易達(dá)委 孫 斌 劉曉霓 陳德喜 王延軍

(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院，北京市肝病研究所，北京 100069)

肝細(xì)胞癌(HCC)是全球最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，我國(guó)每年約11萬(wàn)人死于肝癌，占全世界肝癌死亡人數(shù)的45%。免疫治療因其靶向性好，副作用少而廣受關(guān)注，而鑒定一個(gè)有效的分子靶點(diǎn)則是腫瘤免疫治療的關(guān)鍵。在此，我們將討論磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC3)的結(jié)構(gòu)、功能和生物學(xué)特點(diǎn)，并將其作為癌癥免疫療法中藥物作用靶點(diǎn)的潛能為討論重點(diǎn)，研究其在人類(lèi)癌癥治療中的作用。

GPC3是一種在HCC以及黑色素瘤等多種癌癥中高度表達(dá)的膜蛋白，其基因編碼的70 kD核心蛋白被前蛋白轉(zhuǎn)換酶Furin酶切后，產(chǎn)生40 kD的氨基端亞單位和30 kD具有兩條硫酸乙酰肝素(HS)鏈的羧基端亞單位。GPC3蛋白通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨定蛋白(GPI)錨定在細(xì)胞膜上(如圖1所示)。羧基末端的膜結(jié)合蛋白可以被單克隆抗體(mAb)1G12識(shí)別。GPC3與Wnt及Hedgehog(HH)信號(hào)蛋白相關(guān)［1］。GPC3可以與Wnt信號(hào)分子形成一個(gè)復(fù)合體，并通過(guò)刺激Wnt信號(hào)促進(jìn)肝癌生長(zhǎng)。GPC3的突變將導(dǎo)致GPI錨定域的缺失，阻斷Wnt信號(hào)通路，從而抑制依賴(lài)于Wnt信號(hào)的腫瘤生長(zhǎng)。在人HEK-293細(xì)胞中制造出缺少 GPI錨定域的重組sGPC3蛋白，發(fā)現(xiàn)其能夠抑制HCC的生長(zhǎng)［2］，但不能排除是由于其他因素造成。實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)，GPC3可通過(guò)與HH信號(hào)通路的相互作用，調(diào)節(jié)生長(zhǎng)發(fā)育［1，3］。此外，GPC3 的 HS 鏈可以與 FGF-2 成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2(FGF-2)相互作用，并調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子的活性，在肝癌細(xì)胞中也發(fā)現(xiàn)了GPC3與FGF-2的相互作用現(xiàn)象［4］。

1 GPC3在人類(lèi)惡性腫瘤中的表達(dá)

HCC和CCA是原發(fā)性肝癌的兩種主要形式，越來(lái)越多的證據(jù)支持GPC3可作為肝細(xì)胞癌的一種新的腫瘤標(biāo)志物。GPC3在肝癌組織中高表達(dá)，而膽管細(xì)胞癌及正常的肝組織中則不表達(dá)。GPC3在HepG2和 Hep3B 細(xì)胞，HT17、HuH6、Huh7和 PLC/PRF/5等HCC細(xì)胞株中均高度表達(dá)。利用單克隆抗體1G12檢測(cè)或免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)［5，6］，可以在70%以上的肝細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)GPC3，其余非肝細(xì)胞癌病例均為陰性，包括膽管癌、肝轉(zhuǎn)移癌、肝細(xì)胞癌癌旁肝組織(包括肝硬化和血管瘤旁肝組織)。

圖1 磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)的結(jié)構(gòu)示意圖Fig.1 Schematic of the GPC3 protein.

由于發(fā)現(xiàn)GPC3陽(yáng)性患者的5年生存率較GPC3陰性患者低(54.5%vs 87.7%，P=0.031)，具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，證明GPC3的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的預(yù)后不良情況密切相關(guān)［7］。在肝移植的患者中，血管侵犯與GPC3的表達(dá)顯著相關(guān)，而沒(méi)有GPC3表達(dá)的患者無(wú)復(fù)發(fā)生存期顯著延長(zhǎng)(P＜0.05)，表明GPC3 mRNA的過(guò)度表達(dá)可能是肝移植術(shù)后的不良指標(biāo)。

GPC3也在黑色素瘤、卵巢透明細(xì)胞癌、卵黃囊瘤(YST)、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、肝母細(xì)胞瘤、腎母細(xì)胞瘤細(xì)胞、睪丸非精原細(xì)胞瘤、脂肪肉瘤以及胃癌的特殊群體GPC3-GC中，也具有較低程度的表達(dá)。然而，目前GPC3在除HCC以外的其他人類(lèi)腫瘤中診斷意義仍不明確。

2 GPC3與HCC診斷與預(yù)后檢測(cè)

GPC3在HCC組織中高度表達(dá)，且檢測(cè)陽(yáng)性的患者，其血液中也可以檢測(cè)到少量的GPC3［5］，因而血液中的GPC3含量將可能作為一種有效的診斷依據(jù)，并以此監(jiān)測(cè)這些患者的病情發(fā)展。Filmus及其同事開(kāi)發(fā)出了能與GPC3羧基端特異性結(jié)合的單克隆抗體1G12［5］。在泰國(guó)最近完成的一項(xiàng)研究中，利用單克隆抗體1G12檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)有53%HCC患者的血清中呈現(xiàn)明顯的GPC3陽(yáng)性，但在健康的血清提供者及肝炎患者的血清中則檢測(cè)不到［8］。此外，GPC3還是HCC患者根治性切除后，用于預(yù)測(cè)腫瘤復(fù)發(fā)和總生存期的一種潛在的、可靠的生物標(biāo)志物，高GPC3的表達(dá)是癌癥復(fù)發(fā)的危險(xiǎn)信號(hào)，而低表達(dá)的患者預(yù)后一般較好［9］。

AFP作為肝癌腫瘤標(biāo)志物，受其敏感性和特異性限制，單獨(dú)檢測(cè)難以區(qū)別不同肝癌。而GPC3在HCC組織中高度表達(dá)，且在AFP陰性患者中也有很高檢測(cè)率，其mRNA的陽(yáng)性表達(dá)率高達(dá)70%［8］。研究顯示，GPC3作為血清標(biāo)志物與AFP聯(lián)合檢測(cè)診斷肝癌，可以提高診斷的敏感性［10］。

區(qū)分肝細(xì)胞癌與膽管細(xì)胞癌，尤其是肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌(ICC)，是一個(gè)至關(guān)重要的問(wèn)題。GPC3在肝細(xì)胞癌中高度表達(dá)，而在肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌及膽囊癌中檢測(cè)不到［11］。因此，這些研究表明GPC3具有作為原發(fā)性肝癌，尤其是肝細(xì)胞癌的診斷潛力［8，12］。如圖2所示，大部分在肝細(xì)胞癌中表達(dá)的GPC3都表現(xiàn)出細(xì)胞質(zhì)分布。相關(guān)研究表明，幾乎一半的HCC病例表現(xiàn)出混合分布(細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜)，而另一半僅表現(xiàn)為細(xì)胞質(zhì)分布［7］。最近的一項(xiàng)研究利用HepG2的移植組織，完成了對(duì)GPC3免疫組化的組織處理方法的優(yōu)化［13］。進(jìn)一步的研究需要闡明是否不同分布的GPC3具有不同的功能意義和診斷價(jià)值。

3 以GPC3為靶點(diǎn)的免疫療法

考慮到在肝癌，黑色素瘤和卵巢透明細(xì)胞癌的高度表達(dá)，GPC3被認(rèn)為可作為潛在的靶點(diǎn)用于腫瘤免疫治療。其對(duì)于抗GPC3抗體以及細(xì)胞基礎(chǔ)的免疫療法的有效性已經(jīng)得到開(kāi)發(fā)和探索［14］。

3.1 HCC的抗GPC3抗體療法 抗GPC3抗體作為HCC免疫治療的潛能日漸得到重視，許多特異性結(jié)合GPC3的單克隆抗體也相繼被發(fā)現(xiàn)，包括1G12、M18D04、M19B11、A1836A 和 GPC3-C02 等。近年發(fā)現(xiàn)的人重鏈可變區(qū)抗體HN3與GPC3有較高親和力，且對(duì)GPC3陽(yáng)性細(xì)胞的增殖表現(xiàn)出明顯的抑制作用［15］。另一高親和力的單克隆抗體Yp7在裸鼠體內(nèi)對(duì)肝癌移植瘤表現(xiàn)出了明顯的生長(zhǎng)抑制作用［16］。這些抗體在GPC3陽(yáng)性HCC的免疫治療方面表現(xiàn)出顯著潛能。

第一個(gè)用于治療的抗GPC3單克隆抗體GC33(IgG2a，κ)，其抗原表位位于羧基末端［14，17］。這一抗體在皮下異位移植 HepG2 和HuH-7移植瘤的小鼠中，誘導(dǎo)產(chǎn)生了抗體依賴(lài)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性作用(ADCC)，并展現(xiàn)出抑制腫瘤生長(zhǎng)的作用。GC33誘導(dǎo)的ADCC抗腫瘤活性主要是由自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生［14］。GC33同樣能夠減少在肝內(nèi)原位移植HepG2細(xì)胞的小鼠血液中甲胎蛋白的含量。通過(guò)CDR移植法制造出的人源GC33(hGC33)與GC33一樣對(duì)HepG2的移植有作用［18］。另一方面，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)了GPC3的膜表達(dá)與腫瘤相關(guān)性巨噬細(xì)胞(TAM)相關(guān)［19，20］。在這些證據(jù)的基礎(chǔ)上，Takai等觀察到在使用GC33的抗GPC3免疫治療模型中，存在TAM侵入，表明巨噬細(xì)胞可能在GC33抗體的腫瘤活性中起到重要作用，而抗腫瘤活性可能通過(guò)調(diào)節(jié)GPC3功能，而不是ADCC機(jī)制發(fā)揮效應(yīng)。此外，GC33不能直接抑制GPC3陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞的增殖。曾有人提出，抗GPC3抗體可能會(huì)增加肝細(xì)胞癌對(duì)化療藥物的敏感性。最近hGC33與標(biāo)準(zhǔn)化療劑相結(jié)合的抗腫瘤活性已受重視。在HepG2的移植瘤模型中，hGC33和索拉非尼相結(jié)合時(shí)比單獨(dú)使用索拉非尼更能有效地抑制腫瘤的生長(zhǎng)。這種組合方案可能作為一種肝癌的治療方式，具有很高的臨床應(yīng)用價(jià)值。

圖2 GPC3在人原發(fā)性肝癌中的表達(dá)Fig.2 GPC3 expression in human primary liver cancer

基于這些結(jié)果，以HCC晚期治療為對(duì)象的Ⅰ期臨床試驗(yàn)已進(jìn)行評(píng)估。該研究表明，患者對(duì)GC33耐受性良好，且副作用與劑量相關(guān)，每周安全的靜脈給藥量為20 mg左右［22］。目前Ⅱ期臨床試驗(yàn)正在招募之中:www.clinicaltrials.gov/ct2/show/study/NCT01507168。

3.2 GPC3合成肽疫苗 在皮下異位移植腫瘤的小鼠身上，由于轉(zhuǎn)入了鼠GPC3基因的Colon26細(xì)胞系，其轉(zhuǎn)錄的GPC3肽段或GPC3特異性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)可通過(guò)樹(shù)突狀細(xì)胞引起小鼠的保護(hù)作用［23］。這項(xiàng)工作表明GPC3在小鼠中具有高度的免疫原性，可以誘導(dǎo)有效的抗腫瘤免疫反應(yīng)，并不產(chǎn)生自身免疫性疾病。但有數(shù)據(jù)顯示，CD8+T細(xì)胞定向性癌癥疫苗在HCC的治療中，療效有限(除非能夠鑒定出應(yīng)答產(chǎn)生的最佳共刺激信號(hào))，而CD4+T細(xì)胞定向性癌癥疫苗則值得開(kāi)發(fā)利用［24］。

在HLA-A2.1轉(zhuǎn)基因小鼠中，GPC3疫苗可以誘導(dǎo)產(chǎn)生肽反應(yīng)性的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(CTL)，并且不產(chǎn)生自身免疫反應(yīng)［25］。此外，接種這些CTL的NOD/SCID小鼠其肝癌移植瘤的生長(zhǎng)受到顯著抑制。在這些結(jié)果的基礎(chǔ)上進(jìn)行了Ⅰ期臨床試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)接種疫苗的耐受性良好，且在33例中有30例患者產(chǎn)生了可檢測(cè)的免疫應(yīng)答反應(yīng)，且免疫應(yīng)答的水平與總生存期之間有一定相關(guān)性［26］。目前正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)，并計(jì)劃將GPC3合成肽疫苗與化療相結(jié)合［26］。

3.3 GPC3功能阻斷 除上述的免疫治療方法外，還有相關(guān)研究試圖通過(guò)阻斷GPC3的功能來(lái)達(dá)到治療目的［27］。最近發(fā)現(xiàn)，突變型GPC3由于缺少GPI不能附著于細(xì)胞膜，以致被排出到細(xì)胞外液而減少膜上的Wnt信號(hào)，并減少其與G蛋白偶聯(lián)受體的結(jié)合。此外，還發(fā)現(xiàn)異位的突變型GPC3能夠抑制幾種肝癌細(xì)胞株在體內(nèi)外的生長(zhǎng)。除了抑制Wnt信號(hào)之外，在某些細(xì)胞株中由于GPC3的外排，導(dǎo)致其通過(guò)HS鏈結(jié)合的生長(zhǎng)因子也被從細(xì)胞膜上清除［27］。另一項(xiàng)研究表明，用重組蛋白處理HCC細(xì)胞能夠抑制突變型GPC3的功能和活性［2］。

4 結(jié)論

由于GPC3在肝細(xì)胞癌中的高度表達(dá)，目前其被認(rèn)為可作為HCC抗體和細(xì)胞療法的靶點(diǎn)。將來(lái)工作的方向可能是研制出新一代的GPC3單克隆抗體，這種單抗能夠靶向于包括HS鏈等在內(nèi)的多種功能域，與GPC3相結(jié)合;并在實(shí)驗(yàn)中檢驗(yàn)抗GPC3單克隆抗體能否通過(guò)阻斷Wnt信號(hào)和/或其他信號(hào)途徑中的配體與受體的相互作用，來(lái)直接抑制腫瘤生長(zhǎng)。此外，最新的研究表明，血清型GPC3可能具有腫瘤標(biāo)志物價(jià)值，能夠在腫瘤診斷和表達(dá)GPC3的惡性腫瘤患者的后續(xù)觀察中發(fā)揮作用。然而，血清GPC3的生化性質(zhì)仍然在研究之中。而對(duì)于GPC3的三維結(jié)構(gòu)和GPC3從癌細(xì)胞脫落的分子機(jī)制將很有研究?jī)r(jià)值。此外，免疫組化的研究表明，GPC3還具有腫瘤診斷的病理學(xué)價(jià)值。通過(guò)各種高危人群的大量病例，對(duì)GPC3本身或GPC3與其他腫瘤蛋白相組合的進(jìn)一步研究，能夠驗(yàn)證使用GPC3作為HCC以及其他表達(dá)GPC3腫瘤的診斷標(biāo)志物的重要價(jià)值。

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