李娜娜 王冬梅 杜東穎 秦運(yùn)杰 夏平安 楊明凡 崔保安
(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院獸醫(yī)微生物實驗室,鄭州 450002)
豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是二十世紀(jì)八十年代末發(fā)現(xiàn)的一種高度傳染性疾病,引起妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道疾?。?]。PRRSV屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬,單股正鏈RNA病毒,大小約15 kb,編碼9個開放閱讀框[2]。PRRSV有嚴(yán)格的組織嗜性,只感染血液中PAM(Pulmonary alveolar macrophages)細(xì)胞和單核細(xì)胞,能夠在宿主體內(nèi)自主復(fù)制[3-6]。在體外可感染非洲綠猴腎細(xì)胞系如Marc-145細(xì)胞、骨髓來源樹突狀細(xì)胞(Bone marrow-derived dendritic cells,BMDC)、單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞(Monocyte-derived macrophages,MDM)[7-9]。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用,能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子。許多研究資料表明,PRRSV感染宿主后抗病毒細(xì)胞因子水平下調(diào)[8,10]。豬感染 PRRSV后機(jī)體快速調(diào)動其體液免疫,但是早期亞中和抗體和非中和抗體通過ADE(Antibody-dependent enhancement)作用嚴(yán)重影響PRRS的發(fā)展,使病毒更容易通過IgG Fc受體(FcγR)介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用被單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞吸附和內(nèi)吞,從而進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)[11-15]。
IgG Fc受體屬于IgG基因超家族成員,是免疫應(yīng)答中重要的膜性調(diào)節(jié)分子,主要表達(dá)于NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等,主要是通過與配體結(jié)合來發(fā)揮某些重要的生物學(xué)效應(yīng),例如參與抗原的處理和遞呈,抗體依賴性細(xì)胞毒作用(Antibody dependent cytotoxicity ,ADCC),細(xì)胞因子的產(chǎn)生,免疫應(yīng)答反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等免疫識別與清除作用[16]。根據(jù)配體的特異性可分為 IgG受體(FcγR)、IgA 受體(FcaR)、IgE 受體(FcεR)、IgM 受體(FcμR)和 IgD 受體(FcδR)。目前鑒定的 FcγR有 FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、boFcγRⅡ和 moFcγRⅣ等五個亞類[17]。其中 FcγRⅢ(CD16)含有 2個 Ig樣胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域,為中低親和力受體,是唯一在NK細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體[18]。本實驗室成功地從豬PAM細(xì)胞克隆出FcγRⅢ(CD16)并制備其多克隆抗體[19],為本實驗奠定基礎(chǔ)。
本試驗通過研究FcγRⅢ的選擇性激活對在宿主細(xì)胞的抗病毒因子水平的影響,來研究在PRRSV感染過程中的FcγRⅢ介導(dǎo)的免疫反應(yīng)作用。
1.1 毒株、抗體與實驗動物 PRRSV Hn-1/06株(TCID50為10-4.6/0.1 ml)為本實驗室分離并保存;純化鼠抗豬 FcγRⅢ IgG(ELISA檢測抗體效價1∶12 800)由本實驗室制備并保存;PRRSV抗原、抗體均為陰性的20日齡健康大白仔豬,購自鄭州某豬場。
1.2 主要試劑 Reverse Transcriptase M-MLV、dNTPs、Ribonuclease Inhibitor、Trizol、SYBR Premix Ex Taq等購自TaKaRa公司;LPS購于Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基干粉購自Gibco公司;新生牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品。
1.3 試驗方法
1.3.1 PAM細(xì)胞的制備 按照徐紅運(yùn)等[20]的方法獲取PAM細(xì)胞,重懸于10%血清的RPMI1640中。調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個/ml,加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板,0.5 ml/孔,置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約6 h,棄去未貼壁的細(xì)胞,用 PBS液洗板一次,加入10%血清 RPMI1640營養(yǎng)液,置于37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)。
1.3.2 PRRSV感染PAM試驗 將含有200個TCID50的PRRSV 接種 PAM 細(xì)胞,感染12、24、36、48、60、72 h 后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液,用段二珍[21]建立的Real-time qPCR方法檢測感染不同時間段PAM細(xì)胞中PRRSV的拷貝數(shù)(絕對定量);用張宜娜[22]建立的Real-time qPCR方法檢測不同時間段PAM細(xì)胞中IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平(相對定量)。同時設(shè)對照細(xì)胞組。
1.3.3 LPS刺激PAM細(xì)胞試驗 將終濃度100 ng/ml LPS[23]接種 PAM 細(xì)胞,作用 12、24、36、48、60、72 h后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液,用張宜娜建立的Real-time qPCR方法分別檢測不同時間段PAM細(xì)胞中 IFN-α、TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。
1.3.4 FcγRⅢ對PAM細(xì)胞中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平影響試驗 將純化鼠抗豬FcγRⅢ IgG(550 μg/ml)接種到 PAM 細(xì)胞上,200 μl/孔,置 37℃、5%CO2條件下作用1 h,取出細(xì)胞培養(yǎng)板,棄去上清液。每孔加入 500 μl 10%血清 RPMI1640 營養(yǎng)液,12、24、36、48、60、72 h后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液,用張宜娜建立的Real-time qPCR方法檢測不同時間段PAM細(xì)胞中 IFN-α、TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。
1.3.5 FcγRⅢ的選擇性激活試驗 將純化鼠抗豬FcγRⅢ IgG(550 μg/ml)接種到 PAM 細(xì)胞上,200 μl/孔,置 37℃、5%CO2條件下作用 1 h,取出細(xì)胞培養(yǎng)板,棄去上清液。然后將含有200個TCID50的PRRSV接種處理的 PAM細(xì)胞上,感染 12、24、36、48、60、72 h 后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液,檢測方法同1.3.2。
1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法 每個檢測樣品做3個平行,絕對定量所得結(jié)果,即PRRSV拷貝數(shù),用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。相對定量所得結(jié)果用2-ΔCT法進(jìn)行比較,即ΔCT=CT目的基因-CT持家基因。以 β-actin為持家基因。用 GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。
2.1 PRRSV在PAM細(xì)胞中的增殖規(guī)律 如圖1所示PRRSV感染PAM細(xì)胞后,48 h PRRSV的拷貝數(shù)最高可達(dá)到1.34E+06,之后PRRSV的拷貝數(shù)下降。
2.2 PRRSV對PAM細(xì)胞中抗病毒細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響 應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測PRRV、LPS誘導(dǎo)PAM細(xì)胞和未處理對照組PAM細(xì)胞在 12、24、36、48、60、72 h 后 IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化,確定PRRSV引起宿主細(xì)胞的先天抗病毒反應(yīng)。如圖2顯示,LPS處理組IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對照組細(xì)胞相比均上調(diào)。接種病毒組IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在PRRSV感染PAM細(xì)胞12、24 h后與對照組細(xì)胞相比顯著上調(diào),分別上調(diào)1.46倍和1.35倍,感染36、48、60 h后 IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降,分別是其0.71倍、0.78倍、0.70倍、72 h后恢復(fù)對照組細(xì)胞水平。TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在 PRRSV 感染12、24、36、48、60、72 h后均高于對照組細(xì)胞,達(dá)1.15~2.49倍,在48 h后差異最大,達(dá)到2.49倍。
2.3 FcγRⅢ對PAM細(xì)胞中抗病毒細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響 為研究FcγRⅢ引起宿主細(xì)胞的先天抗病毒反應(yīng),用純化的鼠抗豬FcγRⅢIgG選擇性激活 PAM 細(xì)胞 FcγRⅢ受體,在 12、24、36、48、60、72 h后檢測IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。如圖3 顯示,選擇性激活豬 FcγRⅢ后 IFN-α、TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在 12、24、36、48、60、72 h 均顯著低于對照組細(xì)胞,與對照組細(xì)胞相比,IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平是其0.21~0.26倍,在24 h最低;TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平是其0.15~0.31倍,在36 h最低,這些數(shù)據(jù)表明選擇性激活FcγRⅢ能夠抑制宿主細(xì)胞的先天性免疫。
2.4 選擇性激活FcγRⅢ后PRRSV對PAM細(xì)胞中抗病毒細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響 鼠抗豬FcγRⅢIgG處理PAM細(xì)胞后接種PRRSV,在培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后收集細(xì)胞,利用已經(jīng)建立實時熒光定量PCR方法檢測不同時間段PAM細(xì)胞IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。如圖4所示FcγRⅢIgG選擇性激活PAM后感染PRRSV,與對照組PRRSV感染PAM細(xì)胞組相比,IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12~72 h期間顯著下降,是其0.09~0.52倍;TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12~72 h期間顯著下降,是其0.02~0.21倍。這些數(shù)據(jù)顯示豬FcγRⅢ介導(dǎo)PRRSV感染抑制宿主細(xì)胞抗病毒因子轉(zhuǎn)錄水平。
2.5 選擇性激活豬FcγRⅢ對PRRSV在PAM細(xì)胞中增殖的影響 為研究選擇性激活 FcγRⅢ對PRRSV增殖規(guī)律的影響,用純化鼠抗豬 FcγRⅢIgG 處理PAM細(xì)胞后接種PRRSV,在感染12、24、36、48、60、72 h后用已建立的Real-time qPCR方法檢測感染不同時間段PAM細(xì)胞中PRRSV的拷貝數(shù)。如圖5所示,選擇性激活 FcγRⅢ后 PAM細(xì)胞中的PRRSV的拷貝數(shù)與單純接毒的PAM細(xì)胞相比在12、24、36、48、60、72 h 顯著升高,高 3.74~ 148.93倍,72 h是最高,達(dá)到148.93倍。這些數(shù)據(jù)說明選擇性激活FcγRⅢ能夠增強(qiáng)PRRSV在PAM細(xì)胞中的復(fù)制水平。
圖1PAM細(xì)胞中PRRSV拷貝數(shù)Fig.1 Copies of viral replication in porcine PAM cells
圖2 PRRSV感染細(xì)胞、LPS處理細(xì)胞、健康細(xì)胞IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.2 IFN-α and TNF-α mRNA levels in PRRSV infected cells or LPS stimulated cells or mock normal cells
圖3 選擇性激活FcγRⅢ誘導(dǎo)PAM細(xì)胞IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.3 IFN-α and TNF-α mRNA levels in procine PAM cells pretreated with FcγRⅢ-specific IgG
圖4 選擇性激活FcγRⅢ處理PAM細(xì)胞后接種PRRSV誘導(dǎo)IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.4 IFN-α and TNF-α mRNA levels in PRRSV infected cells pretreated with FcγRⅢ-specific IgG
圖5 選擇性激活FcγRⅢ后PRRSV拷貝數(shù)Fig.5 Copies of viral replication in porcine PAM cells,pretreated with FcγRⅢ-specific IgG
本試驗主要是用已經(jīng)建立的實時熒光定量PCR方法檢測不同方法處理的PAM細(xì)胞中IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化和PRRSV拷貝數(shù)的變化,來探討FcγRⅢ介導(dǎo)PRRSV誘導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)。FcγRⅢ(CD16)為中等親和力的抗體結(jié)合受體,含有2個Ig樣胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域,是唯一在NK細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體。它由兩個不同的基因編碼,它們在不同細(xì)胞類型上選擇性表達(dá)。在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞表面上表達(dá)的是一種被稱為FcγRⅢA的跨膜糖蛋白,另一個FcγRⅢ基因編碼表達(dá)糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl inositol,GPI)連接的蛋白質(zhì),稱為FcγRⅢB,它只在嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)。主要是過FcR-γ鏈,以及與其相連的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif,ITAM)的相互作用觸發(fā)細(xì)胞活化,F(xiàn)cγRⅢ能夠觸發(fā)多種免疫反應(yīng),包括清除免疫復(fù)合物、吞噬作用、ADCC、釋放炎性介質(zhì)、增強(qiáng)抗原提呈等作用。
PRRSV感染PAM細(xì)胞后,IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在PRRSV感染PAM細(xì)胞12、24 h后與對照細(xì)胞相比顯著上調(diào),感染36、48、60 h后 IFN-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平下降;TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在PRRSV感染12、24、36、48、60、72 h 后均高于對照細(xì)胞組。有報道顯示,PRRSV通過阻礙 ISGF 3的核轉(zhuǎn)位阻止Ⅰ型干擾素的活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,抑制IFN-α的產(chǎn)生[24],但是不同的毒株對IFN-α敏感性和誘導(dǎo)IFN-α的能力不同;而有研究顯示PRRSV誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生遲緩或者下調(diào),我們的研究表明PRRSV感染前期IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比上調(diào)1.35~1.46倍,感染后期 IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)0.70~0.78倍;而TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在72 h內(nèi)上調(diào)1.15~2.49倍。原因可能是不同的分離株對IFN-α、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平的影響不同,而實驗過程中所選擇的觀察時間段也會影響實驗結(jié)果。本試驗表明,選擇性激活 FcγRⅢ后,IFN-α、TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在72 h內(nèi)與對照細(xì)胞相比均顯著下調(diào);同時選擇性激活 FcγRⅢ后接種 PRRSV,72 h內(nèi)與PRRSV對照組相比 IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平也顯著下調(diào)。而我們之前的研究顯示選擇性激活抑制性受體FcγRⅡB在PRRSV感染后能夠顯著提高抗病毒因子的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平[25];Thomas等[25]研究顯示巴西利什曼原蟲感染FcγRⅢ缺陷小鼠后,發(fā)現(xiàn)FcγRⅢ缺陷小鼠能夠抵抗巴西利什曼原蟲感染,同時 IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào),而 IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。由此推測選擇性激活 FcγRⅢ能夠抑制宿主細(xì)胞的先天性免疫,F(xiàn)cγRⅢ能夠抑制PRRSV感染后的抗病毒免疫反應(yīng)。有資料顯示巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用主要由FcγR介導(dǎo),而缺失 FcγR可致巨噬細(xì)胞的吞噬作用喪失[26]。由此我們推測選擇性激活 PAM細(xì)胞的FcγRⅢ后,增強(qiáng)PAM細(xì)胞吞噬PRRSV的能力,促進(jìn)病毒進(jìn)入PAM細(xì)胞,加強(qiáng)PRRSV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。本試驗證明,選擇性激活FcγRⅢ后再感染PRRSV,72 h內(nèi)PRRSV的拷貝數(shù)與病毒對照組相比顯著提高,這可能是由于選擇性激活 FcγRⅢ后,能抑制PAM細(xì)胞中抗病毒因子水平,同時促進(jìn)PAM細(xì)胞對PRRSV吞噬作用所致。
實驗結(jié)果表明,PRRSV感染PAM細(xì)胞后48 h病毒的拷貝數(shù)最高,隨后逐漸下降,PRRSV能夠抑制IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平,誘導(dǎo)增強(qiáng) TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平;FcγRⅢ能夠抑制 PRRSV感染后的抗病毒免疫反應(yīng)并增強(qiáng)PRRSV在PAM細(xì)胞中的復(fù)制。本次研究探討了FcγRⅢ介導(dǎo)PRRSV的免疫抑制反應(yīng),為研究FcγR途徑介導(dǎo)PRRSV增強(qiáng)病毒感染的作用機(jī)制提供了依據(jù)。
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