李娜娜 王冬梅 杜東穎 秦運(yùn)杰 夏平安 楊明凡 崔保安

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院獸醫(yī)微生物實驗室，鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS)是二十世紀(jì)八十年代末發(fā)現(xiàn)的一種高度傳染性疾病，引起妊娠母豬的流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎等繁殖障礙以及各年齡段豬的呼吸道疾?。?］。PRRSV屬于動脈炎病毒科、動脈炎病毒屬，單股正鏈RNA病毒，大小約15 kb，編碼9個開放閱讀框［2］。PRRSV有嚴(yán)格的組織嗜性，只感染血液中PAM(Pulmonary alveolar macrophages)細(xì)胞和單核細(xì)胞，能夠在宿主體內(nèi)自主復(fù)制［3-6］。在體外可感染非洲綠猴腎細(xì)胞系如Marc-145細(xì)胞、骨髓來源樹突狀細(xì)胞(Bone marrow-derived dendritic cells，BMDC)、單核細(xì)胞源性巨噬細(xì)胞(Monocyte-derived macrophages，MDM)［7-9］。巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，能夠產(chǎn)生大量的細(xì)胞因子。許多研究資料表明，PRRSV感染宿主后抗病毒細(xì)胞因子水平下調(diào)［8，10］。豬感染 PRRSV后機(jī)體快速調(diào)動其體液免疫，但是早期亞中和抗體和非中和抗體通過ADE(Antibody-dependent enhancement)作用嚴(yán)重影響PRRS的發(fā)展，使病毒更容易通過IgG Fc受體(FcγR)介導(dǎo)的細(xì)胞吞噬作用被單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞吸附和內(nèi)吞，從而進(jìn)入宿主細(xì)胞內(nèi)［11-15］。

IgG Fc受體屬于IgG基因超家族成員，是免疫應(yīng)答中重要的膜性調(diào)節(jié)分子，主要表達(dá)于NK細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等，主要是通過與配體結(jié)合來發(fā)揮某些重要的生物學(xué)效應(yīng)，例如參與抗原的處理和遞呈，抗體依賴性細(xì)胞毒作用(Antibody dependent cytotoxicity ，ADCC)，細(xì)胞因子的產(chǎn)生，免疫應(yīng)答反應(yīng)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等免疫識別與清除作用［16］。根據(jù)配體的特異性可分為 IgG受體(FcγR)、IgA 受體(FcaR)、IgE 受體(FcεR)、IgM 受體(FcμR)和 IgD 受體(FcδR)。目前鑒定的 FcγR有 FcγRⅠ、FcγRⅡ、FcγRⅢ、boFcγRⅡ和 moFcγRⅣ等五個亞類［17］。其中 FcγRⅢ(CD16)含有 2個 Ig樣胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域，為中低親和力受體，是唯一在NK細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體［18］。本實驗室成功地從豬PAM細(xì)胞克隆出FcγRⅢ(CD16)并制備其多克隆抗體［19］，為本實驗奠定基礎(chǔ)。

本試驗通過研究FcγRⅢ的選擇性激活對在宿主細(xì)胞的抗病毒因子水平的影響，來研究在PRRSV感染過程中的FcγRⅢ介導(dǎo)的免疫反應(yīng)作用。

1 材料與方法

1.1 毒株、抗體與實驗動物 PRRSV Hn-1/06株(TCID50為10－4.6/0.1 ml)為本實驗室分離并保存;純化鼠抗豬 FcγRⅢ IgG(ELISA檢測抗體效價1∶12 800)由本實驗室制備并保存;PRRSV抗原、抗體均為陰性的20日齡健康大白仔豬，購自鄭州某豬場。

1.2 主要試劑 Reverse Transcriptase M-MLV、dNTPs、Ribonuclease Inhibitor、Trizol、SYBR Premix Ex Taq等購自TaKaRa公司;LPS購于Sigma公司;RPMI1640培養(yǎng)基干粉購自Gibco公司;新生牛血清為杭州四季青生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 PAM細(xì)胞的制備 按照徐紅運(yùn)等［20］的方法獲取PAM細(xì)胞，重懸于10%血清的RPMI1640中。調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106個/ml，加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板，0.5 ml/孔，置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)約6 h，棄去未貼壁的細(xì)胞，用 PBS液洗板一次，加入10%血清 RPMI1640營養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2溫箱培養(yǎng)。

1.3.2 PRRSV感染PAM試驗 將含有200個TCID50的PRRSV 接種 PAM 細(xì)胞，感染12、24、36、48、60、72 h 后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用段二珍［21］建立的Real-time qPCR方法檢測感染不同時間段PAM細(xì)胞中PRRSV的拷貝數(shù)(絕對定量);用張宜娜［22］建立的Real-time qPCR方法檢測不同時間段PAM細(xì)胞中IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平(相對定量)。同時設(shè)對照細(xì)胞組。

1.3.3 LPS刺激PAM細(xì)胞試驗 將終濃度100 ng/ml LPS［23］接種 PAM 細(xì)胞，作用 12、24、36、48、60、72 h后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用張宜娜建立的Real-time qPCR方法分別檢測不同時間段PAM細(xì)胞中 IFN-α、TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.4 FcγRⅢ對PAM細(xì)胞中細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平影響試驗 將純化鼠抗豬FcγRⅢ IgG(550 μg/ml)接種到 PAM 細(xì)胞上，200 μl/孔，置 37℃、5%CO2條件下作用1 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去上清液。每孔加入 500 μl 10%血清 RPMI1640 營養(yǎng)液，12、24、36、48、60、72 h后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液，用張宜娜建立的Real-time qPCR方法檢測不同時間段PAM細(xì)胞中 IFN-α、TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。

1.3.5 FcγRⅢ的選擇性激活試驗 將純化鼠抗豬FcγRⅢ IgG(550 μg/ml)接種到 PAM 細(xì)胞上，200 μl/孔，置 37℃、5%CO2條件下作用 1 h，取出細(xì)胞培養(yǎng)板，棄去上清液。然后將含有200個TCID50的PRRSV接種處理的 PAM細(xì)胞上，感染 12、24、36、48、60、72 h 后分別收集細(xì)胞培養(yǎng)液，檢測方法同1.3.2。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理方法 每個檢測樣品做3個平行，絕對定量所得結(jié)果，即PRRSV拷貝數(shù)，用建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行計算。相對定量所得結(jié)果用2－ΔCT法進(jìn)行比較，即ΔCT=CT目的基因-CT持家基因。以 β-actin為持家基因。用 GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。

2 結(jié)果

2.1 PRRSV在PAM細(xì)胞中的增殖規(guī)律 如圖1所示PRRSV感染PAM細(xì)胞后，48 h PRRSV的拷貝數(shù)最高可達(dá)到1.34E+06，之后PRRSV的拷貝數(shù)下降。

2.2 PRRSV對PAM細(xì)胞中抗病毒細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響 應(yīng)用實時熒光定量PCR方法檢測PRRV、LPS誘導(dǎo)PAM細(xì)胞和未處理對照組PAM細(xì)胞在 12、24、36、48、60、72 h 后 IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化，確定PRRSV引起宿主細(xì)胞的先天抗病毒反應(yīng)。如圖2顯示，LPS處理組IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對照組細(xì)胞相比均上調(diào)。接種病毒組IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在PRRSV感染PAM細(xì)胞12、24 h后與對照組細(xì)胞相比顯著上調(diào)，分別上調(diào)1.46倍和1.35倍，感染36、48、60 h后 IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平下降，分別是其0.71倍、0.78倍、0.70倍、72 h后恢復(fù)對照組細(xì)胞水平。TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在 PRRSV 感染12、24、36、48、60、72 h后均高于對照組細(xì)胞，達(dá)1.15～2.49倍，在48 h后差異最大，達(dá)到2.49倍。

2.3 FcγRⅢ對PAM細(xì)胞中抗病毒細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響 為研究FcγRⅢ引起宿主細(xì)胞的先天抗病毒反應(yīng)，用純化的鼠抗豬FcγRⅢIgG選擇性激活 PAM 細(xì)胞 FcγRⅢ受體，在 12、24、36、48、60、72 h后檢測IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。如圖3 顯示，選擇性激活豬 FcγRⅢ后 IFN-α、TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在 12、24、36、48、60、72 h 均顯著低于對照組細(xì)胞，與對照組細(xì)胞相比，IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平是其0.21～0.26倍，在24 h最低;TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平是其0.15～0.31倍，在36 h最低，這些數(shù)據(jù)表明選擇性激活FcγRⅢ能夠抑制宿主細(xì)胞的先天性免疫。

2.4 選擇性激活FcγRⅢ后PRRSV對PAM細(xì)胞中抗病毒細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄水平的影響 鼠抗豬FcγRⅢIgG處理PAM細(xì)胞后接種PRRSV，在培養(yǎng)12、24、36、48、60、72 h后收集細(xì)胞，利用已經(jīng)建立實時熒光定量PCR方法檢測不同時間段PAM細(xì)胞IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平的變化。如圖4所示FcγRⅢIgG選擇性激活PAM后感染PRRSV，與對照組PRRSV感染PAM細(xì)胞組相比，IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12～72 h期間顯著下降，是其0.09～0.52倍;TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在12～72 h期間顯著下降，是其0.02～0.21倍。這些數(shù)據(jù)顯示豬FcγRⅢ介導(dǎo)PRRSV感染抑制宿主細(xì)胞抗病毒因子轉(zhuǎn)錄水平。

2.5 選擇性激活豬FcγRⅢ對PRRSV在PAM細(xì)胞中增殖的影響 為研究選擇性激活 FcγRⅢ對PRRSV增殖規(guī)律的影響，用純化鼠抗豬 FcγRⅢIgG 處理PAM細(xì)胞后接種PRRSV，在感染12、24、36、48、60、72 h后用已建立的Real-time qPCR方法檢測感染不同時間段PAM細(xì)胞中PRRSV的拷貝數(shù)。如圖5所示，選擇性激活 FcγRⅢ后 PAM細(xì)胞中的PRRSV的拷貝數(shù)與單純接毒的PAM細(xì)胞相比在12、24、36、48、60、72 h 顯著升高，高 3.74～ 148.93倍，72 h是最高，達(dá)到148.93倍。這些數(shù)據(jù)說明選擇性激活FcγRⅢ能夠增強(qiáng)PRRSV在PAM細(xì)胞中的復(fù)制水平。

圖1PAM細(xì)胞中PRRSV拷貝數(shù)Fig.1 Copies of viral replication in porcine PAM cells

圖2 PRRSV感染細(xì)胞、LPS處理細(xì)胞、健康細(xì)胞IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.2 IFN-α and TNF-α mRNA levels in PRRSV infected cells or LPS stimulated cells or mock normal cells

圖3 選擇性激活FcγRⅢ誘導(dǎo)PAM細(xì)胞IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.3 IFN-α and TNF-α mRNA levels in procine PAM cells pretreated with FcγRⅢ-specific IgG

圖4 選擇性激活FcγRⅢ處理PAM細(xì)胞后接種PRRSV誘導(dǎo)IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化Fig.4 IFN-α and TNF-α mRNA levels in PRRSV infected cells pretreated with FcγRⅢ-specific IgG

圖5 選擇性激活FcγRⅢ后PRRSV拷貝數(shù)Fig.5 Copies of viral replication in porcine PAM cells，pretreated with FcγRⅢ-specific IgG

3 討論

本試驗主要是用已經(jīng)建立的實時熒光定量PCR方法檢測不同方法處理的PAM細(xì)胞中IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平變化和PRRSV拷貝數(shù)的變化，來探討FcγRⅢ介導(dǎo)PRRSV誘導(dǎo)的免疫抑制反應(yīng)。FcγRⅢ(CD16)為中等親和力的抗體結(jié)合受體，含有2個Ig樣胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域，是唯一在NK細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)的Fc受體。它由兩個不同的基因編碼，它們在不同細(xì)胞類型上選擇性表達(dá)。在單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、NK細(xì)胞表面上表達(dá)的是一種被稱為FcγRⅢA的跨膜糖蛋白，另一個FcγRⅢ基因編碼表達(dá)糖基磷脂酰肌醇(Glycosylphosphatidyl inositol，GPI)連接的蛋白質(zhì)，稱為FcγRⅢB，它只在嗜中性粒細(xì)胞上表達(dá)。主要是過FcR-γ鏈，以及與其相連的免疫受體酪氨酸激活基序(Immunoreceptor tyrosine-based activation motif，ITAM)的相互作用觸發(fā)細(xì)胞活化，F(xiàn)cγRⅢ能夠觸發(fā)多種免疫反應(yīng)，包括清除免疫復(fù)合物、吞噬作用、ADCC、釋放炎性介質(zhì)、增強(qiáng)抗原提呈等作用。

PRRSV感染PAM細(xì)胞后，IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在PRRSV感染PAM細(xì)胞12、24 h后與對照細(xì)胞相比顯著上調(diào)，感染36、48、60 h后 IFN-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平下降;TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在PRRSV感染12、24、36、48、60、72 h 后均高于對照細(xì)胞組。有報道顯示，PRRSV通過阻礙 ISGF 3的核轉(zhuǎn)位阻止Ⅰ型干擾素的活化和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，抑制IFN-α的產(chǎn)生［24］，但是不同的毒株對IFN-α敏感性和誘導(dǎo)IFN-α的能力不同;而有研究顯示PRRSV誘導(dǎo)TNF-α產(chǎn)生遲緩或者下調(diào)，我們的研究表明PRRSV感染前期IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比上調(diào)1.35～1.46倍，感染后期 IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)0.70～0.78倍;而TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平在72 h內(nèi)上調(diào)1.15～2.49倍。原因可能是不同的分離株對IFN-α、TNF-α轉(zhuǎn)錄水平的影響不同，而實驗過程中所選擇的觀察時間段也會影響實驗結(jié)果。本試驗表明，選擇性激活 FcγRⅢ后，IFN-α、TNF-α mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在72 h內(nèi)與對照細(xì)胞相比均顯著下調(diào);同時選擇性激活 FcγRⅢ后接種 PRRSV，72 h內(nèi)與PRRSV對照組相比 IFN-α、TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平也顯著下調(diào)。而我們之前的研究顯示選擇性激活抑制性受體FcγRⅡB在PRRSV感染后能夠顯著提高抗病毒因子的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平［25］;Thomas等［25］研究顯示巴西利什曼原蟲感染FcγRⅢ缺陷小鼠后，發(fā)現(xiàn)FcγRⅢ缺陷小鼠能夠抵抗巴西利什曼原蟲感染，同時 IFN-γ mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)，而 IL-10 mRNA轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。由此推測選擇性激活 FcγRⅢ能夠抑制宿主細(xì)胞的先天性免疫，F(xiàn)cγRⅢ能夠抑制PRRSV感染后的抗病毒免疫反應(yīng)。有資料顯示巨噬細(xì)胞和嗜中性粒細(xì)胞的吞噬作用主要由FcγR介導(dǎo)，而缺失 FcγR可致巨噬細(xì)胞的吞噬作用喪失［26］。由此我們推測選擇性激活 PAM細(xì)胞的FcγRⅢ后，增強(qiáng)PAM細(xì)胞吞噬PRRSV的能力，促進(jìn)病毒進(jìn)入PAM細(xì)胞，加強(qiáng)PRRSV在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制。本試驗證明，選擇性激活FcγRⅢ后再感染PRRSV，72 h內(nèi)PRRSV的拷貝數(shù)與病毒對照組相比顯著提高，這可能是由于選擇性激活 FcγRⅢ后，能抑制PAM細(xì)胞中抗病毒因子水平，同時促進(jìn)PAM細(xì)胞對PRRSV吞噬作用所致。

實驗結(jié)果表明，PRRSV感染PAM細(xì)胞后48 h病毒的拷貝數(shù)最高，隨后逐漸下降，PRRSV能夠抑制IFN-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平，誘導(dǎo)增強(qiáng) TNF-α mRNA轉(zhuǎn)錄水平;FcγRⅢ能夠抑制 PRRSV感染后的抗病毒免疫反應(yīng)并增強(qiáng)PRRSV在PAM細(xì)胞中的復(fù)制。本次研究探討了FcγRⅢ介導(dǎo)PRRSV的免疫抑制反應(yīng)，為研究FcγR途徑介導(dǎo)PRRSV增強(qiáng)病毒感染的作用機(jī)制提供了依據(jù)。

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