唐永翠，嚴(yán) 敏，孫付軍，李貴海

(1五蓮縣人民醫(yī)院，山東日照262300;2山東省疾病預(yù)防控制中心;3山東省中醫(yī)藥研究院)

柴胡、黃芩是臨床常用的配伍“藥對”，最早出自《傷寒論》，是仲景柴胡系列方劑中最具代表意義的基本配伍，在小柴胡湯、柴葛解肌湯、大柴胡湯、龍膽瀉肝湯等諸多經(jīng)典方劑中配伍應(yīng)用。柴胡疏肝升陽、和解表里，黃芩疏風(fēng)清肺、宣肺止咳，二者和用具有清熱疏肝及和解少陽之功能，在臨床有廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)。本研究通過觀察柴胡、黃芩不同配伍比例的含藥血清對異煙肼所致肝細(xì)胞損傷的影響，探討柴胡與黃芩主要藥效學(xué)作用的最佳配伍關(guān)系，為中醫(yī)臨床用藥和中藥復(fù)方的基礎(chǔ)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及藥物 雄性Wistar大鼠30只，體質(zhì)量250～300 g，SPF級，由山東大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號:SCXK(魯)20090001。柴胡(批號:060501)、黃芩(批號:20070601)購于山東濟南天一中藥飲片有限公司，經(jīng)山東中醫(yī)藥研究院中藥資源研究室鑒定為傘形科植物柴胡Bupleurum chinense DC(北柴胡)和唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，受試液由山東省千佛山醫(yī)院藥劑科制備，柴胡、黃芩不同比例的配伍受試液分別為1∶0、1∶2、1∶1、2∶1、0∶1，每種受試藥均制成每毫升含生藥量1 g的溶液備用。

1.2 不同配伍比例柴、黃芩含藥血清的制備方法取雄性Wistar大鼠，用柴胡、黃芩配伍比例分別為1∶0、1∶2、1∶1、2∶1、0∶1 藥液按 10 mL/kg 灌胃，2次/d，連續(xù)7 d。末次灌胃給藥90 min后，大鼠腹主動脈無菌采血。3 000 r/min離心15 min，無菌收集血清，56℃滅活30 min，經(jīng)0.22 μm 濾器抽濾除菌后-70℃保存，備用。

1.3 肝細(xì)胞 HepG2培養(yǎng)及處理方法 肝細(xì)胞HepG2接種于6孔細(xì)胞板，每孔加入1.5 mL，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后換液。將細(xì)胞分為對照組、模型組、給藥組1、給藥2、給藥組3、給藥組4和給藥組5。給藥組1、2、3、4、5分別用含10%不同配伍比例柴胡、黃芩(比例分別為 1∶0、1∶2、1∶1、2∶1、0∶1)含藥血清的 RPMI1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)液培養(yǎng);對照組和模型組含藥血清用正常鼠血清代替。同時，根據(jù)HepG2細(xì)胞株半數(shù)細(xì)胞病變率(TCD50)及凋亡情況，用4 mg/mL異煙肼接種于除對照組外其他組細(xì)胞。培養(yǎng)48 h后，觀察各組細(xì)胞病變程度并進(jìn)行細(xì)胞凋亡檢測。

1.4 觀察方法 ①顯微鏡下記錄細(xì)胞不同程度的病變:(+)表示約25%細(xì)胞發(fā)生病變;(++)為50%細(xì)胞發(fā)生病變;(+++)為75%細(xì)胞發(fā)生病變;(++++)為全部細(xì)胞發(fā)生病變。②細(xì)胞凋亡檢測:收集培養(yǎng)24 h的 HepG2細(xì)胞，PBS洗2次，1×Bingding Buffer重懸細(xì)胞(1×106)。取100 μL(1×105)細(xì)胞加入到 TruCount管。加5 μL FITC AnnexinV 和 5 μL PI。輕輕渦旋細(xì)胞，室溫避光孵育 15 min。加 400 μL 1×Bingding Buffer，待檢，1 h內(nèi)上機檢測。流式細(xì)胞儀檢測Annexin/PI陽性染色率，其中Annexin V+為早期凋亡，PI+為壞死，Annexin V+/PI+為壞死或晚期凋亡，以上各項相加為細(xì)胞總凋亡率。③Fas、FasL(CD95/CD95Ligand)檢測:收集培養(yǎng)24 h的HepG2細(xì)胞，PBS洗滌2次，PBS重懸 HepG2細(xì)胞。取100 μL(1×106)細(xì)胞加入到 TruCount管。再加 20 μL FITC CD95和 5 μL PE anti-human CD95Ligand。輕輕渦旋細(xì)胞，室溫避光孵育15～30 min。加 2 mL PBS，1 000 r/min離心。棄上清，加入500 μL鞘液，上機檢測。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS12.0統(tǒng)計軟件。計量資料以±s表示，組間比較采用成組t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

與對照組相比，模型組細(xì)胞發(fā)生腫脹變性及細(xì)胞脫落死亡的情況嚴(yán)重，各給藥組細(xì)胞病變情況不同程度減輕，其中減輕程度以給藥組2最為明顯，其次為給藥組1、給藥組3、給藥組4，給藥組5減輕程度相對較弱。各組鏡下病變情況分別為對照組(-)，模型組(+++)，給藥組1(+)，給藥組2(±)，給藥組3(+)，給藥組4(+)，給藥組5(+)。各組肝細(xì)胞HepG2凋亡檢測結(jié)果見表1。各組肝細(xì)胞HepG2Fas、FasL相對表達(dá)量見表2。

表1 各組肝細(xì)胞HepG2凋亡檢測結(jié)果(%，±s)

表1 各組肝細(xì)胞HepG2凋亡檢測結(jié)果(%，±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05，△P ＜0.01

組別 PI+ AnnexinV+AnnexinV+/PI+總凋亡率給藥組1 5.65 ±1.83 4.92 ±1.77* 9.35 ±2.23*19.92 ±2.34*給藥組2 4.75 ±2.00 4.52 ±1.45* 9.05 ±2.72*18.32 ±4.62*給藥組3 5.52 ±1.19 4.85 ±2.34* 9.33 ±2.31*19.70 ±4.42*給藥組4 6.25 ±1.27 5.12 ±1.79*11.45 ±1.95*22.82 ±2.76*給藥組5 6.17 ±1.54 5.37 ±2.53*12.37 ±3.09*23.90 ±4.82*模型組 6.57 ±1.32 12.55 ±0.57 18.98 ±4.12 38.10 ±4.41對照組 0.92 ±0.28△ 2.28 ±0.43* 4.53 ±0.66* 7.73 ±0.67*

表2 各組肝細(xì)胞HepG2Fas、FasL相對表達(dá)量(%，±s)

表2 各組肝細(xì)胞HepG2Fas、FasL相對表達(dá)量(%，±s)

注:與模型組比較，*P ＜0.05

Fas FasL給藥組1 8.48 ±1.26* 3.62 ±1.47組別*給藥組2 6.02 ±1.33* 4.35 ±1.18*給藥組3 8.23 ±1.59* 4.02 ±1.12*給藥組4 8.52 ±1.35* 4.60 ±1.20*給藥組5 9.62 ±1.63* 6.95 ±1.52*模型組 20.68 ±1.98 12.15 ±2.13對照組 6.82 ±1.34* 6.23 ±0.89*

3 討論

中藥研究的基本困難在于起作用的物質(zhì)基礎(chǔ)不明確，因此對于其作用機制和生物轉(zhuǎn)化、代謝過程的研究更加困難。血清藥理學(xué)主要是通過研究給藥動物血清的生物學(xué)活性來揭示藥物作用機制。動物灌胃后一定的時間內(nèi)采血，分離血清，用含此藥物成分的血清來檢驗其生物學(xué)活性。血清藥理學(xué)實驗方法具有體外實驗可控性強、藥物效應(yīng)易于檢測、可深入揭示藥物作用機理等優(yōu)點，并代表了藥物在體內(nèi)產(chǎn)生作用的真正有效成分。中藥血清藥理學(xué)最早在80年代由日本京都大學(xué)學(xué)者田代真一首先提出。這種研究方法可以有效避免普通中藥體外實驗可能產(chǎn)生的誤差。因為藥物口服后經(jīng)過吸收、分布、代謝等一系列過程，部分在體外實驗為有效成分，經(jīng)過一系列吸收代謝后可能某些有效成分失活或不被吸收而不能在體內(nèi)發(fā)揮作用;而有些在體外實驗時的無效成分可能經(jīng)過體內(nèi)代謝轉(zhuǎn)化為活性物質(zhì)。中藥血清可以模擬代謝后藥物的情況，更準(zhǔn)確地反映藥物真實作用;防止中藥粗制劑理化因素(如電解質(zhì)、滲透壓、pH等)對實驗的干擾。本實驗采取中藥血清藥理學(xué)研究方法，能更準(zhǔn)確客觀地反映藥物代謝后真正效用［1］。

Fas和FasL是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的一對膜蛋白，兩者通過結(jié)合胞內(nèi)的死亡受體FADD/MORT1或DAXX，進(jìn)而激活Capase-8或Jnk通路引起表達(dá)Fas的細(xì)胞凋亡［2，3］。在多種肝病中可發(fā)現(xiàn)其介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。在慢性乙型、丙型病毒性肝炎等肝病中，國內(nèi)外研究均發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞表面Fas和FasL表達(dá)同時增加，在匯管區(qū)等炎癥活躍的區(qū)域增加明顯，并隨炎癥的嚴(yán)重程度而增加。這些發(fā)現(xiàn)打破了經(jīng)典的Fas介導(dǎo)的凋亡途徑，即肝細(xì)胞僅表達(dá)Fas，而CTL、NK細(xì)胞表達(dá)FasL。Fas、FasL表達(dá)是慢性肝細(xì)胞凋亡的一種重要機制之一，抑制肝細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)將有助于減輕肝細(xì)胞損傷程度。減少Fas和FasL誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡成為抗肝損傷研究的新亮點［4～8］。本研究采用流式細(xì)胞儀 AnnexinV/PI染色法驗證了異煙肼干預(yù)的HepG2細(xì)胞出現(xiàn)凋亡和壞死，并發(fā)現(xiàn)異煙肼作用于HepG2細(xì)胞后與對照組相比伴隨凋亡率的增加，HepG2細(xì)胞中Fas、FasL表達(dá)增高，提示Fas、FasL活化參與了異煙肼致HepG2細(xì)胞凋亡過程，此為進(jìn)一步研究異煙肼的肝毒性以及相應(yīng)治療提供了理論依據(jù)。但凋亡和Fas、FasL陽染所占比例較低，提示Fas/FasL通路不是異煙肼致肝細(xì)胞凋亡的惟一通路，凋亡亦不是異煙肼致HepG2細(xì)胞死亡的主要原因［9～13］。給予含不同比例柴胡、黃芩配伍血清后Fas及FasL表達(dá)比例減少，且細(xì)胞病變情況不同程度減輕，細(xì)胞總凋亡率降低，提示柴胡、黃芩含藥血清可以通過抑制Fas、FasL表達(dá)進(jìn)而減少肝細(xì)胞凋亡，達(dá)到抗肝損傷的目的。

［1］張瑋函，吳咸中.藥物血清在中藥復(fù)方藥理研究中的應(yīng)用及其發(fā)展［J］.中國中西醫(yī)結(jié)合外科雜志，2007，13(4):190-193.

［2］Kaufmann SH，Earnshaw WC.Induction of apoptosis by cancer chemotherapy［J］.Exp Cell Res，2000，256(1):42-49.

［3］Timmer T，de Vries EG，de Jong S.Fas receptor-mediated apoptosis:a clinical application［J］.J Pathol，2002，196(2):125-134.

［4］吳靈飛，蘇建東，李國平，等.腺苷體外對人肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的誘導(dǎo)作用及其作用機制［J］.中國藥理學(xué)與毒性學(xué)雜志，2008，22(3):205-211.

［5］任寧，王世明，董秀山，等.自噬對肝癌HepG2細(xì)胞增殖及對細(xì)胞周期影響的研究［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2012，19(11):8-10.

［6］宋淑亮，肖曾平，吉愛國，等.絞股藍(lán)多糖對HepG2細(xì)胞酒精性肝損傷的保護(hù)作用［J］.中國生化藥物雜志，2008，29(5):302-305.

［7］丁曉蕾，張陽，吳濤.索拉菲尼逆轉(zhuǎn)肝癌細(xì)胞株HepG2/GEM耐藥作用的實驗研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2010，17(15):1160-1163.

［8］耿秀芳，楊利麗，潘智芳，等.銀杏葉總黃酮對人肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究生學(xué)報，2010，23(6):601-603.

［9］閔亮.補腎健脾中藥聯(lián)合5-FU對肝癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡影響的血清藥理學(xué)研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2010，8(8):109-110.

［10］李鵬輝.大蒜素對人肝癌HepG2細(xì)胞增值抑制作用的研究［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)生，2010，48(16):7-13.

［11］楊春光，弓曉杰，孫長濱.人參皂苷代謝產(chǎn)物衍生物對HepG2細(xì)胞凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響［J］.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010，20(14):2100-2102.

［12］楊華，程金建，梁鋼.丹酚酸C誘導(dǎo)肝癌HepG2細(xì)胞有絲分裂阻滯及凋亡的研究［J］.中國藥理學(xué)通報，2010，26(9):1208-1212.

［13］陳莉，尚娟，王志鳳，等.硝酸酯/齊墩果酸雜合物的合成及HepG2細(xì)胞凋亡抑制活性的研究［J］.藥學(xué)學(xué)報，2010，45(12):1516-1522.