溫順航 林 立 李昌崇 蘇小燕 張慧玲 吳滬軍

(溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院呼吸科，溫州 325000)

金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，SA)是肺炎的常見(jiàn)病原菌之一，常引起肺膿腫、胸腔積液等嚴(yán)重炎癥反應(yīng)并發(fā)癥，但其具體機(jī)制尚不清楚。Toll樣受體2(Toll-like receptor 2，TLR2)是識(shí)別SA病原相關(guān)分子模式(Pathogen-associated molecular patterns，PAMP)的最重要模式識(shí)別受體(Pattern recognition receptor，PRR)，調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、趨化因子的產(chǎn)生和炎癥細(xì)胞招募及激活等炎癥反應(yīng)［1］。已有報(bào)道［2］，在敗血癥模型中抗TLR2抗體可以阻斷TLR2介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，但其在小鼠SA肺炎炎癥反應(yīng)方面的研究未見(jiàn)報(bào)道。本研究采用抗TLR2抗體阻斷TLR2介導(dǎo)的炎性通路，觀察其對(duì)小鼠SA肺炎炎癥反應(yīng)的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及材料 60只SPF級(jí)5～7周C57BL/6J小鼠購(gòu)自上海史萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，體重16～20 g，隨機(jī)分為:對(duì)照組、SA肺炎組和抗TLR2抗體組，再根據(jù)觀察時(shí)間不同，各分為3 d和8 d亞組，共6小組，每組10只?？筎LR2抗體(T2.5，ab16894)及免疫組化TLR2一抗(ab24194)購(gòu)自英國(guó)abcom公司;角質(zhì)細(xì)胞源細(xì)胞因子(KC)、IL-10 ELISA試劑盒為PeproTech公司生產(chǎn);TSA培養(yǎng)基、腦心浸液肉湯和無(wú)內(nèi)毒素的PBS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。

1.2 細(xì)菌及菌液制備 SA(ATCC25923)菌株來(lái)源于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬育英兒童醫(yī)院檢驗(yàn)科，本實(shí)驗(yàn)室保存。SA劃線(xiàn)接種到TSA平板，并在37℃條件下培養(yǎng)過(guò)夜，挑取菌落接種到腦心浸液肉湯，37℃培養(yǎng)6 h以達(dá)到細(xì)菌生長(zhǎng)曲線(xiàn)對(duì)數(shù)期。離心機(jī)3 500 r/min離心細(xì)菌菌液15 min，棄上清，無(wú)內(nèi)毒素的PBS洗滌SA兩次并重懸，用麥?zhǔn)媳葷醿x測(cè)定SA菌液濃度，調(diào)整濃度至1×1010CFU/ml，倍比稀釋后，取3個(gè)連續(xù)梯度稀釋菌液10 μl劃至TSA平板，37℃培養(yǎng)24 h后，確定菌液活菌濃度。

1.3 小鼠肺炎模型［3］小鼠滴鼻接種前1 d，抗TLR2抗體組小鼠尾靜脈注射抗TLR2抗體(2 μg/只，用無(wú)菌生理鹽水稀釋至100 μl)［4］，正常組和SA肺炎組尾靜脈注射無(wú)菌生理鹽水100 μl。滴鼻接種當(dāng)天4%水合氯醛麻醉小鼠，將SA菌液50 μl(約含5×108CFU)，接種于SA肺炎組及抗TLR2抗體組小鼠鼻尖處，而對(duì)照組為無(wú)菌PBS 50 μl滴鼻，鼠本能性吸入，保持小鼠直立放置1 min，以利于細(xì)菌遷移到肺泡。

1.4 血清獲取及處理 水合氯醛快速麻醉小鼠，摘除右側(cè)眼球，采血0.8～1 ml，離心，取上清置－70℃凍存待測(cè)。

1.5 支氣管肺泡灌洗液(Bronchoalveolar lavage fluid，BALF)獲取及處理 取血后，鋪巾，頸部及胸部備皮，消毒，無(wú)菌條件行頸部手術(shù)分離氣管進(jìn)行插管，以1 ml無(wú)菌PBS分3次灌洗，其回收率可達(dá)到60%～80%。搖勻回收的BALF，取100 μl BALF倍比稀釋后，分別涂布于3塊TSA平板，至37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，計(jì)菌落數(shù)，并革蘭染色及生化鑒定。剩余BALF離心，取上清置－70℃凍存待測(cè)。100 μl生理鹽水重懸管底細(xì)胞后，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)白細(xì)胞。再次離心沉渣瑞氏染色進(jìn)行細(xì)胞分類(lèi)。

1.6 組織病理學(xué)觀察［5］實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，麻醉后處死小鼠，取左肺于4%多聚甲醛溶液充分固定，常規(guī)脫水、透明、包埋，制作4 μm連續(xù)切片，蘇木精-伊紅(HE)染色后于顯微鏡下觀察并評(píng)分。肺炎嚴(yán)重程度評(píng)分:0=無(wú);1=輕度;2=中度;3=重度;4=極重度，肺炎范圍評(píng)分:0=無(wú);1=小范圍;2=較大范圍;3=廣泛，將嚴(yán)重程度評(píng)分與范圍評(píng)分相加來(lái)評(píng)價(jià)肺炎病理程度。

1.7 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA) 取出凍存的BALF、血清，采用ELISA雙抗體夾心法，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)回歸方程后，將樣品光密度值帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得出KC、IL-10的含量(pg/ml)。

1.8 免疫組化 采用二步法，一抗為兔抗小鼠TLR2多克隆抗體(ab24192)，稀釋濃度為1∶1 000，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料，如正態(tài)分布，以表示，兩組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn);多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間兩兩比較，方差齊性應(yīng)用LSD-t法，方差不齊采用Games-Howell法;非正態(tài)資料，采用秩和檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為有顯著性差異。

2 結(jié)果

2.1 生存率及體重 正常對(duì)照組小鼠均存活，SA肺炎組和抗TLR2抗體組間生存率比較無(wú)顯著差異(同為P=1.0，圖1A)。體重比為小鼠滴鼻接種造模后每天體重與造模當(dāng)天(即第0天)體重比值，SA肺炎組和抗TLR2抗體組(3 d或8 d亞組)小鼠滴鼻接種后體重較正常組低(各天P＜0.05);比較SA肺炎組與抗TLR2抗體組小鼠間體重比，各天均無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)圖1B。

2.2 BALF載菌量 小鼠BALF分離培養(yǎng)，觀察菌落特點(diǎn)，并做革蘭染色和生化鑒定，分離出非金黃色葡萄球菌，疑為操作污染，不列入統(tǒng)計(jì)范圍。正常組、SA肺炎組及抗TLR2抗體組，第3天n分別為7、6、6，第 8 天 n 分別為 8、7、7。正常組小鼠未分離到SA，比較SA肺炎組與抗TLR2抗體組小鼠BALF載菌量，在感染后第3天，抗TLR2抗體組較SA肺炎組增高(P＜0.05，圖2A);在感染后第8天，3組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞比值 第3天，SA肺炎組小鼠BALF中白細(xì)胞計(jì)數(shù)較正常組高(P＜0.01)，抗 TLR2抗體組較正常組高(P＜0.01)，但較SA肺炎組低(P＜0.05，圖2B)。感染后第8天，抗TLR2抗體組分別和正常組、SA肺炎組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(分別P=0.281和P=0.191，圖2B)。中性粒細(xì)胞比值，在感染后第3天，SA肺炎組(53.14±8.57)、抗 TLR2 抗體組(38.13±9.17)與正常組(12.50±3.66)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，抗TLR2抗體組較SA肺炎組低(P＜0.01)，感染后第8天，BALF中性粒細(xì)胞百分值SA肺炎組(20.57±4.50)較正常組(13.80±3.52)高(P＜0.05)，見(jiàn)圖2C。

2.4 BALF中KC、IL-10水平 SA感染后第3天，SA肺炎組和抗TLR2抗體組小鼠BALF中KC濃度較正常組表達(dá)明顯升高(P＜0.01和P＜0.05)，但抗TLR2抗體組明顯低于SA感染組(P＜0.01)。SA肺炎組小鼠和抗TLR2抗體組小鼠BALF中IL-10濃度較正常組表達(dá)升高(P＜0.01和P＜0.01)，但SA肺炎組小鼠和抗TLR2抗體組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.389)。在SA感染后第8天，3組間 KC和IL-10在BALF中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表1。

2.5 血清中KC、IL-10水平 SA肺炎組和抗TLR2抗體組小鼠血清中KC濃度較正常組表達(dá)明顯升高(P＜0.01和P＜0.01)，抗TLR2抗體組低于SA感染組(P＜0.05)。SA肺炎組和抗TLR2抗體組小鼠血清中IL-10濃度較正常組表達(dá)升高(P＜0.01和P＜0.01)，但SA肺炎組小鼠血清中IL-10和抗TLR2抗體組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.479)。在SA感染后第8天，3組間KC和IL-10在BALF及血清中均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，見(jiàn)表2。

2.6 組織病理學(xué) 正常組小鼠氣管、肺泡腔內(nèi)無(wú)炎性分泌物及出血，肺泡結(jié)構(gòu)完整(圖3A);在第3天，SA肺炎組小鼠肺部可見(jiàn)支氣管管腔充滿(mǎn)炎性滲出物，肺泡正常結(jié)構(gòu)消失，肺泡腔可見(jiàn)以嗜中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)(圖3B);抗TLR2抗體組小鼠支氣管管腔、肺泡腔可見(jiàn)出血及少量炎性細(xì)胞，肺泡壁充血增厚(圖3D、E)。SA肺炎組和抗TLR2抗體組小鼠第8天仍存在炎性病理改變(分別為圖3C、F)，但明顯輕于第3天炎性改變。肺炎的病理評(píng)分為嚴(yán)重度評(píng)分+擴(kuò)散范圍評(píng)分，在滴鼻接種后第3天和第8天，抗TLR2抗體組小鼠HE病理評(píng)分均低于SA肺炎組小鼠，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.019和P=0.025)。

2.7 免疫組化 免疫組化染色示正常組小鼠TLR2陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞主要是氣管、支氣管上皮細(xì)胞(圖4A)，感染后第3天，SA肺炎組可見(jiàn)TLR2陽(yáng)性表達(dá)的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等炎癥細(xì)胞出現(xiàn)在肺泡腔、支氣管腔以及肺間質(zhì)，氣管、支氣管上皮細(xì)胞TLR2陽(yáng)性表達(dá)(圖4B);抗TLR2抗體組可見(jiàn)肺間質(zhì)少量陽(yáng)性炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，氣管、支氣管上皮陽(yáng)性表達(dá)TLR2(圖4C)。感染后第8天，SA肺炎組肺泡腔、支氣管腔以及肺間質(zhì)仍有TLR2陽(yáng)性細(xì)胞(圖4D);抗TLR2抗體組肺泡腔、支氣管腔以及肺間質(zhì)有少量TLR2陽(yáng)性細(xì)胞(圖4E)。

表1 抗TLR2抗體對(duì)SA肺炎小鼠BALF中KC、IL-10水平的影響Tab.1 Effects of anti-TLR2 antibody on expression KC and IL-10 of BALF in SA pneumonia mice

表2 抗TLR2抗體對(duì)SA肺炎小鼠血清中KC、IL-10水平的影響Tab.2 Effects of anti-TLR2 antibody on expression KC and IL-10 of serum in SA pneumonia mice

圖1 抗TLR2抗體對(duì)SA肺炎小鼠生存率及體重比的影響Fig.1 Effects of anti-TLR2 antibody on survival rate and weight ratio in SA pneumonia mice

圖2 抗TLR2抗體對(duì)SA肺炎小鼠肺泡灌洗液CFU計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞百分值的影響Fig.2 Effects of anti-TLR2 antibody on bronchoalveolar lavage fluid CFU count，leukocytes count and neutrophil percentage in SA pneumonia mice

圖3 抗TLR2抗體對(duì)SA肺炎小鼠肺組織炎癥反應(yīng)及病理評(píng)分的影響(HE染色)Fig.3 Effects of anti-TLR2 antibody on pulmonary inflammation response and pathological scores in SA pneumonia mice(HE staining)

圖4 各組小鼠肺組織TLR2免疫組化染色結(jié)果Fig.4 Expression of TLR2 in pulmonary of SA pneumonia mice，analyzed by immunohistochemical staining

3 討論

SA能產(chǎn)生多種胞壁成分、毒素及侵襲性酶，包括肽聚糖、脂蛋白、溶血素、凝固酶等，肺部感染時(shí)常引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，可致肺組織損傷，甚至出現(xiàn)肺膿腫及膿胸［6］。急性炎性反應(yīng)表現(xiàn)為血管內(nèi)白細(xì)胞透過(guò)血管壁進(jìn)入感染部位以消滅病原體，同時(shí)釋放大量炎癥因子，過(guò)強(qiáng)炎性反應(yīng)可造成周?chē)M織損傷［7］。中性粒細(xì)胞是抵抗化膿性細(xì)菌入侵的重要免疫細(xì)胞，分泌彈性蛋白酶和活性氧是組織炎性損傷的重要因素［8］。因此，適當(dāng)減少中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，可減輕炎癥反應(yīng)損傷，加快機(jī)體恢復(fù)。TLR2和TLR1或TLR6形成異二聚體，可識(shí)別SA的重要抗原成分脂磷壁酸和脂蛋白，激活下游的NF-κB和MAPK信號(hào)通路，啟動(dòng)炎癥反應(yīng)［9］。TLR2主要表達(dá)于單核吞噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及上皮細(xì)胞等。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)免疫組化證實(shí):TLR2在中性粒細(xì)胞、氣管及支氣管上皮細(xì)胞高表達(dá)。Zivkovic等［5］通過(guò)滴鼻接種SA外毒素，發(fā)現(xiàn)野生型C57BL/6小鼠肺部有中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞因子如 IL-1β、TNF-α及 KC等升高，而TLR2基因敲除小鼠(TLR2-/-)無(wú)上述炎癥反應(yīng)表現(xiàn)，說(shuō)明TLR2可能在介導(dǎo)SA炎癥反應(yīng)方面起著重要作用。SA結(jié)構(gòu)成分激活氣管、支氣管上皮細(xì)胞TLR2信號(hào)通路，招募中性粒細(xì)胞涌入肺組織，并激活中性粒細(xì)胞上的TLR2信號(hào)通路，啟動(dòng)炎癥因子的級(jí)聯(lián)效應(yīng)及炎性風(fēng)暴。

抗體作為藥物具有特異性強(qiáng)、持續(xù)性久和療效顯著等特點(diǎn)，在抗腫瘤、器官移植、自身免疫性疾病及感染性疾病治療中發(fā)揮重要作用［10，11］，具有廣闊應(yīng)用前景。本研究采用抗TLR2抗體結(jié)合呼吸道上皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等細(xì)胞膜上的TLR2，阻止其與SA的多種PAMP結(jié)合，從而抑制炎癥反應(yīng)和減輕炎性損傷。本實(shí)驗(yàn)觀察到，在滴鼻接種3 d后，抗TLR2抗體組小鼠較SA肺炎組BALF及血清中的炎性因子KC明顯降低，但對(duì)抑制性炎性因子IL-10表達(dá)無(wú)顯著影響，同時(shí)肺部HE病理評(píng)分明顯降低，但死亡率無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示抗TLR2抗體不能降低SA肺炎小鼠死亡率，但可明顯減輕肺部的炎性反應(yīng)。Meng等報(bào)道［2］，抗TLR2抗體能阻止配體與細(xì)胞TLR2結(jié)合，腹腔注射抗TLR2抗體能提高枯草桿菌敗血癥小鼠生存率并抑制TNF-α、KC及IL-6等炎性反應(yīng)。有研究報(bào)道，抗TLR2抗體能阻斷博來(lái)霉素導(dǎo)致的肺部炎癥反應(yīng)及纖維化，也說(shuō)明其在抑制肺部炎癥反應(yīng)方面有著重要作用［12］。

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在滴鼻接種3 d后，抗TLR2抗體組小鼠較SA肺炎組BALF載菌量高，存活率及體重恢復(fù)情況無(wú)明顯差異，可能與肺部招募免疫細(xì)胞較少、SA清除減慢有關(guān)，HE病理改變以肺間隔水腫、出血，支氣管腔出血為主要表現(xiàn)，考慮與SA分泌溶血素、苯酚可溶解的調(diào)控蛋白(Phenol-soluble modulins，PSMs)及葡萄球菌蛋白 A等有關(guān)。Robertson等［13］報(bào)道:抗中性粒細(xì)胞單克隆抗體耗盡小鼠中性粒細(xì)胞，在SA肺部感染后，小鼠SA清除能力和生存率明顯降低，說(shuō)明中性粒細(xì)胞在SA肺部清除中起著重要作用。α-溶血素和PSMs是SA重要致病毒素，具有細(xì)胞毒性及溶血活性，攻擊肺組織上皮、血管壁細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等，可致肺部水腫及出血［3，14］。在滴鼻接種 8 d后，抗 TLR2 抗體組和 SA肺炎組小鼠BALF載菌量與正常對(duì)照組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示肺炎小鼠肺部細(xì)菌基本被清除?？筎LR2抗體組和SA肺炎組小鼠BALF白細(xì)胞計(jì)數(shù)及中性粒細(xì)胞比值、血清細(xì)胞因子KC及IL-10與正常對(duì)照組比較，均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，抗TLR2抗體組小鼠HE病理評(píng)分低于SA肺炎組小鼠，但兩組均高于正常組，提示肺炎小鼠肺部炎癥較前好轉(zhuǎn)，抗TLR2抗體組肺部炎癥病理改變較 SA肺炎組輕，可能與TLR2信號(hào)通路受阻斷后，肺部炎癥浸潤(rùn)減少有關(guān)。

綜上所述，抗TLR2抗體可阻止SA與TLR2結(jié)合，抑制小鼠SA肺炎炎癥介質(zhì)釋放，減少炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，減輕肺部炎癥反應(yīng)。本研究為抗TLR2抗體在抑制SA肺炎炎癥反應(yīng)方面的作用提供理論依據(jù)。

［1］Fournier B.The function of TLR2 during staphylococcal diseases［J］.FrontCellInfectMicrobiol，2012，doi:10.3389/fcimb.2012.00167.eCollection 2012.

［2］Meng G，Rutz M，Schiemann M，et al.Antagonistic antibody prevents toll-like receptor 2-driven lethal shock-like syndromes［J］.J Clin Invest，2004，113(10):1473-1481.

［3］Bubeck Wardenburg J，Patel RJ，Schneewind O.Surface proteins and exotoxins are required for the pathogenesis of staphylococcus aureus pneumonia［J］.Infect Immun，2007，75(2):1040-1044.

［4］Yang HZ，Cui B，Liu HZ，et al.Targeting TLR2 attenuates pulmonary inflammation and fibrosis by reversion of suppressive immune microenvironment［J］.J Immunol，2009，182(1):692-702.

［5］Zivkovic A，Sharif O，Stich K，et al.TLR2 and CD14 mediate innate immunity and lung inflammation to staphylococcal Panton-Valentine leukocidin in vivo［J］.J Immunol，2011，186(3):1608-1617.

［6］Carrillo-Marquez MA，Hulten KG，Hammerman W，et al.Staphylo coccus aureus pneumonia in children in the era of communityacquired methicillin-resistance at Texas Children＇s Hospital［J］.Pediatr Infect Dis J，2011，30(7):545-550.

［7］Si-Tahar M，Touqui L，Chignard M.Innate immunity and inflammation--two facets of the same anti-infectious reaction［J］.Clin Exp Immunol，2009，156(2):194-198.

［8］Smith JA.Neutrophils，host defense，and inflammation:A doubleedged sword［J］.J Leukoc Biol，1994，56(6):672-686.

［9］Pietrocola G，Arciola CR，Rindi S，et al.Toll-like receptors(TL Rs)in innate immune defense against Staphylococcus aureus［J］.Int J Artif Organs，2011，34(9):799-810.

［10］Adler MJ，Dimitrov DS.Therapeutic antibodies against cancer［J］.Hematol Oncol Clin North Am，2012，26(3):447-481.

［11］Wesolowski J，Alzogaray V，Reyelt J，et al.Single domain antibod ies:Promising experimental and therapeutic tools in infection and immunity［J］.Med Microbiol Immunol，2009，198(3):157-174.

［12］Yang HZ，Cui B，Liu HZ，et al.Targeting TLR2 attenuates pulmonary inflammation and fibrosis by reversion of suppressive immune microenvironment［J］.J Immunol，2009，182(1):692-702.

［13］Robertson CM，Perrone EE，McConnell KW，et al.Neutrophil depletion causes a fatal defect in murine pulmonary Staphylococcus aureus clearance［J］.J Surg Res，2008，150(2):278-285.

［14］Hongo I，Baba T，Oishi K，et al.Phenol-soluble modulin alpha 3 enhances the human neutrophil lysis mediated by Panton-Valentine leukocidin［J］.J Infect Dis，2009，200(5):715-723.