部分是Gly m Bd 28K的IgE反應活性決定域。
Gly m Bd 30K又稱為P34,含量約為大豆蛋白總量的1%,是大豆蛋白7S組分中的一種低豐度蛋白,成熟的P34蛋白至少有10個抗原表位,能被65%的大豆過敏患者血清識別,因此,被認為是大豆中致敏性最強的過敏原,但也有研究認為大豆球蛋白的A3酸性多肽鏈是大豆中致敏性最強的過敏原[15]。P34是一種由257個氨基酸殘基組成的不溶于水的單分子N-連接糖蛋白,多糖與蛋白的結合位點位于多肽鏈170位天冬酰胺處,屬于木瓜蛋白酶超家族,但由于其活性中心的一個半胱氨酸被甘氨酸所取代,因而并不具有蛋白酶活性[16]。該蛋白還能通過二硫鍵與β-伴大豆球蛋白的α、α′以及β亞基等多肽結合,參與大豆蛋白的折疊。
近年來,生物技術迅速發(fā)展并廣泛應用于食品加工中,這不僅有利于促進各類功能性食品的開發(fā),而且能夠降低或消除食品中的有害物,保障消費者的食用安全。生物育種、酶法改性和微生物發(fā)酵等生物加工技術在低致敏性或無致敏性大豆及豆制品的開發(fā)中展示出了巨大的應用潛力。
育種是指通過不同方法改良遺傳特性或創(chuàng)造遺傳變異培育出優(yōu)良的動植物新品種的技術。育種的方式有多種,選擇育種和雜交育種被認為是常規(guī)育種方式,而誘變育種、單倍體育種、多倍體育種、基因工程育種和細胞工程育種等統(tǒng)稱為非常規(guī)育種,其中誘變育種常是利用物理、化學等因素誘發(fā)生物體遺傳特性發(fā)生變異,通常不屬于生物育種的范疇。生物育種在降低和消除大豆過敏原致敏性方面已經(jīng)取得了一定成效,用于降低大豆致敏性的生物育種途徑主要有常規(guī)育種法和非常規(guī)育種法中的基因工程技術育種。
2.1.1 常規(guī)育種 通過常規(guī)育種處理如篩選自然存在或發(fā)生變異的相應過敏原含量較少的大豆品種,或通過雜交手段可培育得到低致敏性的大豆。由于Gly m Bd 28K自然缺失型品種非常豐富,因而通過篩選很容易得到缺失過敏原Gly m Bd 28K的大豆品種[17]。由于不同品種的大豆致敏性不同,有文獻報道[18]:通過篩選低致敏性大豆品種并對其進行雜交育種,培育出了β-伴球蛋白α亞基、α′亞基和β亞基的含量都很低的大豆品種Kari-kei 434。在日本野生大豆品種中發(fā)現(xiàn)的β-伴球蛋白的三個亞基都缺失的大豆品種“QT2”是在自然條件下產生的突變體,該品種表現(xiàn)出正常的農藝學性狀,由于其具有極大的應用潛力和商業(yè)價值因而得到推廣[19]。但是常規(guī)育種法的成功率較低,且周期較長,成本也較高。近年來,常規(guī)育種逐漸被非常規(guī)育種所代替。2.1.2 基因工程技術育種 基因工程技術育種在大豆脫敏中的應用主要是利用基因敲除技術將大豆中表達過敏原表位的基因去除,從而降低甚至消除其致敏性。如,Herman等[20]利用基因槍技術將30K的沉默載體pKS73轉化入大豆體細胞中,成功地通過遺傳修飾去除了大豆中主要過敏原Gly m Bd 30K,與對照植株相比,去除Gly m Bd 30K的轉基因植株的生長性、蛋白含量以及含油率等農藝學性狀沒有顯著的差異,且這種沉默性狀能夠穩(wěn)定的遺傳給下一代。
基因工程技術已經(jīng)成為大豆育種的重要途徑,然而它在降低大豆致敏性中的應用并不廣泛,其主要原因是大豆中過敏原的種類非常多,在大豆總蛋白中占很高的比例,因此通過基因工程育種去除大豆中全部過敏原不太現(xiàn)實,并且可能會對大豆植株的生長特性以及大豆蛋白的加工性能產生不良影響[21]。另外,通過基因工程技術去除過敏原的方法本身就具有爭議性,轉基因大豆的生理毒性、營養(yǎng)吸收性以及對環(huán)境的威脅等仍有待進一步研究證實。
酶法改性降低大豆過敏原蛋白致敏性的方法主要包括酶水解和酶促交聯(lián),主要機制是利用蛋白酶催化過敏原蛋白發(fā)生水解或交聯(lián)作用,改變蛋白質原有的空間結構,而蛋白質結構的變化,一方面通過改變過敏原的表位結構,對其致敏性產生影響;另一方面還可以改善蛋白質的功能特性,如凝膠特性、流變學特性、乳化性和保水性等。
2.2.1 酶水解 酶水解改性蛋白技術是利用一種或多種蛋白酶對蛋白進行內切及外切作用,將蛋白分子降解成肽類以及更小的氨基酸分子的方法,該方法具有反應條件溫和、特異性高、無有害物質殘留等優(yōu)點。蛋白酶水解能使分子中部分化學鍵斷裂改變過敏原表位原有的空間結構或水解酰胺鍵形成小分子肽段以減弱或消除大豆過敏原的致敏性。同時,蛋白酶水解還可以產生一些具有免疫調節(jié)、防癌、抗氧化、降血壓等重要生理功能的生物活性肽[22-23]。
根據(jù)酶解程度和酶解產物分子量分布,可以將蛋白質酶解改性分為輕度酶解、適度酶解和深度酶解,而輕度酶解和適度酶解也被認為是限制性酶解。
2.2.1.1 限制性酶解 蛋白質的限制性酶解可實現(xiàn)水解度和酶解產物的多樣性調控,不僅適用于低致敏性大豆蛋白產品的生產,而且常被用于生產具有特殊生理活性的多肽或優(yōu)良加工特性的功能性蛋白。用于大豆蛋白限制性酶解的蛋白酶主要有作用于堿性氨基酸的胰蛋白酶、作用于疏水氨基酸的枯草桿菌中性蛋白酶、作用于親水氨基酸的木瓜蛋白酶以及作用底物廣泛的堿性蛋白酶,其中最常用的是木瓜蛋白酶和堿性蛋白酶[24]。Shutov等[25]將木瓜蛋白酶和大豆球蛋白以質量比為1∶200的比例混合,30℃孵育,結果表明:木瓜蛋白酶能夠很好的水解大豆球蛋白,而且酸性鏈水解和堿性鏈水解是分步進行的,酸性鏈的水解產物還可能對堿性鏈的水解起著促進作用。Tsumura等[26]發(fā)現(xiàn)一種芽孢桿菌堿性蛋白酶FG-F能有效水解大豆中β-伴大豆球蛋白的α亞基、Gly m Bd 30K和Gly m Bd 28K過敏原蛋白,從而降低大豆的致敏性,其中,Gly m Bd 30K與特異性IgE的免疫反應性降低高達99.2%。此外,Vernaza等[22]研究發(fā)現(xiàn)由地衣芽孢桿菌產生的堿性蛋白酶能夠有效的水解分子量大于40ku,包括β-伴大豆球蛋白α、α′和β亞基在內的過敏原蛋白。
2.2.1.2 深度酶解 蛋白質的深度酶解常用于低致敏性的酶解產物的生產,酶解產物主要是小分子肽和氨基酸,主要用作調味品和營養(yǎng)配方產品的原料。多種限制性蛋白酶的復合使用是深度酶解大豆過敏原蛋白非常有效的方法,有文獻[27]報道利用AS1.398中性蛋白酶和木瓜蛋白酶(酶活比為1∶1)協(xié)同酶解大豆蛋白,就是一種深度酶解大豆過敏原蛋白,制取低分子肽的有效方法。Aguirre等[28]研究發(fā)現(xiàn)用乳酸桿菌CRL 251菌株的細胞懸液產生的酶水解大豆蛋白,可以幾乎完全降解β-伴大豆球蛋白的3個亞基,大豆球蛋白的大部分酸性亞基和堿性亞基也被降解,水解產物中的小分子多肽、氨基酸特別是必需氨基酸含量大大提高。酶水解能夠破壞大豆過敏原的某些過敏原表位,但同時,酶水解也可能使得某些隱藏在蛋白質空間結構內部和疏水區(qū)的線性過敏原表位暴露,形成新的過敏原表位,導致部分過敏患者食用此類食品后仍會出現(xiàn)過敏癥狀;而且,過度酶解因過多疏水基團的暴露使水解產物帶有苦腥味,產品的適口性差,一定程度上制約了它在食品工業(yè)中的應用。針對酶深度水解容易產生苦味肽的缺陷,在蛋白水解方面常采用不同類型酶協(xié)同水解。研究發(fā)現(xiàn)利用堿性蛋白酶與氨肽酶協(xié)同水解能夠切除苦味多肽末端的疏水氨基酸,因而能有效的去除大豆蛋白水解產物的苦味[29];而利用醬油的Aspergillus屬的霉曲產生的粗酶液浸泡豆腐,不僅可以降低豆腐的致敏性,同時此粗酶液中存在的外切蛋白酶能夠降解苦味多肽,改善豆腐口感[30]。因此,大豆蛋白深度酶解后再結合利用能切除苦味多肽末端疏水氨基酸的限制性酶進行酶解,將有望為我們提供致敏性低并且口感適宜的大豆蛋白產品。
2.2.2 酶促交聯(lián) 酶促交聯(lián)作用能使過敏原蛋白內部多肽鏈之間或蛋白質分子之間形成共價鍵,促使蛋白質發(fā)生聚合,屏蔽暴露于蛋白質分子表面的過敏原表位,從而消除其致敏性。常用的交聯(lián)酶主要有轉谷氨酰胺酶、過氧化物酶、多酚氧化酶等,該方法已被應用于低致敏性花生和牛奶的研究和開發(fā)[31]。酶促交聯(lián)對大豆過敏原蛋白致敏性影響的研究還處于起步階段。如,Tang等[32]研究表明,轉谷氨酰胺酶能有效地促使β-伴大豆球蛋白的主要組分以及大豆球蛋白中強致敏性的酸性多肽鏈發(fā)生交聯(lián),而對大豆球蛋白中致敏性較弱的堿性多肽鏈幾乎不產生影響,但該研究對各蛋白發(fā)生交聯(lián)的具體方式還沒有深入的研究。過敏原交聯(lián)后空間結構的改變能夠屏蔽其分子表面原有的某些表位,但酶促交聯(lián)形成蛋白質多聚體后,也有可能使其致敏性增強,因而酶促交聯(lián)對大豆過敏原致敏性的影響仍有待進一步探索和評估。
2.2.3 酶復合改性 比較酶水解和酶促交聯(lián)的作用機理,不難發(fā)現(xiàn)這兩種酶法改性在降低大豆過敏原蛋白致敏性方面有一定的互補性。高致敏性的大豆蛋白經(jīng)酶解后再進行酶促交聯(lián),一方面,酶解能有效的降低或消除大豆過敏原的致敏性;而酶促交聯(lián)能掩蓋和修飾相關過敏原表位,同時,還能保持或提高大豆蛋白的加工性能。研究發(fā)現(xiàn)大豆11S球蛋白經(jīng)過SDL-9堿性蛋白酶水解后,再加入轉谷氨酰胺酶使水解產物發(fā)生交聯(lián),能有效的提高其水溶性、乳化性和發(fā)泡性[33]。這種結合了酶水解-酶促交聯(lián)優(yōu)點的酶復合改性法將為低致敏性或無致敏性的大豆功能性產品的開發(fā)提供一條很好的途徑。
微生物發(fā)酵在大豆脫敏中的應用主要是利用發(fā)酵過程中微生物分泌的酶來降解大豆及豆制品中的過敏原或去除過敏原表位以降低其致敏性,同時還能夠累積有益的代謝產物。
Feng等[34]研究發(fā)現(xiàn)豆粕經(jīng)枯草芽孢桿菌發(fā)酵后,其中胰蛋白酶抑制劑的活性消失,而大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白幾乎被完全降解,用這種發(fā)酵豆粕飼喂仔豬可顯著改善仔豬的腸道消化功能,提高仔豬的生長性能。Teng等[35]分別用枯草芽孢桿菌和米曲霉接種于大豆粉進行固態(tài)發(fā)酵,結果表明:發(fā)酵不僅能夠有效降低大豆粉的致敏性,而且能夠提高其蛋白含量和抗氧化活性。也有研究發(fā)現(xiàn):通過混菌發(fā)酵后的大豆粉因大豆蛋白的部分水解,使得β-伴大豆球蛋白的α亞基、α′亞基以及大豆球蛋白的酸性亞基的致敏性均有所降低[36]。Song等[37]發(fā)現(xiàn)大豆粉在自然條件下,以及分別接種植物乳桿菌、乳雙歧桿菌、啤酒酵母發(fā)酵后能顯著增加其總蛋白和氨基酸含量,并且與IgE的特異性免疫反應均能明顯降低,其中,大豆粉經(jīng)啤酒酵母發(fā)酵48h后與IgE免疫反應性降低高達89%。Lee等[38]將乳酸乳球菌、米曲霉和枯草芽孢桿菌接種于大豆進行聯(lián)合發(fā)酵,檢測顯示:發(fā)酵產物幾乎不與大豆過敏患者血清發(fā)生任何特異性免疫反應。上述研究表明:通過微生物發(fā)酵不僅能顯著降低大豆制品的致敏性,同時還能改善產品的口感、提高其消化利用率和營養(yǎng)價值[39]。
近年來,隨著食物過敏患者人數(shù)不斷上升,食物過敏已成為全世界普遍關注的食品安全問題。大豆作為一種重要的大眾食品原料,同時又是主要的過敏食物,因此,開發(fā)低致敏或無致敏大豆及大豆制品具有重要的現(xiàn)實意義。由于大豆中的主要過敏原有很強的熱穩(wěn)定性,通過簡單的熱加工處理難以有效地降低其致敏性;而采用物理分離法去除過敏原也不能取得理想的效果,還會造成蛋白的損失和理化性質的改變;化學加工法雖然可以很大程度的除去大豆中某些過敏原,但會因引入化學試劑導致產品中化學物質的殘留,帶來食用安全隱患,而后期除去殘留的化學物質又會增加加工成本;生物育種、酶法改性和微生物發(fā)酵等生物加工技術具有效率高、特異性好、無污染等優(yōu)點,不僅能有效的降低或消除大豆中主要過敏原的致敏性,同時能改善大豆蛋白產品的某些功能特性,因此,生物技術在降低大豆致敏性方面的應用潛力巨大。然而,單一生物技術的應用常常很難使大豆過敏原的致敏性降低到安全范圍內,產品的某些加工性能也難以滿足食品加工的需要;此外,轉基因大豆的食用安全性以及對環(huán)境的威脅也有待進一步研究證實。而多種生物技術以及生物技術與物理化學方法的聯(lián)合使用有望為低致敏性或無致敏性的大豆功能性產品的開發(fā)提供一條很好的途徑,將是未來研究和開發(fā)低致敏性或無致敏性大豆及豆制品的主要方向之一。
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