劉慧明，丁 航，張海濤

0 引 言

化療是肝細胞癌 (hepatocellular carcinoma cells，HCC)最常用的治療手段，但化療毒性限制其應用。腫瘤治療的突破很可能依賴于新型藥物的開發(fā)和基因治療技術的成熟，尋找新的適合基因作為靶基因將是基因治療的一個重要方向。

pp3501最早是Wan等［1］報道，他們利用大規(guī)模cDNA轉染法，在基因組水平上對影響肝癌細胞生長的基因進行功能掃描，搜索了大量對細胞生長有影響的相關基因，共獲得3806個基因，并將這些基因分別標記，其中1個序列標記為pp3501，并在Genbank登記了pp3501 mRNA的序列。目前pp3501的功能尚不明確，本研究探討pp3501對肝癌細胞生長的影響。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 3株肝癌細胞系(HepG2、Hep3B和PLC/PRF/5)購自American type culture collection(Rockville，MD，USA)，保存在廣東醫(yī)學院生物化學與分子生物學研究所。所用細胞系均用含10%胎牛血清(杭州四季青)的Dulbecco's modified Eagle培養(yǎng)基(Gibco BRL，Grand Island，NY，USA)并加入青霉素(100 U/mL)和鏈霉素(100 μg/mL)于37℃、5%CO2環(huán)境培養(yǎng)。3株肝癌細胞系分別設空白組、對照組(轉染空質粒pEGFPN1入HCC細胞)、pp3501組(將 pEGFPN1-pp3501轉染入HCC細胞)。

1.2 試劑 MTT，propidium iodide購自 Sigma-Aldrich(St.Louis，MO，USA)。兔抗或羊抗等一抗和相應二抗購自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz Biotechnology，CA，USA)，EcoR I、Sal I內(nèi)切酶。

1.3 pEGFPN1-pp3501重組質粒的構建 PCR擴增pp3501開放閱讀框序列，并在上下游引物中分別加上EcoR I，Sal I酶切位點。上游引物:5'-GATCCGAATTCACCATGGTTTTAGCAGATGC-3'，下 游 引物:5'-TGTCGACGGGTCTTGCACGTGTCAC-3'。反應條件:94℃變性3 min，進入循環(huán)，94℃ 30 s，56℃30 s，72℃ 30s，30 個循環(huán)，72℃ 5min。普通瓊脂糖電泳鑒定，并用 QIAquick?Gel Extraction Kit試劑盒切膠回收。雙酶切pp3501回收產(chǎn)物(EcoR I，Sal I)，酚/氯仿法進行純化。同時對pEGFPN1質粒行雙酶切(EcoR I，Sal I)和純化。將酶切回收的pp3501和pEGFPN1質粒進行連接。DNA重組質粒轉化大腸埃希菌DH5а，篩選陽性克隆，提取質粒DNA，重組質粒測序鑒定送北京奧科生物工程公司測序。

1.4 MTT檢測細胞生長曲線 HCC細胞(1.0×103)接種在96孔板培養(yǎng)板，連續(xù)培養(yǎng)5 d。每隔1 d取樣，加入10 μL 5 mg/mL MTT溶液。37℃培養(yǎng)4 h后，用100μL含20%SDS的50%二甲基酰胺溶液溶解細胞。用Varioskan Flash Reader spectrophotometer(THERMO，MA，USA)于570 nm 檢測 A值［2-4］。

1.5 平板克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的肝癌細胞，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮在10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中備。按每孔100個細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，并輕輕轉動，使細胞分散均勻。置37℃、5%CO2及飽和濕度的環(huán)境下，靜置培養(yǎng)2周。當培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時，終止培養(yǎng)。棄上清液，用PBS浸洗2次。加純甲醇或1∶3醋酸/甲醇5 mL，固定15 min。然后去固定液，加適量0.4%結晶紫應用染色液染10～30 min，然后用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計數(shù)克隆或在顯微鏡(低倍鏡)計數(shù)大于10個細胞的克隆數(shù)。最后計算克隆形成率。

克隆形成率=(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%

1.6 Western blot檢測DAPK磷酸化變化 細胞用裂解緩沖液［50 mmol/L Tris-HCl，150 mmol/L NaCl，5mmol/L EDTA，1%NP40，0.05%(PMSF)，2μg/mL aprotinin(Sigma，USA)，2μg/mL leupeptin(Sigma，USA)，pH 8.0)］處理。按前述方法進行 Western blot檢測［5-6］，發(fā)光試劑用Amersham Biosciences公司產(chǎn)品。

1.7 統(tǒng)計學分析 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。定量檢測結果用均數(shù)±標準差(±s)表示。方差齊性分析后用多重比較檢測，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 pEGFPN1-pp3501重組表達質粒的PCR鑒定pp3501重組表達質粒經(jīng)特異性引物的初步鑒定成功擴增出pp3501基因的開放閱讀框片段，大小為432 bp，測序公司檢測的序列是互補鏈，互補鏈的堿基序列見圖1。測序結果經(jīng)比對(GeneBank Accession:EU375738.1，GI:165 975 384;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU375 738.1)，與預期的pp3501開放閱讀框序列完全一致，大小為432 bp，無移碼突變，載體構建成功。

圖1 pEGFPN1-pp3501重組質粒PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖Figure 1 Agarose gel electrophoresis of the PCR products of pEGFPN1-pp3501 plasmid

2.2 pp3501抑制HCC細胞增殖 轉染了pp3501的肝癌細胞生長曲線明顯遲緩于對照組?？寺⌒纬蓪嶒灡砻鬓D染pp3501的肝癌細胞克隆數(shù)(HepG2、Hep3B、PLC/PRF/5 分別為 48.0%、40.3%、42.2%)較對照組細胞(91.8%、80.1%、80.5%)顯著下降 ，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，見圖2、圖3。

圖2 pp3501對不同肝癌細胞生長的影響Figure 2 Effect of pp3501 on the growth of hepatocellular carcinoma cells

圖3 pp3501抑制肝癌細胞克隆形成(n=4)Figure 3 Inhibitory clone formation of hepatocellular carcinoma cells(n=4)

2.3 pp3501對肝癌細胞表達死亡相關蛋白激酶(death-assocoated protein kinase，DAPK)的影響轉染pp3501基因的細胞的DAPK磷酸化水平降低，總的DAPK水平不變，提示DAPK被激活。結果見圖4-圖6。

圖4 pp3501對肝癌細胞DAPK表達水平的影響Figure 4 Effect of pp3501 on the DAPK expression levels in hepatocellular carcinoma cells

圖5 灰度值分析DAPK磷酸化水平Figure 5 Gray value analysis of DAPK phosphorylation levels

圖6 灰度值分析DAPK表達水平Figure 6 Gray value analysis of DAPK expression levels

3 討 論

我們用限制性顯示PCR技術分析丁酸鈉處理Raji細胞前后基因表達變化時，發(fā)現(xiàn)其中一條來自19號染色體的表達序列與預測蛋白pp3501的基因序列相同［7］。根據(jù)我們的研究結果申請登錄了該基因序列，Genbank登錄號:EU375 738(GeneBank Accession:EU375 738.1，GI:165 975 384;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU375738.1)。

pp3501基因的開放閱碼框有432 bp，編碼的蛋白質由143氨基酸殘基組成。ProtParam軟件分析顯示pp3501蛋白的理論相對分子質量為15739.7，理論等電點為11.60，是堿性蛋白。用Hopfield神經(jīng)網(wǎng)絡預測蛋白質二級結構，提示pp3501蛋白具有3個螺旋區(qū)域和6個 β折疊區(qū)域，無跨膜結構。ProtScale程序分析給出pp3501蛋白疏水區(qū)域最大值是1.489，位于90～100氨基酸殘基區(qū)域，最小值為-2.911，提示pp3501應是親水性蛋白。

NetPhos 2.0 Server軟件分析pp3501蛋白序列提示，第11、87、129位絲氨酸殘基和第41、135位蘇氨酸殘基是潛在的被絲氨酸/蘇氨酸激酶磷酸化位點。NetPhosK 1.0軟件分析進一步提示pp3501是多種蛋白激酶潛在的磷酸化底物。其中11位絲氨酸殘基是潛在的p38MAPK、周期素依賴性蛋白激酶5、糖原合酶激酶3磷酸化位點;24、117位蘇氨酸殘基和68、107、129位絲氨酸殘基是潛在的蛋白激酶C磷酸化位點;此外，68位絲氨酸殘基也是潛在的DNA依賴的蛋白激酶磷酸化位點;129位絲氨酸殘基也是潛在的蛋白激酶A磷酸化位點;41位蘇氨酸殘基是潛在的蛋白激酶G磷酸化位點。87位絲氨酸殘基和135位蘇氨酸殘基是潛在的Ca2+/CaM依賴性蛋白激酶Ⅱ的磷酸化位點。生物信息學預測pp3501具有多個蛋白激酶的磷酸化位點，提示pp3501可能具有不同的生物學功能，這均需要進一步實驗驗證。過表達pp3501的肝癌細胞生長曲線明顯遲緩于對照組。相應的肝癌細胞克隆數(shù)比對照組細胞顯著下降。這提示，pp3501能抑制肝癌細胞增殖，并同時觀察到DAPK磷酸化水平下降。DAPK磷酸化降低意味DAPK活性增強［8］。

以往的研究證實，DAPK的表達水平變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、腫瘤轉移密切相關［9-11］。這提示轉染pp3501的肝癌細胞，雖然不影響DAPK表達水平，但激活DAPK抑制肝癌細胞增殖。

DAPK是由Kimchi等發(fā)現(xiàn)的凋亡促進因子［12-13］。DAPK 轉錄成熟的 mRNA 為 5900 kb，編碼蛋白相對分子質量為160 000。DAPK含多個功能區(qū)域，包括一個核心的催化區(qū)域，一個緊鄰的鈣調蛋白結合區(qū)域，一個由8個重復的錨定蛋白組成的區(qū)域［由33個氨基酸殘基組成的重復序列，參與蛋白質與蛋白質之間的相互作用)、一個P-loops環(huán)(一種單核苷酸結合基序)、一個細胞骨架結合區(qū)域和一個死亡結構區(qū)域(DD區(qū)域)］。目前研究發(fā)現(xiàn)，DAPK可通過2種方式調控其活性。一種是鈣調區(qū)域的自身磷酸化的自我抑制調節(jié)作用。磷酸化不僅調節(jié)酶的催化活性，也調節(jié)酶在體內(nèi)的功能，這一點在細胞作用中是很關鍵的。另一種自身抑制機制與C末端的17個氨基酸殘基有關，雖然目前對它活動的分子機制知之甚少，但它可能為特定藥物的研發(fā)提供一個基礎［14-16］。

過表達pp3501抑制肝癌細胞增殖同時能激活DAPK，但pp3501如何激活DAPK，其抑制肝癌細胞增殖是否依賴于DAPK激活尚待進一步實驗證實。

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