王雪連，孔慶濤，劉 芳，沈永年，王高峰，馮 姣，黨潔明，桑 紅

0 引 言

外陰陰道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis，VVC)為外陰瘙癢常見病因。近年來隨著抗生素及糖皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，VVC的發(fā)病率呈明顯上升趨勢。美國2007年資料顯示，約75%的女性一生中至少患過1次VVC，40% ～50%的女性發(fā)病2次以上［1-3］。Neves等［4］對24 例復(fù)發(fā)性 VVC 患者研究發(fā)現(xiàn)，60%的患者曾有過敏史，其中5例對氟康唑不敏感的患者在加服西替利嗪后癥狀得以緩解，這些均提示VVC引起外陰瘙癢過程中除了分泌物刺激及念珠菌產(chǎn)生毒素的直接刺激后，還存在其他引起瘙癢的機制。臨床中觀察到部分VVC患者抗真菌治療菌學(xué)轉(zhuǎn)陰后，外陰瘙癢癥狀仍然存在。針對是否念珠菌感染病史可改變念珠菌抗原與宿主之間的相互作用，以及患者對定植于此部位的低濃度念珠菌發(fā)生超敏反應(yīng)，導(dǎo)致外陰瘙癢久治不愈這一問題，我們通過試驗研究白念珠菌超敏反應(yīng)與外陰瘙癢之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2011-03-06至2011-05-10南京軍區(qū)南京總醫(yī)院門診87例女性患者資料，年齡20～72歲，以其中33例確診為VVC的外陰瘙癢患者作為 VVC組，年齡(31.0±7.1)歲;26例伴有VVC病史的外陰瘙癢患者作為VVC病史組，年齡(36.9±10.8)歲;28例皮炎、濕疹及特應(yīng)性皮炎患者作為對照組(36.1±12.6)歲。各組患者年齡、臨床資料差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，具有可比性。入選標(biāo)準(zhǔn):VVC的診斷依據(jù)中華醫(yī)學(xué)會婦產(chǎn)科學(xué)分會感染性疾病協(xié)作組制訂的診治標(biāo)準(zhǔn)［5］;VVC病史組患者就診時真菌學(xué)陰性;對照組患者無外陰瘙癢，陰道分泌物真菌直接鏡檢陰性，既往無VVC病史;皮炎、濕疹的診斷依據(jù)中國臨床皮膚病學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)［6］;特應(yīng)性皮炎的診斷依據(jù)Williams特應(yīng)性皮炎診斷標(biāo)準(zhǔn)［7］。排除標(biāo)準(zhǔn):排除其他外生殖器感染性疾病，且無其他病理學(xué)改變證據(jù)，2周內(nèi)未使用抗生素，1周內(nèi)未使用陰道用藥，2周內(nèi)未使用糖皮質(zhì)激素外用制劑，3d內(nèi)未使用過抗組胺藥物，1周內(nèi)未使用免疫調(diào)節(jié)劑［8］。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者均簽署知情同意書。

1.2 白念珠菌斑貼變應(yīng)原制備

1.2.1 白念珠菌培養(yǎng)及滅活 將已分離純化的白念珠菌標(biāo)準(zhǔn)菌株CMCC(F)C1a(由中國醫(yī)學(xué)真菌保藏中心提供)接種到含1%蛋白胨，0.1%葡萄糖的液體培養(yǎng)基中27℃水浴振蕩培養(yǎng)3 d。白念珠菌懸液經(jīng)以離心半徑13.5 cm，2000 r/min離心沉淀收集底層白念珠菌細胞，然后將收集到的白念珠菌細胞在PBS液中沖洗3次。將沖洗過的白念珠菌細胞放入高壓鍋121℃，15 min高壓蒸汽滅活［9］。

1.2.2 白念珠菌變應(yīng)原制備 滅活白念珠菌接種到沙堡氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)3 d，觀察有無菌落生長。滅活后白念珠菌懸液以離心半徑13.5 cm，2000 r/min離心沉淀收集底層細胞，放在烘箱內(nèi)烘干。稱取滅活細胞干重，加入凝膠中分別制成0.4%、1%、4%、20%菌懸液放于4℃冰箱中保存。對照組為不加白念珠菌細胞的凝膠劑［10］。白念珠菌點刺液由德國默克公司提供;陰性對照液為等滲鹽水，陽性對照液為0.1%組胺。

1.3 方法

1.3.1 念珠菌鏡檢及培養(yǎng) 外陰消毒后將無菌等滲鹽水浸濕的2根棉拭子置于陰道后穹隆處，留置30s，并盡可能多地取出陰道分泌物。一份標(biāo)本用等滲鹽水濕片法直接鏡檢，發(fā)現(xiàn)假菌絲及芽生孢子診斷為陽性;另一份標(biāo)本，接種到含氯霉素的沙堡氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基27℃培養(yǎng)3 d，并分離純化所得菌株，將純化菌株接種到CHROMagear培養(yǎng)基(由上?？片敿挝⑸锛夹g(shù)有限公司提供)進行菌種鑒定。27℃培養(yǎng)2 d的CHROMagear培養(yǎng)基上分離的顯色菌落:綠色至翠綠色菌落為白念珠菌;藍灰色菌落為熱帶念珠菌;紫色凸起、表面光滑濕潤菌落為光滑念珠菌;粉紅色至紫色、扁平、較大、表面粗糙、邊緣模糊有微毛菌落為克柔念珠菌;白色至淡粉色菌落為其他念珠菌。

1.3.2 白念珠菌斑貼試驗 選擇受試者背部皮膚，用等滲鹽水清潔，將擠滿4種不同濃度念珠菌變應(yīng)原及凝膠空白對照的斑貼試紙貼于受試者背部，試劑用量均以擠滿測試紙的小格子為標(biāo)準(zhǔn)(斑試器由南京艾羅高生物工程有限公司提供)。貼敷后48 h除去受試物，72 h進行結(jié)果判讀，參考ICDRG標(biāo)準(zhǔn)記錄［8］。最后根據(jù)本研究實際觀察結(jié)果進行2級統(tǒng)計報告:局部無紅斑或僅有輕度紅斑反應(yīng)者為陰性;局部出現(xiàn)紅斑、水腫性紅斑并丘疹者為陽性。

1.3.3 白念珠菌SPT 選擇患者前臂屈側(cè)皮膚，等滲鹽水清潔，先滴組胺陽性對照液和等滲鹽水陰性對照液，后滴白念珠菌變應(yīng)原，兩點距離不少于2 cm，用點刺針垂直通過滴在皮膚上的滲液，輕快的刺入皮膚，使針尖下面有少量試液進入皮膚，15～20 min后觀察并記錄皮膚反應(yīng)。陽性結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn):以變應(yīng)原與組胺所致風(fēng)團面積比確定級別，比值＞1/4為(+);比值≥1/2為(2+);陽性對照范圍相等為(3+);＞2倍陽性對照范圍者為(4+)。陰性:無反應(yīng)或與等滲鹽水反應(yīng)相同。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。兩組間率的比較采用χ2檢驗，必要時采用Fisher確切概率檢驗，行x列表數(shù)據(jù)樣本率之間的兩兩比較采用χ2檢驗，采用Bonferroni法進行校正檢驗。以P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 白念珠菌斑貼試驗結(jié)果 每位患者至少1種濃度白念珠菌斑貼陽性記為陽性反應(yīng)。3組之間斑貼陽性率總體比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=9.542，P=0.008)，其中VVC組與VVC病史組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=0.120，P=0.728);VVC 組及 VVC病史組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2=8.681，P=0.003;χ2=6.268，P=0.012)。見表 1?；颊邔Σ煌瑵舛劝啄钪榫哔N試劑陽性反應(yīng)結(jié)果見表2。VVC組和VVC病史組中共有10例患者對低濃度(0.4%和1%)白念珠菌反應(yīng)較高濃度白念珠菌更加明顯，見圖1。

表1 各組患者斑貼結(jié)果［n(%)］Table 1 Patch test results of the patients n(%)

表2 不同濃度白念珠菌斑貼陽性結(jié)果［n(%)］Table 2 Reactions to 4 different concentrations of C.albicans n(%)

圖1 1例患者白念珠菌斑貼實驗第3天結(jié)果Figure 1 Response to different concentrations of C.albicans allergens in one case(Day 3)

2.2 白念珠菌SPT結(jié)果 所有患者白念珠菌SPT均為陰性。

2.3 念珠菌培養(yǎng)結(jié)果 33例VVC患者中白念珠菌24 例(72.7%);非白念珠菌 9 例(27.3%)，其中光滑念珠菌6例，熱帶念珠菌3例，見圖2。斑貼試驗結(jié)果為白念珠菌(陽性例數(shù)14例，陽性率58.3%)與非白念珠菌(陽性例數(shù)5例，陽性率55.6%)的患者斑貼陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=1.000)。

圖2 VVC患者白念珠菌在CHROMagear顯色培養(yǎng)基的結(jié)果Figure 2 Results of CHROMagear Candida in patients with VVC

3 討 論

本研究通過在受試者背部進行白念珠菌斑貼試驗來研究白念珠菌超敏與外陰瘙癢之間的關(guān)系，盡管背部皮膚與外陰皮膚的結(jié)構(gòu)不完全相同，但朗格漢斯細胞密度在皮膚與外陰黏膜部位非常接近［11］。朗格漢斯細胞通過傳遞穿過組織的抗原給淋巴結(jié)內(nèi)T細胞，誘導(dǎo)超敏反應(yīng)，并且外陰免疫細胞群不受激素水平影響，在整個月經(jīng)周期是穩(wěn)定的［12-13］。許多關(guān)于外陰瘙癢的病因?qū)W研究均會采用斑貼試驗的方法，并且得到的結(jié)果多具有臨床相關(guān)性［14-15］。

本研究結(jié)果提示除了感染因素、分泌物刺激、念珠菌產(chǎn)生的毒力因子直接毒性作用外，念珠菌引起外陰陰道的IV型超敏反應(yīng)也是引起外陰瘙癢的重要原因。雖然白念珠菌蛋白為大分子物質(zhì)，但本研究所用的白念珠菌抗原混合物中可能存在一些小的肽類物質(zhì)可以滲透皮膚，或者大的肽類分子在皮膚表面自發(fā)降解或在一些活性酶的作用下降解為小分子物質(zhì)。念珠菌細胞壁中含有能誘導(dǎo)宿主免疫應(yīng)答的成分:主要是細胞壁中的蛋白質(zhì)、甘露聚糖、甘露糖蛋白(甘露糖與蛋白質(zhì)形成的共價糖蛋白)及葡聚糖［16-17］。Mencacci等［12］曾研究發(fā)現(xiàn)一種甘露糖蛋白片段(MP-F2)可在小鼠身上誘導(dǎo)IV型超敏反應(yīng)，并可影響小鼠Th1和Th2免疫應(yīng)答的平衡，在念珠菌特異性DTH中發(fā)揮重要作用。Marquis等［13］用熱殺死的白念珠菌誘導(dǎo)小鼠DTH，并分別在白念珠菌懸液中分離出相對分子質(zhì)量為43 000的蛋白質(zhì)及相對分子質(zhì)量為21 000、27 000和38 000的糖蛋白，并且這種白念珠菌懸液成功誘導(dǎo)了小鼠強烈的DTH。

本組中某些患者低濃度白念珠菌斑貼反應(yīng)較高濃度白念珠菌明顯，可能高濃度白念珠菌作為一種致病微生物可激活人體Toll樣受體2信號途徑，導(dǎo)致機體對白念珠菌的局部免疫抑制［18］。陰道分泌物培養(yǎng)結(jié)果為白念珠菌與非白念珠菌的感染者之間斑貼陽性率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，分析原因可能是白念珠菌與非白念珠菌之間具有相同的抗原決定簇刺激產(chǎn)生DTH，或不同種念珠菌之間存在交叉過敏反應(yīng)。

本研究中所有患者白念珠菌SPT均陰性。我們對以外陰瘙癢為主訴的VVC患者進行白念珠菌SPT未發(fā)現(xiàn)1例陽性反應(yīng)，分析原因可能是我們使用的商品化的白念珠菌抗原中不包含所有的白念珠菌抗原決定簇。白念珠菌含有許多能引起機體免疫應(yīng)答的抗原決定簇［16-17］，此外在皮膚黏膜表面的各種酶的作用下白念珠菌蛋白可分解暴露其他的抗原決定簇，但這些抗原決定簇不存在于商品化的白念珠菌抗原中。此外，Weissenbacher等［19］提出這種陰道分泌物TH2細胞因子水平升高及念珠菌特異性IgE Ab的出現(xiàn)提示這是一種發(fā)生于陰道局部的超敏反應(yīng)，這也可能是我們在試驗對象前臂進行白念珠菌SPT結(jié)果為陰性的原因。

確定引起白念珠菌斑貼陽性反應(yīng)的抗原決定簇及斑貼試驗最適白念珠菌濃度，進行斑貼試驗時最大限度地模擬外陰微環(huán)境均是我們需要進一步研究和探討的問題。本研究發(fā)現(xiàn)用自制的白念珠菌過敏原能引起外陰瘙癢患者陽性斑貼反應(yīng)，并且陽性率明顯高于對照組。由此我們得出結(jié)論對于念珠菌的超敏與外陰瘙癢關(guān)系密切，這也為VVC患者外陰瘙癢的治療提供新的思路。

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